Evaluation de l'expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Cette vidéo montre une procédure permettant de déterminer la viabilité cellulaire dans des cellules exprimant la GFP à l’aide du cytomètre basé sur l’image tally. Les cellules transduites par la GFP sont colorées à l’aide du kit de viabilité tally dead cell red, qui colore toutes les cellules mortes en rouge avec de l’iodure de propidium, les cellules sont pipetées dans une lame d’analyse cellulaire tally et chargées dans le cytomètre, qui acquiert et analyse les images de fluorescence en fond clair et rouge et vert. Des histogrammes sont ensuite générés pour afficher le nombre de cellules, la taille des cellules, l’intensité de fluorescence PI et l’intensité de fluorescence GFP par rapport à la cytométrie en flux traditionnelle.

Tali peut fournir des données similaires concernant la viabilité et l’expression cellulaires. Cependant, cette cytométrie basée sur l’image fournit des informations visuelles supplémentaires sur la population cellulaire examinée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux ou la microscopie à fluorescence est que le cytomètre basé sur l’image tally fournit simultanément des informations quantitatives et visuelles sur votre échantillon cellulaire.

De plus, l’instrument tally est plus facile à utiliser, moins coûteux et a un encombrement plus petit qu’un cytomètre en flux ou un microscope à fluorescence. Cela permet aux chercheurs d’effectuer rapidement des tests quantitatifs tels que la viabilité des cellules exprimant la GFP sur la paillasse. Dans cette procédure, des cellules U2 OS à une concentration de un fois 10 à six cellules par millilitre ont été transduites avec une construction virale GFP légère de cellules nucléaires ciblées pour soutenir les cellules mortes avec de l’iodure de propidium, transférant 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse.

Notez qu’une concentration de un fois 10 à la cinquième à une fois 10 à la septième cellules par millilitre est recommandée pour le dosage, bien que la concentration n’ait pas besoin d’être exacte. Ensuite, ajoutez un microlitre de réactif tally dead cell red. Ensuite, agitez brièvement pour mélanger, incubez le réactif de coloration et le mélange cellulaire à température ambiante dans l’obscurité pendant une à cinq minutes.

Après l’incubation, procéder immédiatement à l’analyse sur le cytomètre basé sur l’image tally. Le décompte utilise des lames d’analyse cellulaire en plastique jetables conçues spécifiquement pour l’instrument. Assurez-vous toujours de tenir la diapositive par les bords pour charger la diapositive.

Pipetez lentement 25 microlitres d’échantillon dans l’une des zones de chargement d’échantillons en forme de demi-lune. Ici, les cellules témoins non colorées non transduites sont chargées dans la chambre A et les cellules colorées exprimant la GFP sont chargées dans la chambre B.To effectuer un test de viabilité dans les cellules exprimant la GFP, appuyez sur G-F-P-R-F-P sur l’écran d’accueil du cytomètre. Les options de test apparaîtront alors sur la droite, sélectionnez GFP plus viabilité.

L’instrument demandera ensuite si la série d’échantillons doit être nommée pour nommer la série d’échantillons. Appuyez sur nom maintenant. Ensuite, à l’aide de l’écran tactile, tapez le nom de la série d’échantillons et appuyez sur enregistrer, le cytomètre tally passera automatiquement à l’écran de mesure.

Ensuite, pour mesurer la fluorescence de fond, appuyez sur l’onglet d’arrière-plan dans la moitié inférieure droite de l’écran de mesure, comme on peut le voir ici. Le paramètre par défaut indique que neuf champs de cellules seront imagés. Maintenant, avec l’échantillon de contrôle tourné vers l’opposé de l’instrument, insérez la lame dans l’orifice de chargement jusqu’à ce qu’elle s’arrête.

N’appliquez pas de force sur l’écran d’arrière-plan, appuyez sur la touche pour insérer une nouvelle commande de cellule non tachée. La diapositive sera automatiquement tirée dans l’instrument et une image en direct des cellules s’affichera à l’écran. À l’aide du bouton de mise au point, amenez les cellules dans le bon plan de vue pendant la mise au point.

