Micro-injection stéréotaxique d’un vecteur viral pour la manipulation de gènes chez un striatum de bébé souris

Prenez un chiot souris génétiquement modifié portant une cassette STOP flanquée de loxP qui bloque l’expression de la protéine fluorescente rouge ou RFP.

Fixez le chiot sur un cadre stéréotaxique sur mesure et couvrez-le de glace pour maintenir l’anesthésie.

Désinfectez le cuir chevelu et marquez lambda comme point de référence.

Alignez l’aiguille d’injection sur les coordonnées striatales par rapport à lambda et perforez le crâne.

Rétractez l’aiguille à la surface du crâne, puis insérez-la dans la profondeur cible.

Injecter le vecteur viral mélangé à un colorant dans le striatum à un rythme contrôlé. Le vecteur code pour des protéines fluorescentes vertes ou GFP et une recombinase Cre.

Retirez l’aiguille lentement pour éviter le reflux de la solution.

Retirez le chiot et laissez-le récupérer.

Dans les cellules striatales, le virus libère son génome, permettant l’expression de la Cre recombinase et de la GFP. Cre excise la cassette STOP flanquée de loxP, activant l’expression RFP.

L’expression simultanée de GFP et de RFP confirme la réussite de la manipulation génétique.

Placez le chiot avec le gant dans le plateau de tête et mettez de la glace pilée autour du manchon en latex pour maintenir l’anesthésie d’hypothermie. Ensuite, frottez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70 % et localisez le point de repère lambda. Marquez-le avec un marqueur. Dirigez ensuite la pointe de l’aiguille vers le lambda et réglez les coordonnées avant, postérieure et latérale médiale à zéro.

Ensuite, en consultant un atlas cérébral, déplacez le bras d’injection vers le site cible. Par exemple, le striatum des petits P2 est de 2,4 millimètres en avant du lambda, de 1,0 millimètre de chaque côté de la ligne médiane et de 1,7 millimètre ventral. Ensuite, marquez la position du colorant vert rapide sur le tube PE10 à l’aide d’un stylo. Ensuite, commencez lentement à pénétrer l’aiguille à travers la peau et le crâne jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille entre en contact avec la surface du crâne.

Définissez la coordonnée ventrale dorsale sur zéro. Abaissez ensuite lentement l’aiguille jusqu’au site cible. Une fois en position, attendez une minute pour permettre au parenchyme de reprendre sa forme normale. Exécutez ensuite le programme de micro-injection à 100 nanolitres par minute. Pendant l’injection, observez le colorant vert se déplacer rapidement dans le tube PE.

Il est essentiel de pénétrer lentement l’aiguille à travers la peau et le crâne jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille entre en contact avec la surface du crâne. Pendant l’injection, il est impératif de surveiller le colorant Fast Green se déplacer dans le tube PE.

Une fois l’injection terminée, attendez une minute, puis remontez lentement l’aiguille jusqu’à la moitié de la profondeur de la DV pénétrée. Attendez ensuite encore 30 secondes avant de procéder au retrait lent de l’aiguille de la tête du chiot.

Une fois l’injection terminée, il est important d’attendre une minute avant de remonter lentement l’aiguille à la moitié de la profondeur DV pénétrée, puis d’attendre encore 30 secondes avant de retirer lentement l’aiguille de la tête du chiot.

Une fois que tous les sites ciblés ont été injectés, réchauffez le chiot pendant 20 minutes dans un incubateur à 33 degrés Celsius.

Vérifiez le chiot toutes les cinq minutes jusqu’à ce qu’il ait retrouvé sa position couchée sternale. Remettez ensuite le chiot à sa mère.