Name: Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux. Cette méthode permet de générer efficacement des progéniteurs exprimant Nkx2.1 pour étudier le développement neuronal.

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Nous sommes reconnaissants à Qing Xu pour développer le Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP double journaliste mESC ligne ainsi que Jennifer Tyson, Asif Maroof et Tim Petros pour leur premiers travaux sur les façons d’élaborer ce protocole. Nous remercions également le noyau de cytométrie de flux CHOP pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 MH066912 (SA) et F30 MH105045-02 (DT).

Remarque : La ligne de mESC double journaliste décrite dans le présent protocole est disponible sur demande (sande@mail.med.upenn.edu).
1. préparation de support
NOTE : Réchauffer tous les médias à 37 ° C avant de l’utiliser en culture cellulaire.
<ol><li>
Médias de fibroblastes embryonnaires souris (MEF) (pour préparer 500 mL)
	<ol>
<li>Ajouter sérum foetal 50 mL (SVF) à 449 mL de milieu (DMEM modifié de l’aigle) de Dulbecco et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.</li>
		<li>Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C jusqu'à 1 mois ou partie aliquote et magasin à ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Médias de N2 (pour préparer 500 mL)
	<ol>
<li>Ajouter 5 mL L-alanine-L-glutamine (x 100) et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 489,5 mL DMEM : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F-12) et filtrer sur une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.</li>
		<li>Ajouter agent antimicrobien de 1 mL (50 mg/mL) et 5 mL N2 Supplément-B après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant environ 1 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Milieu sans sérum croissance (KSR) (pour préparer 500 mL)
	<ol>
<li>Ajouter 75 mL supplément moyen sans sérum, 5 mL L-glutamine (x 100), 5 mL MEM (MEM-NEAA) des acides aminés Non essentiels (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.</li>
		<li>Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Stocker les médias à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Médias de cellules souches embryonnaires de souris (pour préparer 500 mL)
	<ol>
<li>Ajouter catégorie de cellules souches 75 mL FBS, 5 mL MEM-NEAA (x 100), 5 mL L-glutamine (x 100), et 500 µL 2-mercaptoéthanol (55 mM) à 413,5 mL non-glutamine contenant DMEM et filtrer à travers une unité de filtration 500 mL 0,22 µm pore.</li>
		<li>Ajouter 1 mL antimicrobial agent (50 mg/mL) après filtration. Entreposer les médias à 4 ° C à l’obscurité pendant jusqu'à un mois ou partie aliquote et stocker à ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. culture mESCs
<ol><li>Plaque des cellules nourricières MEF mitotically inactifs dans les médias sur des plaques de culture de tissus traitée à 3-4 x 104 cellules/cm2MEF. Laissez au moins 12 heures pour eux de s’installer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 avant les mESCs de placage. Si ne pas utilisée immédiatement, remplacer les médias MEF tous les 3 jours. Disposer de MEFs si ne pas utilisé dans les 7 jours du bordé.</li>
	<li>Ajouter mESCs (gamme de densité de 1-4 x 104 cellules/cm2) aux plaques de MEF dans mESC milieux contenant du facteur inhibiteur de leucémie de souris (mLIF) (1 000 U/mL). Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.</li>
	<li>Passage de mESCs à l’aide de la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) (1:5-1:10) une fois que le plat devient ~ confluente de 70 à 80 % ou si les colonies commencent à toucher. En général, cela se produit tous les 2 jours, mais peut prendre jusqu'à 4 ou 5 jours selon la densité des ensemencements initiaux.</li>
	<li>Maintenir les mESCs sur une couche de conducteur MEF dans mESC moyen de garder la pluripotence.</li>
	<li>
Avant de commencer la différenciation, le passage des cellules au moins une fois sur des plaques de gélatine enduit sans MEFs diluer sur les MEFs.
	<ol>
<li>Préparer des plaques de gélatine enduit en ajoutant 0,1 % gélatine dans saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2 +/Mg2 + pour un plat de culture de tissus traité et laissant à 37 ° C pendant au moins 1 h. plaque de 1,5 à 2 x 106 cellules/10 plaque de cm (2,7 à 3,6 x 104 cellules/cm2) et laissez les cellules afin d’élargir pour 2 jours avant le début de la différenciation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. différencier les mESCs vers MGE-comme progéniteurs télencéphaliques
<ol><li>
Jour de différenciation (DD) 0 = « float cellules »
	<ol>
<li>Après que les mESCs ont cultivé sur des plaques de gélatine couché pendant 2 jours, aspirer les médias et laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter suffisamment la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pour couvrir la surface de la plaque (en général 4 mL trypsine-EDTA pour un plat de culture de tissu de 10 cm) et remettre les cellules dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 4 min.</li>
		<li>Après 4 min, étancher la trypsine-EDTA à l’aide de 2 fois le volume avec les médias de la mescaline. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Après 5 min, retirez le tube et aspirer les médias sans déranger le culot. Resuspendre le culot dans 1 mL KSR:N2 media (1:1) contenant l’inhibiteur BMP LDN-193189 (250 nM) et l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 (10 µM).</li>
		<li>Mesurer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées. Démarrer les cellules en croissance comme corps embryoïdes (EBs) en ajoutant 75 000 cellules/mL dans les médias de la KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 (250 nM) et XAV-939 (10 µM) dans les plats de culture de tissus non adhérents. Incuber les cellules à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD1, préparer pour la cellule « atterrissage » par revêtement tissu traité Pétri avec poly-L-lysine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) du jour au lendemain (O/N) à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative ou pendant au moins 1 h.</li>
	<li>DD2, aspirer la poly-L-lysine et enduire les plaques de laminine (10 µg/mL dans du PBS avec Ca2 +/Mg2 +) O/N à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative. Remarque : O/N est optimale, aussi peu que 2 h peut être suffisante. Si les plaques ne sont pas utilisés par le lendemain, aspirer la laminine, de remplacer avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.</li>
	<li>
DD3 (« terre de cellules »)
	<ol>
