Name: Evaluation de lexpression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez l'évaluation de la viabilité cellulaire et de l'expression de GFP en utilisant le cytomètre image-based Tali. Cette méthode fournit des données quantitatives et visuelles simultanément pour l'analyse des populations cellulaires.

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1. Cellules présentant une coloration avec le Kit viabilité Tali - Réactif Dead Cell Rouge <ol><li> Commencez cette procédure avec les cellules U2OS (American Type Culture Collection) qui ont été transduites en utilisant CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Note: Les cellules peuvent également être centrifugé et resuspendu dans le milieu ou PBS). </li><li> Pour colorer des cellules mortes avec PI, transférer 100 uL des cellules à un nouveau tube. Notez que la concentration de 1 x 10 5 à 1 x 10 7 cellules / ml est recommandée pour ce test, si la concentration ne doit pas être exacte. </li><li> Ensuite, pour colorer les cellules mortes, ajoutez 1 uL de réactif à base d&#39;IP Tali Dead Cell Rouge. Brièvement au vortex pour mélanger. Incuber les Tali réactif Red Dead Cell et le mélange de cellules à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 1-5 minutes. </li><li> Après l&#39;incubation, procéder immédiatement à une analyse de l&#39;échantillon sur la base d&#39;images Tali cytomètre. </li></ol> 2. Effectuer un test de viabilité cellulaire utilisant unTali Image Based Cytomètre <ol><li> Le cytomètre de Tali utilise le plastique jetables Diapositives Tali analyse cellulaire spécifiquement s&#39;insérer dans le cytomètre et peut contenir deux échantillons de 25 pi chambres séparées ci-joint (A et B). Lors de la manipulation de la diapositive, assurez-vous de toujours le tenir par les côtés. </li><li> Pour charger la diapositive, une pipette 25 ul de l&#39;échantillon lentement dans la demi-lune zone de chargement de l&#39;échantillon, en prenant soin d&#39;éviter la formation de bulles ou de retour éclaboussures. Ne pas sur-ou sous combler. </li><li> Ici, les cellules de contrôle (non coloré, non transduites) sont chargés dans la chambre A et le teint exprimant la GFP cellules sont chargées dans la chambre B. L&#39;échantillon de contrôle vous aidera à déterminer le niveau d&#39;autofluorescence dans l&#39;analyse des données. </li><li> Pour effectuer un test de viabilité, toucher GFP / RFP sur l&#39;écran d&#39;accueil du cytomètre. Les options de test apparaîtra alors sur la droite. Sélectionnez la GFP + viabilité. </li><li> Ensuite, pour n&#39;en citer la série d&#39;échantillons, appuyez Nom maintenant </strong&gt;. Puis, en utilisant l&#39;écran tactile, tapez le nom de la série d&#39;échantillons, et appuyez sur Enregistrer. (Nota: Sélectionner Nom tard pour attribuer automatiquement un nom pour chaque série d&#39;échantillons par date et l&#39;heure.) </li><li> Après avoir nommé l&#39;échantillon, le cytomètre Tali va automatiquement passer à l&#39;écran Mesure. Appuyez sur l&#39;onglet Historique dans la moitié inférieure droite de l&#39;écran Mesure. </li><li> Ensuite, avec l&#39;échantillon témoin (A) tourné vers le cytomètre, insérez la lame dans le port de chargement jusqu&#39;à ce qu&#39;il s&#39;arrête. Ne forcez pas. </li><li> Sur le fond d&#39;écran, tactile Appuyez pour insérer New Cell Control non colorées. La diapositive sera automatiquement tiré dans le cytomètre et une image en direct des cellules seront affichées sur l&#39;écran. </li><li> En utilisant le bouton de mise, amener les cellules dans le plan approprié de vue. Les cellules doivent être uniformément sombre avec un halo lumineux autour de chaque cellule (figure 1, gauche). </li><li> Cellulaires peut être sous-estimées lors de la transition entre le fond et les bords des cellules est floue, de sorte que les limites