Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Présenté ici est un protocole qui combine un système de co-culture neural-endothelial in vitro et l'incorporation métabolique du sialoglycan avec des groupes fonctionnels bioorthogonals pour étendre les cellules neurales primaires de tige et d'ancêtre et étiqueter leur surface sialoglycoproteins pour l'imagerie ou l'analyse de la spectrométrie de masse des marqueurs de surface cellulaire.

Les cellules souches et progénitrices neurales peuvent se renouveler et se différencier en différents types de cellules neurales, soutenant le développement du système nerveux et offrant une ressource pour la médecine régénérative. Ces cellules sont hétérogènes, et nous avons besoin de connaître leurs marqueurs spécifiques de surface cellulaire afin d’obtenir une population cellulaire purifiée et de comprendre leurs fonctions. Notre protocole fournit une technique simple, sensible et efficace pour analyser les protéines membranaires des cellules souches neurales primaires et progénitrices, aidant à identifier de nouveaux marqueurs de surface pour ces cellules.

Le principal avantage de notre protocole est sa capacité à analyser directement le protéome de surface des cellules souches et progénitrices neurales primaires avec une sensibilité et une spécificité améliorées. Ceci est réalisé en les élargissant par la co-culture dans les cellules endothéliales in vitro et la cellulation intrinsèque de tractine élevée MAPK-ERK voie pour étiqueter les porins de surface. Avec des pro-modifications pores sur l’expansion des cellules souches in vitro, notre protocole peut facilement être appliqué pour identifier les marqueurs de surface d’autres types de cellules souches.

Pour préparer les cellules endothéliales, suspendre à nouveau une pastille de cellules BEN3 à partir d’une boîte de Pétri de 10 centimètres à 90% de confluence avec neuf millilitres de milieu cellulaire BEN3. Ajouter un millilitre de suspension cellulaire dans un insert de soutien perméable. Ajouter deux millilitres de ben3 moyen par puits à la chambre inférieure de la matrice.

Continuer à culturer les cellules pendant une journée à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Un jour après le placage des cellules dans les inserts, aspirez doucement le milieu, d’abord à partir de la chambre inférieure, puis à partir des inserts. Lavez le visage des inserts trois fois avec du DMEM préchauffé.

Laver la surface extérieure des inserts en rinçant avec du DMEM préchauffé. Ensuite, ajoutez un millilitre d’AM préchauffé en un seul insert. Transférer les inserts dans les puits avec des cellules corticales primaires.

Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 12 heures. Dissoudre Ac4ManAz dans DMSO pour atteindre une concentration de stock de 200 millimolar. Récupérez la plaque de co-culture neuronale-endothéliale de l’incubateur.

Ajouter un microlitre du stock Ac4ManAz à chaque chambre inférieure et 0,5 microlitres par insert dans la co-culture. Culture des cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Alors que les cellules sont culte ajouter 100 microlitres de RM par insert et 200 microlitres de RM par chambre inférieure pour re-nourrir les cellules endothéliales et neurales tous les deux jours.

Retirez d’abord les inserts des plaques de co-culture et aspirez le milieu de culture du fond des puits. Lavez ensuite les cellules neurales une fois avec du PBS préchauffé. Aspirer le PBS des puits et ajouter un millilitre d’un paraformaldéhyde pré-refroidi de 4% dans PBS à chaque puits.

Fixer les cellules à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez ensuite les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi. Aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de tampon conjugué à la biotine fraîchement préparé 1 dans chaque puits.

Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après cela, aspirer le tampon de réaction des puits et laver les cellules trois fois avec PBS. Ajouter un millilitre de tampon de coloration à chaque puits de cellules et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le tampon de coloration des puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi. Ajouter un millilitre de tampon bloquant à chaque puits de cellules et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le tampon de blocage des puits et ajoutez un millilitre de solution d’anticorps primaire à chaque puits.

Incuber les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire des puits. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi.

Aspirez le PBS des puits et ajoutez un millilitre d’anticorps secondaire à chaque puits. Incuber les cellules à température ambiante pendant deux heures. Après cela, aspirer la solution à partir des puits et laver les cellules trois fois avec PBS pré-refroidi.

Tout d’abord, préparez le complexe de sulfate cuprique BTTAA 2, le tampon de re-suspension complète des protéines, le tampon de lavage des protéines 1, le tampon de lavage des protéines 2 et le tampon de lavage des protéines 3 tel que décrit dans le protocole de texte. Ensuite, retirez les inserts des plaques de co-culture. Aspirez le milieu de culture à partir des puits du bas et lavez les cellules neurales une fois avec du PBS pré-refroidi.