Faites glisser le bouton de zoom rouge sur quatre x ou 16 x. Pour mieux voir la population cellulaire, les cellules doivent être uniformément sombres avec un halo brillant autour de chacune. Comme illustré ici, les cellules peuvent être sous-estimées lorsque la transition entre l’arrière-plan et les bords des cellules est floue, de sorte que les limites des cellules ne sont pas bien définies.

Les cellules peuvent être surcomptées lorsqu’elles ont des centres brillants et des périmètres sombres. Une fois que les cellules ont été mises au point, touchez, appuyez pour exécuter le contrôle des cellules non colorées. Pour mesurer la fluorescence de fond, le cytomètre capturera automatiquement des images et affichera des vignettes de chaque champ de vision.

La barre de progression fournit une mise à jour continue de l’analyse. Une fois la capture d’image terminée, le cytomètre éjecte automatiquement la lame et fournit les données de l’analyse des images capturées. Les données stockées sont affichées dans le menu déroulant de l’onglet Arrière-plan.

L’échantillon de contrôle en arrière-plan se verra attribuer le même nom que celui donné à l’expérience. Pour analyser l’échantillon transduit GFP coloré par PI, retirez la lame de l’instrument, retournez-la et réinsérez-la avec l’échantillon transduit tourné vers l’extérieur de l’instrument. Appuyez sur la languette d’échantillon, puis appuyez sur Appuyez pour insérer un nouvel échantillon.

Lorsque l’image apparaît à l’écran, utilisez le bouton de mise au point pour mettre en évidence les cellules. Comme précédemment, puis appuyez sur pour exécuter l’échantillon. Une fois la capture d’image terminée, les données de l’analyse apparaissent sous l’onglet échantillon et le cytomètre éjecte automatiquement la lame de manière appropriée.

Jetez la lame d’analyse cellulaire tally. En tant que déchets biologiques dangereux, ces lames ne peuvent pas être réutilisées. Une fois l’exemple exécuté, des seuils peuvent être appliqués à l’échantillon.

Pour analyser des populations cellulaires spécifiques ici, nous allons ajuster les seuils pour déterminer le pourcentage de cellules vivantes et mortes. Dans les cellules exprimant la GFP sous l’onglet échantillon, le nombre et le pourcentage de cellules exprimant la GFP vivantes et les cellules mortes exprimant la viabilité totale de la GFP. La taille moyenne des cellules, le nombre de cellules comptées et la concentration des cellules sont affichés.

De plus, des graphiques d’histogramme affichant la taille des cellules, la fluorescence verte et la fluorescence rouge sont affichés au bas de l’écran. Pour définir la porte de la taille de cellule, appuyez sur la vignette de la taille de la cellule pour ouvrir l’histogramme de la taille de la cellule afin d’exclure tout débris. Déplacez les curseurs bleus pour exclure les grands et les petits événements.

Appuyez sur appliquer pour inclure les cellules à l’intérieur des portes. Ensuite, pour ajouter la fluorescence GFP à l’analyse, appuyez sur la vignette de l’histogramme GFP. Pour l’ouvrir.

Déplacez le curseur bleu pour définir le seuil juste à droite du pic le plus sombre. Utilisez l’échantillon de contrôle comme guide. Cela permet à l’analyse d’inclure les cellules GFP positives, mais d’exclure les cellules autofluorescentes.

L’autofluorescence est fréquemment observée lorsque les molécules biologiques à l’intérieur des cellules sont excellentes toucher appliquer pour confirmer et revenir à l’écran précédent. Les données affichées sous l’onglet échantillon doivent maintenant refléter les portes et le seuil définis pour les deux canaux de fluorescence. Ensuite, pour séparer les cellules de coloration PI de l’autofluorescence ou de tout arrière-plan présent dans l’échantillon, appuyez sur la vignette de l’histogramme PI pour l’ouvrir à nouveau.

Le pic de l’échantillon de contrôle sera affiché sous la forme d’un pic gris sur l’histogramme. Le pic rouge est la fluorescence de l’échantillon. La fluorescence de fond est affichée sous la forme d’un pic le plus proche de la valeur zéro RFU sur cet instrument.