des cellules ne sont pas bien définis (figure 1, Centre). Les cellules peuvent être surdénombrées quand ils ont des centres lumineux et sombres périmètres (figure 1, droite). </li><li> Pour mieux visualiser la population des cellules tout en se concentrant, faites glisser le bouton Zoom voyant rouge à 4X ou 16X. </li><li> Une fois les cellules ont été mis en évidence, le toucher de presse pour exécuter Cell Control non marqué pour mesurer la fluorescence de fond. </li><li> Le cytomètre automatiquement capturer et d&#39;analyser les images de l&#39;échantillon. Il faut environ 1 minute pour capturer et analyser les images dans le défaut (9 images) en mode. </li><li> Des miniatures de chaque champ de vue sont affichées comme elles sont capturées et la barre de progression permet une mise à jour permanente. Après la capture d&#39;image est terminée, le cytomètre éjecte automatiquement la lame et fournit les données de l&#39;analyse des images capturées. </li><li>Les données stockées seront affichés dans le menu déroulant de l&#39;onglet Arrière-plan sur le cytomètre. L&#39;échantillon de contrôle de fond sera attribué le même nom que celui donné à l&#39;expérience et sera importé dans le menu déroulant. Remarque: Si un contrôle de fond n&#39;est pas exécuté, le cytomètre attribue automatiquement un seuil de fluorescence. Ce peut être modifié manuellement après avoir effectué le test. </li><li> Pour exécuter l&#39;exemple PI-tachés transduites, retirer la lame de la cytomètre, retournez autour et le réinsérer avec l&#39;échantillon transduites face loin de l&#39;instrument. </li><li> Appuyez sur l&#39;onglet Sample, puis touchez Appuyez pour insérer nouvel échantillon. Lorsque l&#39;image apparaît sur l&#39;écran, utilisez le bouton de réglage d&#39;image pour mettre les cellules en lumière comme avant. Ensuite, touchez la presse pour exécuter des échantillons. </li><li> Après la capture d&#39;image est terminée, les données de l&#39;analyse apparaît sous l&#39;onglet des échantillons et l&#39;automatique cytomètreallié éjecte la diapositive. </li><li> Disposer de façon appropriée le Slide Tali analyse cellulaire en tant que déchets biologiques dangereux. Diapositives Tali analyse cellulaire ne peut pas être réutilisé. </li></ol> 3. Seuils de réglage et Gates <ol><li> Une fois l&#39;échantillon a été exécuté, les seuils peuvent maintenant être appliqués à l&#39;échantillon à domicile sur une population de cellules spécifiques. Ici, nous allons ajuster les seuils pour déterminer le pourcentage de cellules vivantes et mortes dans la GFP cellules transduites. </li><li> Sous l&#39;onglet de l&#39;échantillon, le nombre et le pourcentage de cellules exprimant la GFP, les cellules vivantes et mortes exprimant la GFP, la viabilité totale, la taille moyenne d&#39;une cellule, le nombre de cellules comptées, et la concentration de cellules sont affichées. </li><li> En outre, les parcelles histogramme affichant la taille des cellules, la fluorescence verte et rouge de fluorescence (PI) sont affichés au bas de l&#39;écran. </li><li> Pour définir la taille des cellules de la porte, touchez la miniature taille de la cellule d&#39;ouvrir l&#39;histogramme taille des cellules. Alors que les cellules cultivées ont rarement debris, d&#39;autres échantillons peuvent contenir des débris qui sont plus grands ou plus petits que les cellules. </li><li> Pour exclure ces débris, faites glisser les boutons bleus sur la barre de défilement pour exclure les événements petits et grands. Ensuite, le toucher Appliquer pour ré-analyser les données et mettre à jour les résultats. </li><li> Ensuite, pour ajouter la fluorescence de la GFP à l&#39;analyse, touchez la miniature histogramme GFP pour l&#39;ouvrir. Faites glisser la barre bleue de fixer le seuil juste à la droite de la plus obscur de pointe, en utilisant