Extraction de protéines à partir de cellules neuronales

Prenez une culture cellulaire contenant des cellules cancéreuses neuronales attachées à une lamelle et conservez-la dans des conditions froides.

Retirez le milieu de culture et lavez à plusieurs reprises les cellules avec un tampon de phosphate froid pour éliminer le milieu résiduel.

Ajouter un tampon de lyse contenant une faible concentration de détergent non ionique et d’inhibiteurs de protéase.

Le détergent non ionique perturbe la membrane cellulaire pour initier la lyse.

Pendant ce temps, les inhibiteurs de la protéase bloquent les enzymes protéolytiques cellulaires, protégeant les protéines de la dégradation enzymatique.

Ensuite, utilisez un grattoir cellulaire pour déloger les cellules partiellement lysées de la lamelle.

Transférez le contenu dans un tube contenant le tampon de lyse.

Dans des conditions froides, utilisez un homogénéisateur pour lyser mécaniquement les cellules, assurant ainsi une lyse cellulaire complète et la libération de protéines.

Centrifuger le lysat cellulaire.

Recueillir le surnageant dans un tube frais.

Les protéines extraites des cellules tumorales neuronales sont maintenant prêtes pour une analyse plus approfondie.

Pour valider l’expression des protéines, 48 heures après la transfection, placez les boîtes de culture sur de la glace et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Traitez les cellules de chaque boîte avec 200 à 400 microlitres de tampon de lyse et utilisez un grattoir pour retirer les cellules des lamelles.

Transférez les cellules détachées de chaque plaque dans des tubes de microcentrifugation individuels, puis dissociez davantage les cellules avec un homogénéisateur sous glace. Au bout d’une minute, granulez les morceaux de cellules homogénéisés par centrifugation.