Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

L’objectif global de cette procédure est de générer des progéniteurs d’interneurones corticaux dans des précurseurs d’interneurones post-mitotiques pour les cellules souches embryonnaires de souris en utilisant une méthode de corps embryoïde modifié en monocouche. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les sous-types d’interneurones corticaux atteignent leur destin individuel au cours du développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer efficacement des progéniteurs interneurones exprimant Nkx2.1, ainsi que des méthodes d’enrichissement pour les sous-groupes d’interneurones de la parvalbumine ou de la somatostatine.

Pour commencer cette procédure, placez des cellules nourricières de MEF inactives mitotiquement inactives dans un milieu MEF sur des plaques traitées pour la culture tissulaire. Attendez au moins 12 heures pour qu’ils s’installent dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avant de plaquer les CSEm. S’il n’est pas utilisé immédiatement, remplacez le support MEF tous les trois jours.

Ensuite, ajoutez des CSEm contenant un facteur inhibiteur de la leucémie de souris aux plaques MEF. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Passer les mESC à l’aide de trypsine-EDTA une fois que la boîte devient confluente à 70 à 80 %, et maintenir les mESC sur une couche d’alimentation MEF dans un milieu mESC pour maintenir la pluripotence.

Avant de commencer la différenciation, passez les cellules au moins une fois sur des plaques recouvertes de gélatine sans MEF pour les diluer. Pour ce faire, préparez des plaques recouvertes de gélatine en ajoutant 0,1 % de gélatine et de PBS avec du calcium et du magnésium dans une boîte traitée par culture tissulaire et incubez à 37 degrés Celsius pendant au moins 1 heure. Plaquez 1,5 à deux fois 10 à la sixième cellule sur chaque plaque de dix centimètres et laissez-les se dilater pendant deux jours avant de commencer la différenciation.

À DD0, après que les CSEm se sont développées sur les plaques recouvertes de gélatine pendant deux jours, aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, ajoutez suffisamment de trypsine-EDTA pour couvrir la surface des plaques. Et remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant quatre minutes.

Après quatre minutes, tremper la trypsine-EDTA en utilisant deux fois son volume de milieu mESC. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée et centrifugez-les à 200 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le tube et aspirez le média sans déranger la pastille.

Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de média KSR-N2. Par la suite, mesurez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Commencez à cultiver les cellules sous forme de corps embryoïdes en ajoutant 75 000 cellules par millilitre dans des milieux KSR-N2 dans les boîtes de culture de tissus non adhérents.

Et les incuber à 37 degrés Celsius. À DD1, préparez-vous à l’atterrissage cellulaire en enrobant les boîtes traitées à la culture tissulaire de poly-L-lysine pendant au moins une heure ou toute la nuit à 37 degrés Celsius. Sur DD2, aspirez la poly-L-lysine et enduisez les plaques de laminine pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Sur DD3, avant de commencer la dissociation de l’EB, aspirez la laminine et laissez les plaques sécher complètement dans un capuchon de culture tissulaire. Ensuite, transférez les EB avec le média dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant trois à quatre minutes à 15 fois g ou jusqu’à ce que les EB aient granulé. Aspirez le milieu et ajoutez trois millilitres de solution de détachement cellulaire contenant de la DNase.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Agitez doucement le tube toutes les trois minutes pour aider à la dissociation de l’EB. Une fois que les EB ne sont plus visibles, ou que 15 minutes se sont écoulées, ajoutez six millilitres de KSR-N2 contenant de la DNase, et centrifugez pendant cinq minutes à 200 fois g.

Ensuite, placez les cellules de KSR-N2 contenant du LDN193189, XAV939, et l’inhibiteur de ROCK, Y27632, à 4,5 à cinq fois dix puissance quatre cellules par centimètre carré. Sur DD5, changez de support avec KSR-N2 contenant FGF2, IGF1 et SSH. Ensuite, préparez les plaques de culture tissulaire pour le replacage le jour 8, en suivant les instructions décrites dans les procédures pour DD1 et DD2.

Sur DD7, remplacez le support par KSR-N2 contenant FGF2, IGF1 et SHH. Sur DD8, replaquez les cellules en les détachant des plaques avec de la trypsine-EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Trempe de la trypsine-EDTA en utilisant deux fois son volume avec du KSR-N2.

Et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes. Filtrez les cellules à travers un tube filtrant de 40 microns pour éliminer les grumeaux. Ensuite, replaquez les cellules à 250 000 cellules par centimètre carré dans du N2-KSR contenant FGF2, IGF1 et Y27632 avec SHH.

Sur DD10, remplacez le support par KSR-N2 contenant SHH. Lavez les cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium, et ajoutez un réactif de dissociation cellulaire préchauffé, non contenant de la trypsine, contenant de la DNase aux cellules. Placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes, ou jusqu’à ce que les cellules se soient détachées.

Ensuite, tapotez doucement les plaques toutes les cinq minutes pour faciliter la dissociation. Sur DD5, remplacez le support par KSR-N2 contenant FGF2 et IGF1. Ensuite, préparez les plaques de culture tissulaire pour le replacage sur DD8.

Sur DD7, remplacez le support par KSR-N2 contenant FGF2 et IGF1. Sur DD8, replaquez les cellules avec un agoniste lissé et ajoutez un inhibiteur de PKC atypique. Sur DD10, remplacez le support par KSR-N2 contenant aPKCi.

Sur DD11, détachez les cellules des plaques pour FACS. Si les cellules n’ont pas été détachées pour le FACS sur DD11, changez de support sur DD12 avec KSR-N2 contenant aPKCi. Sur DD14, remplacez le support par KSR-N2 contenant aPKCi.

Et sur DD16, changez de support avec KSR-N2 contenant aPKCi. Ensuite, sur DD17, collectez les cellules positives Nkx-2.1 :mCherry. Voici les images représentatives de l’immunocoloration pour Nkx2.1, Nkx2.1 :mCherry et Lhx6 :GFP à partir d’une culture de différenciation du jour 12

Notez que ces images se chevauchent dans le même champ de vision. Ce graphique montre la quantification du pourcentage moyen de noyaux positifs au DAPI qui expriment Nkx2.1 à DD12 en culture. Et il s’agit d’un graphique FACS représentatif, démontrant les quatre populations cellulaires différentes qui peuvent être isolées à l’aide de notre ligne mESC à double rapporteur.

Notez que mCherry se trouve sur l’axe des x et que GFP se trouve sur l’axe des y. Ainsi, la case en haut à droite représente les cellules qui sont mCherry-GFP double positif. Voici l’évolution temporelle de l’induction de Nkx2.1 :mCherry et Lhx6 :GFP de DD6 à 16, exprimée en pourcentage de cellules en culture qui expriment soit mCherry uniquement, soit GFP uniquement, soit mCherry-GFP co-exprimant.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété dans les 17 jours du début à la fin, s’il est exécuté correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours commencer avec des cellules souches pleuripotentes, indifférenciées et d’apparence saine. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la transplantation dans le néocortex de souris néonatale ou adulte, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la détermination du destin de l’interneurone ou l’effet de la transplantation d’interneurones sur la fonction du circuit et le comportement animal.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences du développement pour explorer les facteurs déterminant la détermination du destin de l’interneurone chez la souris et, par extension, chez les patients atteints de troubles liés à l’interneurone. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dériver les progéniteurs exprimant Nkx2.1 et leur progéniture post-mitotique à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.