Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la régénération de la racine dorsale afin de découvrir un moyen d’induire une régénération significative après des lésions de la racine vertébrale. Ceci est accompli en créant d’abord une laminectomie hémiaire spinale qui expose la racine dorsale L cinq droite et permet de visualiser les axones positifs marqués YFP dans la moelle épinière et la racine dorsale. Ensuite, la racine dorsale L cinq est soigneusement écrasée pour assurer un saignement minimal.

Le site d’écrasement est ensuite imagé après l’écrasement pour vérifier la position de la racine dorsale blessée dans la lésion. Au cours de plusieurs points temporels, le site de la blessure et la zone d’entrée de la racine dorsale sont imagés pour déterminer la capacité des axones endommagés à se régénérer dans la moelle épinière. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que les axones en régénération sont rapidement immobilisés et restent stationnaires lorsqu’ils entrent dans la zone d’entrée de la racine dorsale ou DREZ.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que l’imagerie chez un animal mort, est que nous pouvons imager ce système chez un animal vivant de manière répétée sur une période de plusieurs semaines, voire de plusieurs mois. Placez d’abord un coussin chauffant à commande thermostatique sous un stéréomicroscope fluorescent et ajustez le débit à 32,5 degrés Celsius sur un coussin chauffant, ajusté à 32,5 degrés Celsius Préchauffage stérile solution de sonnerie à 32,5 degrés Celsius pour l’irrigation de la moelle épinière Pendant la chirurgie, anesthésiez l’animal avec une injection intrapéritonéale d’un cocktail de xylazine et de kétamine. Une dose initiale de l’analgésique buprénorphine est également administrée par voie sous-cutanée.

Un niveau d’anesthésie approprié est atteint lorsque le réflexe palpable est absent et que l’animal ne répond pas à un pincement de l’orteil. Une fois l’anesthésie confirmée, rasez le haut du dos avec une tondeuse pour petits animaux et étalez une petite goutte de lotion dépilatoire sur la zone rasée avec des cotons-tiges. Quelques minutes plus tard, retirez la lotion appliquée et toute fourrure restante avec de l’eau savonneuse.

Enfin, à l’aide d’éponges de gaze imbibées à 70 % d’éthanol pour nettoyer complètement le champ opératoire. Placez l’animal sur le coussin chauffant et désinfectez la peau avec des cotons-tiges imbibés à 70 % d’éthanol. Un champ chirurgical stérile doit être appliqué à des fins de démonstration.

Il n’est pas montré dans cette vidéo. Sous un éclairage en fond clair sur le stéréomicroscope, faites une incision médiane de deux à trois centimètres dans la peau du dos. Si nécessaire, utilisez des cotons-tiges pour arrêter le saignement.

Réfléchissez la musculature de la colonne vertébrale avec des pinces fines et des mâchoires osseuses. Pour exposer les vertèbres lombaires sous-jacentes. Exposez les segments spinaux L trois à S un par laminectomie hémique droite à l’aide de petits jurés r, puis perfuser la cavité avec une solution de sonnerie stérile chaude.

Positionnez l’animal sur un coussin de soutien en gaze de coton roulée. Aplatir la colonne vertébrale. Utilisez des crochets de rétraction pour élargir la zone exposée.

À ce stade, environ 30 minutes après la première injection d’anesthésique, un supplément doit être injecté afin de maintenir l’animal complètement anesthésié. Passez à l’excitation fluorescente pour visualiser pourquoi la FP a marqué les axones. À l’aide de la pointe d’une aiguille de calibre 27 et demi, effectuez une petite incision dans la dure-mère recouvrant la racine dorsale L cinq perfuser à plusieurs reprises avec une solution de bague et nettoyez doucement avec des cotons-tiges à pointe.

Identifiez le site à écraser et capturez des images de toute la zone exposée non endommagée. Cela aidera à identifier le site de la blessure lors des séances d’imagerie ultérieures. Insérez ensuite un côté d’une paire de pinces fines.

Fermez correctement la pince doucement mais fermement en tenant la partie médiane de la racine L cinq pendant 10 secondes, puis relâchez doucement la pince. Laver à plusieurs reprises avec une solution physiologique et nettoyer doucement avec des cotons-tiges à bout de coton. Obtenez plusieurs images de l’ensemble de la zone exposée, y compris le site d’écrasement et la zone DREZ avant et juste après l’écrasement, à faible et à fort grossissement.

Après avoir obtenu une imagerie serrée, appliquez un morceau de fine membrane matricielle synthétique suivi de dure-mère artificielle sur la moelle épinière exposée, de sorte qu’elles s’insèrent précisément dans la fenêtre de la moelle épinière exposée. Fermez la musculature avec cinq sutures stériles et fermez l’incision médiane avec des clips de plaie. Injecter des solutions de ringer par voie sous-cutanée et administrer de la buprénorphine comme analgésie postopératoire par injection intramusculaire toutes les 12 heures pendant deux jours.

Anesthésier l’animal avec de la xylazine et de la kétamine comme décrit précédemment, et retirer les clips et les sutures de la plaie. Retirez la dure-mère artificielle et les patchs à membrane à matrice synthétique mince et conservez-les dans un tube stérile contenant une solution de sonnerie pour une réutilisation ultérieure. Ensuite, retirez délicatement tout tissu cicatriciel conjonctif accumulé avec la pointe pliée d’une aiguille de calibre 26 et des pinces fines perfusant fréquemment avec une solution de sonnerie chaude.

Réexposez le champ opératoire, y compris le site d’écrasement et la zone d’entrée de la racine dorsale, et déplacez les axones marqués YFP imagés lors des sessions précédentes pour une imagerie continue au cours de la régénération. Ici, quatre axones superficiels étiquetés YFP indiqués par des flèches colorées sont affichés immédiatement après l’écrasement. Trois jours après l’écrasement, les quatre axones étendent un seul neurite qui se développe à travers le site d’écrasement, comme mis en évidence dans les deux cinq jours après l’écrasement.

Les neurites restent stables et il n’y a pas de croissance supplémentaire de ces axones ou d’autres axones proximaux. Au quatrième jour, les neurites régénératrices sont plus minces et plus faibles que les axones épargnés. L’imagerie répétée de ces axones à leurs extrémités tous les deux ou trois jours pendant deux semaines supplémentaires révèle qu’ils ne se sont pas développés vers l’avant ou rétractés, mais sont restés immobiles avec un gonflement des extrémités et des tiges de certains axones.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exposer, d’écraser et d’observer la racine L cinq do afin de mieux comprendre les mécanismes qui interdisent ou favorisent la régénération axonale.