<li>Avant de commencer la dissociation EB, aspirer la laminine et laisser les plaques à sécher sous une hotte de culture de tissus. Ne pas utiliser de plaques qui apparaissent brillantes ou visiblement humide. Transférer l’EBs avec les médias dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 3-4 min à 15 x g, ou jusqu'à ce que l’EBs ont granulée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirer les médias et ajouter 3 mL de solution de détachement de cellules contenant la DNase (2 U/mL) et incuber à 37 ° C avec une humidité relative ≥ 95 % et 5 % CO2 pendant 15 min. balayer doucement le tube toutes les 3 min pour aider à la dissociation de l’EB.</li>
	<li>Une fois que l’EBs ne sont plus visibles ou 15 minutes se sont écoulées, ajoutez 6 mL KSR:N2 (1:1) contenant la DNase (1 U/mL) et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.</li>
	<li>Les cellules de KSR:N2 (1:1) contenant LDN-193189 sur plaque (250 nM), XAV-939 (10 µM) et l’inhibiteur ROCK Y-27632 (10 µM) à 4,5 à 5 x 104 cellules/cm2.</li>
</ol>4. enrichissement personnel SST protocole : « DD12 GFP haute Sonic Hedgehog (SHH) » (suite de l’étape 3,7)
<ol><li>Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Préparer la modification des plaques le jour 8 (étape 4.4) plaques de culture de tissu en suivant les instructions décrites aux étapes 3.2-3.3.</li>
	<li>Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Sur DD8, re-plaque les cellules. NOTE : Bien que cette étape n’est pas essentielle, ré-ensemencement des cellules peut réduire types cellulaires début dissociés, indésirables. Modification des plaques aussi rompt les boules des cellules qui compliquent l’analyse immunohistochimique en aval et augmente l’efficacité des FACS aux moments plus tard.<ol>
<li>Pour re-plaque de cellules, de détacher les cellules de la plaque avec la trypsine-EDTA (0,05 % trypsine) pendant 5 min à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2. Étancher la trypsine-EDTA avec 2 fois le volume de KSR:N2, et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. filtrer les cellules à travers un tube de filtre de 40 µm pour éliminer tout amas. Re-plaque les cellules à 250 000 cellules/cm2 à N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) et Y-27632 (10 µM) avec SHH (50 ng/mL). Remarque : Si au lieu de cela, la décision est prise ne pas à re-plaque les cellules sur DD8, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL) tous les 2 jours de DD7 à DD12 et continuer à ajouter des IGF-1 (20 ng/mL) et FGF-2 (10 ng/mL) jusqu'à DD9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Sur DD12, pour obtenir des cellules qui sont enrichis pour les sous-types de SST, utilisez FACS pour isoler Lhx6::GFP-exprimant seulement les cellules.
	<ol>
<li>Pour détacher les cellules, utilisez un réactif de dissociation cellulaire contenant non-trypsine plutôt que la trypsine-EDTA. Laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca2 +/Mg2 +. Ajouter pré chauffé non-trypsine contenant la dissociation cellulaire réactif contenant DNase (2 U/mL) pour les cellules. Placez-les dans l’incubateur à 37 ° C avec ≥ 95 % d’humidité relative et de 5 % de CO2 pendant 10 à 30 min ou jusqu'à ce que les cellules ont détaché. Secouer doucement les plaques toutes les 5 min pour la dissociation de l’aide. Remarque : Pour les cultures DD11-12, seulement 10-15 min peut être nécessaire. Pour les cultures DD15-16, 30 min ou plus peuvent être requis pour une dissociation complète.</li>
		<li>Une fois que les cellules ont complètement levées au large de la plaque, procéder à l’isolement de FACS en utilisant les protocoles standards ou utiliser les cellules dans d’autres analyses en aval.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV-enrichir protocole : « DD11/DD17 mCherry + aPKCi » (suite de l’étape 3,7)
<ol><li>Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Préparer des plaques de culture de tissus pour ré-ensemencement sur DD8 (étape 4.4) en utilisant les instructions décrites dans les étapes 3.2-3.3.</li>
	<li>Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Sur DD8, re-plaque les cellules comme indiqué au point 4.4, avec les exceptions suivantes : lorsque la modification des plaques les cellules, remplacez SHH lissé agoniste (SAG ; 30 nM) et ajouter des inhibiteur de PKC atypique (aPKCi ; 2 µM). Pris ensemble, les médias re-électrodéposition est maintenant N2/KSR (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) et aPKCi (2 µM).</li>
	<li>Sur DD10, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM).</li>
	<li>
DD11 Remarque : À ce stade, les cellules Nkx2.1::mCherry+ sont enrichis pour devenir PV CIns.<ol>
<li>Détacher les cellules de la plaque des FACS en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6. Si la décision est prise à prélever des cellules Nkx2.1::mCherry+ à une date ultérieure de la différenciation, ignorez cette étape.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sur DD12, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD14, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD16, changer les médias avec KSR:N2 contenant les aPKCi (2 µM). Sur DD17, recueillir les cellules Nkx2.1::mCherry+ en utilisant le même protocole décrit à l’étape 4.6.</li>
</ol>6. PV-enrichir protocole : « DD17 mCherry Low SHH » (suite de l’étape 3,7)
<ol><li>Sur DD5, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL). Sur DD7, changer les médias avec KSR:N2 (1:1) contenant du FGF-2 (10 ng/mL) et d’IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
Sur DD9, changer les médias avec KSR:N2 (1:1). Partir de ce moment, aucun facteur de croissance supplémentaires ne sont nécessaires.
	<ol>
<li>Continuer à changer les médias tous les 2 jours jusqu'à la récolte des cellules sur DD17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+naive-like+human+pluripotent+stem+cells+based+on+HERVH+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression.</a> Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li>
<li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que cette méthode est très efficace pour le patterning mESCs dérivé de J1 (CPCR-1010), nous avons connu un succès variable avec d’autres lignes de la mescaline et isolats clonales. Par exemple, Foxg1::venus mESCs (dérivés EB3 ; Danjo et al. 13) répondent mal au présent protocole et l’induction de la Foxg1 par DD12 est typiquement sur l’ordre de 1 à 2 %. Pour des raisons que nous ne comprenons pas entièrement, clone de journaliste double un autre Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP (appelé JQ5...

