L’imagerie calcique dans les neurones individuels régulant le comportement de ponte chez Caenorhabditis elegans

Prenez des vers transgéniques Caenorhabditis elegans poussant sur un bloc de gélose.

Ces vers expriment un indicateur de calcium, GCaMP5, et une protéine fluorescente insensible au calcium, mCherry, dans les neurones qui régulent le comportement de ponte.

Montez les vers sur une platine de microscope inversé.

Visualisez la fluorescence de GCaMP5 et mCherry.

Avant la libération de l’ovule, les neurones s’activent, ouvrant des canaux calciques voltage-dépendants, qui permettent l’afflux de calcium.

Le calcium intracellulaire se lie à GCaMP5, modifiant sa conformation et augmentant la fluorescence.

Pendant ce temps, la fluorescence de mCherry reste inchangée, ce qui permet le suivi du neurone.

Les neurones activés libèrent des neurotransmetteurs qui se lient à des récepteurs musculaires spécifiques, déclenchant la libération d’œufs.

Après la libération, les canaux calciques se ferment, réduisant l’afflux de calcium et la fluorescence de GCaMP5.

Ensuite, capturez des images en fond clair pour observer le mouvement des vers.

Une réduction des mouvements se produit en raison de contractions musculaires avant la libération de l’œuf.

Après la libération de l’œuf, les muscles se détendent, rétablissant un mouvement normal.

Mesurez le rapport de fluorescence de GCaMP5-mCherry et la vitesse du ver pour détecter les événements de libération des œufs.

Pour l’imagerie calcique ratiométrique, sous l’onglet Séquence, cliquez sur Démarrer pour commencer l’enregistrement et suivez le ver avec le joystick, en gardant les cellules et les synapses d’intérêt au centre du champ de vision. Au moment où l’enregistrement par fluorescence est lancé, les déclencheurs sont envoyés à la caméra à fond clair en attente et au contrôleur de scène, qui commencent à collecter les images synchronisées et la position de la platine.

Cliquez sur le bouton Statistiques dans la fenêtre de l’histogramme pour afficher les statistiques de pixels pour chaque canal. Ajustez la puissance de la LED pour assurer une fluorescence maximale d’un seul pixel mCherry à l’extrémité présynaptique supérieure ou égale à 8 000 comptes dans le canal rouge, ce qui donne une plage dynamique d’environ 12 bits au-dessus de l’arrière-plan. Les signaux rapporteurs calciques à l’extrémité présynaptique au repos, ou faible teneur en calcium, devraient être d’environ 2 500 comptes dans le canal vert.

Enregistrez le comportement jusqu’à ce qu’un état actif de ponte soit atteint. Ensuite, enregistrez un sous-ensemble de 10 minutes contenant 6 000 images avant et 6 001 images après le premier événement de ponte. Prenez soin de conserver le même sous-ensemble d’images en fond clair du comportement du ver et des points temporels de la position de l’étape x,y ou la synchronisation précise des flux de données sera perdue.