Génération d’un vaccin multivalent à vésicules de la membrane externe

Prenons l’exemple de polyplexes de transfection contenant des plasmides cibles liés à un polymère. Les plasmides codent pour un antigène viral fusionné à un marqueur peptidique et à un marqueur d’affinité.

Incuber les polyplexes avec des cellules de mammifères, qui internalisent les polyplexes à l’intérieur des endosomes.

Le polymère induit la rupture des vésicules. Les plasmides libérés expriment l’antigène viral, qui est sécrété extracellulairement.

Récoltez le surnageant contenant l’antigène et les contaminants. Ajouter un agent concurrent à faible concentration.

Chargez-le sur une colonne de chromatographie d’affinité.

Les étiquettes d’affinité se lient à la résine de la colonne, immobilisant l’antigène, tandis que l’agent concurrent diminue la liaison non spécifique.

Faire couler l’agent concurrent à une faible concentration, en éliminant les contaminants faiblement liés.

Laver avec des concentrations croissantes d’agents concurrents pour déplacer les antigènes fortement liés, en les éluant.

Introduisez des vésicules de membrane externe bactériennes, ou OMV, avec une protéine de capture liée à la surface et incuberez.

Les marqueurs peptidiques d’antigène se lient aux protéines de capture, formant un vaccin OMV avec un affichage antigénique multivalent

Effectuez la purification OMV SpyCatcher. Commencez par centrifuger la solution bactérienne. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis concentrez-le à l’aide d’une colonne à fibres creuses. Filtrez le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre, puis centrifugez-le à 150 000 fois g à 4 degrés Celsius pendant deux heures à l’aide d’une ultracentrifugeuse, et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Suspendez à nouveau les précipitations avec du PBS et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.

Pour effectuer la transfection RBD-SpyTag, commencez par sélectionner un système d’expression eucaryote approprié et cultivez les cellules pendant la nuit à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius après la récupération. Ajoutez 20 microlitres HEK293F de solution cellulaire dans le compteur de cellules automatisé. Notez le nombre de cellules. Ajustez la concentration à 1 fois 10 à six cellules par millilitre, puis cultivez les cellules à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant 4 heures.

Filtrez le plasmide RBD-SpyTag à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre et ajoutez 300 microgrammes de plasmides dans le milieu de culture cellulaire jusqu’à ce que le volume final soit de 10 millilitres. Agitez pendant 10 secondes. Chauffer l’Île-du-Prince-Édouard à 65 degrés Celsius dans le bain-marie. Mélangez 0,7 millilitre d’IPE avec 9,3 millilitres de milieu de culture cellulaire et agitez par intermittence pendant 10 secondes.

Ajouter la solution plasmidique à la solution PEI. Secouez le mélange par intermittence pendant 10 secondes et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter le mélange à 280 millilitres de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 rotations par minute à 37 degrés Celsius pendant 5 jours.

Ensuite, effectuez la purification RBD-SpyTag. Commencez par centrifuger les cellules à 6 000 fois g à 25 degrés Celsius pendant 20 minutes. et à l’aide d’une pipette, recueillir le surnageant. Construisez la colonne avec 2 millilitres d’agarose nickel-NTA et lavez-la trois fois avec du PBS.

Ajoutez de l’imidazole dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 millimolaires et chargez le surnageant cellulaire. Ajouter 3 volumes de colonne de PBS contenant 20 millimolaires d’imidazole pour le lavage et recueillir la fraction de lavage. Eluté à gradient avec trois volumes de colonne de PBS contenant des concentrations faibles à élevées d’imidazole. Éluer deux fois pour chaque concentration.

Pour déterminer la concentration en protéines par la méthode BCA, diluer en série la solution protéique standard BSA de 2 à 0,0625 milligramme par millilitre. Diluez 10 fois l’OMV SpyCatcher et le RBD-SpyTag purifiés. Ensuite, mélangez les solutions de travail BCA A et B dans un rapport de 50 à 1. Ajouter la solution protéique diluée et mélanger avec la solution de travail BCA. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Mesurez l’absorbance à 562 nanomètres de chaque puits et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard.

Pour effectuer la bioconjugaison d’OMV SpyCatcher et de RBD-SpyTag, mélangez OMV SpyCatcher dans RBD-SpyTag dans PBS dans un rapport de 40 à 1. Tournez verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 rotations par minute à 4 degrés Celsius. Effectuez la purification de l’OMV RBD à l’aide d’une solution PBS en utilisant une procédure similaire à la purification OMV SpyCatcher.