Chez les souris et les humains, environ la moitié des interneurones inhibiteurs tout corticales (CIns) sont créés dans une structure sous-corticale transitoire appelée l’éminence ganglionnaire médial (MGE), où les progéniteurs neuroépithéliales CIns et autres neuronales et gliales sous-groupes d’exprimer le facteur de transcription Nkx2.11,2. Sous-groupes de CIn ou sous-types sont définis par intersection morphologiques, neurochimiques, électrophysiologique et connectivité caractéristiques3,4. Les CIns MGE-dérivés peuvent être regroupés en sous-groupes pour la plupart non-cumul basé sur leur expression de PV ou de SST, l’expression de qui est en corrélation avec notamment électrophysiologiques et connectivité tendances5. Dysfonctionnement des interneurones, surtout dans le sous-groupe de PV, a été impliqué dans plusieurs neuropsychiatriques troubles et maladies6,7. L’objectif général de cette méthode est de produire des cellules souches dérivées de cellules souches mitotiques et migrateurs précurseurs enrichis pour PV ou SST CIn sort pour étudier la biologie des interneurones corticaux et pour utilisation dans les thérapies à base cellulaire.
Nous avons développé une méthode évolutive et très efficace pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de mESCs. À l’aide d’un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP double journaliste mESC line8, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolées par l’intermédiaire de FACS et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. En manipulant un certain nombre de voies de signalisation, de la durée de la culture et le mode de la neurogenèse, nous pouvons obtenir des millions de précurseurs interneurone fluorescent étiquetés convenant à une multitude d’applications en aval.
Bien que plusieurs autres méthodes existent pour générer des progéniteurs MGE-like du mESCs9,10,11,12,13,14, notre méthode, qui repose sur la voie Wnt antagoniste de XAV-939, est particulièrement efficace de générer des Foxg1/Nkx2.1 exprimant des progéniteurs télencéphaliques. En outre, la possibilité de sélectionner des progéniteurs interneurone ou leur progéniture exprimant le Lhx6 post-mitotiques via notre système de double Rapporteur, améliore grandement la capacité de générer des cellules souches distinctes et leur progéniture.