Aspirez le PBS et ajoutez 200 microlitres de tampon RIPA pré-refroidi à chaque puits. Incuber les plaques sur la glace pendant cinq minutes, puis recueillir la lyse protéique en tubes de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 12000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter les débris cellulaires.

Transférer le supernatant dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et déterminer la concentration en protéines avec un kit BCA selon les instructions des fabricants. Ensuite, ajustez la concentration en protéines à un milligramme par millilitre. Ajouter 100 biotines d’alkyde micromolaire, 2,5 millimolaires d’ascorbate de sodium et 1XBTTAA cuprique complexe de sulfate 2 à un millilitre de lyse protéique.

Bien mélanger la solution et l’incuber à température ambiante pendant une heure. Après cela, transférer la solution de réaction en 20 millilitres de méthanol pré-réfrigéré dans un tube conique de 50 millilitres. Bien mélanger et incuber toute la nuit à moins 30 degrés Celsius pour précipiter les protéines.

Centrifugeuse à 4500 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour pelleter la protéine précipite. Lavez la pastille deux fois à l’aide de 20 millilitres de méthanol pré-refroidi par lavage. Ensuite, aspirez le supernatant et suspendez la pastille protéique en quatre millilitres de tampon de re-suspension.

Transférer la re-suspension protéique dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Laver 50 microlitres de perles de streptavidine trois fois avec du PBS. Ajouter les perles lavées à la re-suspension protéique et incuber la solution à quatre degrés Celsius pendant trois heures sur un rotateur vertical à une vitesse de rotation de 20 rpm.

Après cela, laver les perles séquentiellement avec chaque tampon de lavage montré ici. Suspendre à nouveau les perles lavées avec 20 microlitres de PBS et les transférer dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 20 microlitres de tampon de chargement de protéines 2X et traiter à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, traiter les échantillons de protéines avec SDS-PAGE et les tacher avec Coomassie Brilliant Blue tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette étude, les NSPCs embryonnaires primaires sont élargis et métaboliquement étiquetés in vitro. Une co-culture endothéliale réussie conduit les CNSP à former de grands clones en forme de feuilles.

L’immunostaining avec des anticorps indique que dans le clone, la plupart des cellules sont nestin NSPCs positifs, alors que très peu sont des cellules neuronales bêta tubulin 3. En revanche, le pourcentage de cellules positives Nestin et de cellules neuronales bêta tubulaires 3 dans les clones formés dans le système de non-co-culture sont presque les mêmes. Le journaliste chimique Ac4ManAz est un analogue métabolique et peut être incorporé dans la voie intrinsèque de sialylation des protéines.

Une concentration d’étiquetage optimisée de 100 micromolaires pour les CNSP primaires est utilisée et l’évaluation combinatoire de la mort cellulaire indiquée par la morphologie cellulaire et des noyaux suggère que cette concentration d’étiquetage ne provoque pas d’effets cytotoxiques évidents et est capable d’étiqueter efficacement les PSN. Le potentiel clonal de morphologie, d’auto-renouvellement et de différenciation des CNSP dans le système de co-culture endothéliale et de non-co-culture n’est pas affecté. Les échantillons de protéines préparés à partir de la culture étiquetée Ac4ManAz par conjugaison de biotine et la purification des perles de streptavidine montrent un fort signal de coloration Coomassie Brilliant Blue dans les gels SDS-PAGE.

Entre-temps, il n’y avait que des éléments de fond de coloration et des signaux de liaison non spécifiques dans les voies chargées d’échantillons de protéines provenant du groupe témoin du DMSO. Cela indique également l’étiquetage efficace des NSPCs par Ac4ManAz. Lorsque vous essayez ce protocole, toutes les solutions nécessaires à la réaction biocellulaire doivent être préparées fraîchement et le temps de réaction doit être contrôlé étroitement pour éviter une réaction insuffisante.

Suivant notre protocole, la structure du glycan de surface enrichi en cellules souches neuro peut être analysée. Notre protocole de tige neurale et de protéines de surface enrichies de cellules progénitrices non seulement augmente les marqueurs, mais joue également des fonctions importantes sur la stratégie de purification des motifs surélevés et l’illustration de circuits de signaux rigides pour cette population cellulaire.