Pour éliminer la fluorescence de fond dans le canal PI, déplacez la barre de défilement bleue pour ajuster le seuil. Pour exclure ce pic, utilisez le pic gris de l’échantillon de contrôle comme référence. Lorsque le seuil dans le canal PI est correctement réglé, appuyez sur Appliquer pour confirmer et revenir à l’écran précédent, l’instrument de tally réanalysera à nouveau automatiquement les données et mettra à jour les résultats dans l’onglet échantillon.

Ensuite, pour confirmer visuellement que chaque cellule est correctement attribuée, appuyez sur l’onglet zoom, puis sélectionnez un champ de vision capturé pour l’examen en appuyant sur la vignette de l’image. Appuyez ensuite sur l’onglet des couches. Ensuite, appuyez sur le bouton GFP ou PI pour afficher l’image capturée via ce canal.

Appuyez à nouveau sur le même bouton pour retirer le calque de l’affichage ou pour superposer des calques, touchez les boutons correspondant à chaque canal pour identifier comment les cellules sont comptées à travers un canal particulier. Les cellules qui ont été comptées uniquement par le canal en fond clair, qui n’expriment pas la fluorescence, seront entourées en bleu. Cela indique qu’une cellule particulière est constituée de cellules vivantes exprimant dans le canal vert.

La GFP sera encerclée dans les cellules vertes s’exprimant dans le canal rouge. Les cellules colorées avec pi seront encerclées en rouge et sont des cellules mortes comptées dans les deux. Les canaux rouge et vert seront entourés de jaune.

Cela indique que la cellule exprime la GFP mais qu’elle est également colorée par pi et qu’elle est donc morte. De temps en temps, un cercle noir apparaît à l’écran. Il s’agit d’objets qui ont été identifiés, mais qui ont été exclus de l’analyse en fonction de la taille de la cellule.

Continuez à affiner le seuil sur l’histogramme de fluorescence en suivant les étapes décrites ci-dessus jusqu’à ce que chaque cellule exprimant la fluorescence soit entourée de la couleur appropriée. Tous les paramètres d’analyse sont automatiquement enregistrés dans l’instrument. Sous le robinet de données.

Le tally peut stocker des fichiers de données provenant de 500 échantillons. Chaque fichier stocké dans l’onglet données est disponible pour une réanalyse. En sélectionnant le fichier dans l’onglet données, il sera rouvert et tous les histogrammes et couches deviendront actifs pour archiver les données et générer des rapports.

Les données stockées dans l’instrument peuvent être transférées vers un ordinateur à l’aide d’une clé USB. Quatre types de cellules représentatives ont été transduits à l’aide d’une lentille cellulaire ciblée nucléaire, d’une construction virale GFP colorée avec un kit de viabilité tally à l’aide d’un réactif rouge à cellules mortes et analysés par le tally dans un cytomètre en flux, comme indiqué ici. Les deux méthodes ont rapporté à peu près le même pourcentage de la population pour chaque type de cellule exprimant la GFP, ainsi que le pourcentage de la population totale qui était à la fois viable et exprimant la GFP.

Ces données démontrent que le cytomètre Tali est capable de faire la distinction entre l’expression totale de la GFP dans une population et l’expression de la GFP dans la population vivante. Nous venons de démontrer comment utiliser le cytomètre basé sur l’image tally pour évaluer l’expression de la fluorescence et la viabilité dans votre échantillon cellulaire. Cette technologie comble le fossé entre les études individuelles et les études sur cellules de population.

À l’aide du cytomètre basé sur l’image tally, vous pouvez collecter des informations visuelles quantitatives et qualitatives sur des cellules individuelles ainsi que sur des populations cellulaires plus importantes. En utilisant la même procédure, plusieurs autres tests peuvent être effectués, y compris l’apoptose, l’expression de RFP et la viabilité cellulaire Pour les cellules non exprimées, les applications potentielles incluent l’évaluation de l’expression génique aux études d’efficacité des médicaments.