<table><tbody><tr><td>Système de filtre sous vide pour bouteille</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Tube à essai avec filtre cellulaire Snap Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 flacon de 7M MEF suffit pour quatre plaques TC de 10 cm. Références : 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Aussi connu comme agent antimicrobien. Ne filtrez pas avec un média de base - ajoutez-le après la filtration. Références : 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Ne pas filtrer avec le média de base -- ajouter après filtration</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Également connu sous le nom de L-alanine-L-glutamine. Références : 9,11,38,39</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Aussi connu sous le nom de supplément moyen sans sérum. Références : 9,11</td></tr><tr><td>L-glutamine (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>Aussi connu sous le nom de DMEM non contenant de la glutamine. Références : 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Aussi connu sous le nom de FBS de qualité cellule souches. Références : 9,11</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri traitée pour culture tissulaire (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri stérile non adhérente (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Ne pas congeler, conserver à 4'C. Références : 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0.1 % Gelatin Solution</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>également connu sous le nom de réactif de dissociation cellulaire sans trypsine. Références : 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Remettre en suspension dans DMSO et stocker à -80'C dans les aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td> Remettre <td>en suspension dans DMSO et stocker à -80'C dans les aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Remise en suspension dans PBS avec 0,1 % BSA et stockage à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td>Remettre en suspension dans le PBS avec 0,1 % de BSA et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Remettre en suspension dans le DMSO et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>Agoniste lissé (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>Remettre en suspension dans H20 et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Remettre en suspension dans le PBS avec 0,1 % BSA et stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr><tr><td>PKC&zeta ; Inhibiteur de pseudosubstrat, EMD myristoylé</td><td>Millipore</td><td>539624</td><td>Se remettre en suspension dans H20 et se stocker à -80'C dans des aliquotes à usage unique</td></tr></tbody></table>

différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Les corticales interneurones GABAergiques sont une population hétérogène de cellules qui jouent un rôle crucial en réglementant la production de neurones pyramidaux excitatrices mais aussi de synchroniser les sorties des ensembles de neurones pyramidaux. Les déficits en fonction d’interneurones ont été impliqués dans une variété de troubles neuropsychiatriques, y compris la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La dérivation des interneurones corticaux de cellules souches embryonnaires permet non seulement pour l’étude de leur développement et leur fonction, mais donne un aperçu sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie des affections interneurones corticale. Interneurones ont également la capacité remarquable de survivre, migrer et intégrer dans hôte des circuits corticaux après la transplantation, rendant les candidats idéaux pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Nous présentons ici une méthode monocouche-à-corps embryoïdes évolutive, hautement efficace, mis à jour le pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). En utilisant une ligne de mESC journaliste double Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolé par cellule activée par fluorescence triant (FACS) et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. Nous fournissons également des méthodes pour enrichir pour la parvalbumine (PV) ou de la somatostatine sous-groupes d’interneurones (SST), qui peut être utile pour l’étude des aspects de la détermination du sort ou pour une utilisation dans des applications thérapeutiques qui pourraient bénéficier d’interneurones enrichie en sous-groupe transplantations d’organes.

Le protocole décrit dans le présent document est une version modifiée de nos protocoles publiés15,16,17 et a été optimisé pour une utilisation avec notre gamme de double-journaliste mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. En ajoutant l’inhibiteur de la voie Wnt XAV-939 du DD0-5, combiné avec la modification des plaques à DD8, nous obtenons robuste Nkx2.1 induction, dans lequel plus de 50 % de tous les no...

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des progéniteurs d’interneurones corticaux dans des précurseurs d’interneurones post-mitotiques pour les cellules souches embryonnaires de souris en utilisant une méthode de corps embryoïde modifié en monocouche. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les sous-types d’interneurones corticaux atteignent leur destin individuel au cours du développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer efficacement des progéniteurs interneurones exprimant Nkx2.1, ainsi que des méthodes d’enrichissement pour les sous-groupes d’interneurones de la parvalbumine ou de la somatostatine.Pour commencer cette procédure, placez des cellules nourricières de MEF inactives mitotiquement inactives dans un milieu MEF sur des plaques traitées pour la culture tissulaire. Attendez au moins 12 heures pour qu’ils s’installent dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avant de plaquer les CSEm. S’il n’est pas utilisé immédiatement, remplacez le support MEF tous les trois jours.Ensuite, ajoutez des CSEm contenant un facteur inhibiteur de

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Cette vidéo décrit la méthode utilisée pour l'isolement de neuroprecursors du cortex en développement de souris embryonnaires. La procédure pour la suppression des embryons dans l'utérus, la dissection du tissu cortical, et digérant le cortex cérébral est démontré isolés.

Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

Nous décrivons une molécule à base de petites protocole pour la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ce protocole génère Olig2 + NG2 + OPC avec un rendement élevé de 30 jours de différenciation. Nous décrivons également une méthode pour générer des "dopage" OPC qui peut tirer des potentiels d'action.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l'efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l'expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d'immunohistochimie.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

Cette vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, directement en cellules progénitrices neurales sans utiliser de cellules nourricières ou d’étapes intermédiaires. L’inhibition sélective des voies de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse ou BMP et du facteur de croissance transformant-bêta, ou TGF-β, conduit à la différenciation des CSEh en cellules progénitrices neurales, ou NPC.

Différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en progéniteurs neuraux

Cette vidéo présente une méthode pour générer des précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Le protocole implique la culture des cellules souches dans des milieux contenant des inhibiteurs de petites molécules spécifiques, qui facilitent la prolifération et l’agrégation des cellules souches en corps embryoïdes (EB). Par la suite, les EB sont dissociés avec des enzymes et plaqués sur des puits de plaque de culture recouverts de protéines...

Génération de précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Cette vidéo présente une méthode de génération in vitro de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de cellules souches embryonnaires de souris (mESC). Les CSEm sont cultivées en suspension pour former des corps embryoïdes (EB), qui sont ensuite guidés pour se différencier en NPC via un traitement à l’acide rétinoïque dans une culture adhérente.

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