l&#39;échantillon de contrôle comme un guide. </li><li> Cela permet l&#39;analyse pour inclure les cellules GFP-positives, mais exclure les cellules autofluorescente. Autofluorescence est souvent observé lorsque les molécules biologiques dans des cellules sont excités. </li><li> Appliquer tactile pour confirmer et revenir à l&#39;écran précédent. Les données affichées sous l&#39;onglet échantillon devrait désormais refléter les portes et les seuils fixés pour les deux canaux de fluorescence. </li><li> Ensuite, pour séparer les cellules PI teinté d&#39;autofluorescence, appuyez sur tIl miniature histogramme PI d&#39;ouvrir l&#39;histogramme PI. </li><li> Encore une fois, le pic de l&#39;échantillon de contrôle sera affiché comme un pic gris sur l&#39;histogramme. Le pic rouge est la fluorescence de l&#39;échantillon. La fluorescence de fond est affiché comme un pic proche de la valeur 0 RFU sur ce cytomètre. </li><li> Pour éliminer la fluorescence de fond dans le canal PI, déplacez le bouton bleu de la barre de défilement pour régler le seuil d&#39;exclure le pic représentant la fluorescence de fond, en utilisant le pic gris de l&#39;échantillon de contrôle comme une référence. Appliquer tactile pour confirmer et revenir à l&#39;écran précédent. </li><li> Ensuite, pour confirmer visuellement que chaque cellule est correctement affectée, sélectionnez un champ de vue capturé pour l&#39;examen en appuyant sur ​​la vignette de l&#39;image dans l&#39;onglet Zoom, puis en appuyant sur ​​l&#39;onglet Calques. </li><li> Ensuite, appuyez sur le bouton de la GFP ou PI, pour afficher l&#39;image capturée par ce canal particulier. Appuyez sur le même bouton pour enlever la couche de l&#39;écran, ou de superposer des couches, touchez le bouton multi-couche. </li><li> Pour déterminer comment les cellules sont comptées par un canal particulier, Cercles toucher. Les cellules qui ont été comptés par seulement le canal champ lumineux, qui n&#39;expriment pas de fluorescence seront entourés en bleu. Ceci indique que cette cellule particulière est en direct (c.-pi négatif). </li><li> Les cellules exprimant la GFP sera vu dans le canal de la GFP, et sera entouré en vert. Les cellules mortes colorées au rouge Dead Cell sera vu dans le canal de PI, et il sera encerclé en rouge. </li><li> Cellules comptées dans le canal à la fois rouge et vert sera entouré en jaune, cela indique que la cellule exprime la GFP, mais est aussi teinté avec PI et est donc morte. </li><li> Parfois, les cercles noirs apparaissent à l&#39;écran, ce sont des objets qui ont été identifiés, mais ont été exclus de l&#39;analyse fondée sur la taille des cellules. </li><li> Continuer à fiNE syntoniser le seuil sur l&#39;histogramme de fluorescence en utilisant les étapes décrites jusqu&#39;à ce que chaque cellule qui exprime la fluorescence est encerclé avec la couleur appropriée. </li><li> Tous les paramètres d&#39;analyse sont enregistrés automatiquement dans l&#39;onglet données. Le cytomètre de Tali peut stocker des fichiers de données d&#39;environ 500 passages de l&#39;échantillon. </li><li> Chaque fichier stocké dans l&#39;onglet de données est disponible pour la réanalyse. En sélectionnant le fichier depuis l&#39;onglet Données, il sera ouvert et tous les histogrammes et les couches deviennent actifs. </li><li> Pour archiver les données et générer des rapports, les données stockées dans le cytomètre peut être transféré à un ordinateur via une clé USB. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: L&#39;Image-Based Tali Cytomètre a été utilisé pour mesurer le niveau d&#39;expression protéine fluorescente dans les cellules qui ont été transduites avec une construction nucléaire ciblée GFP BacMam expression 2.0. Quatre types de cellules représentatives ont été transduites (U2OS, 293MSR, HEKn, et CHO-S).Pour ces lignées cellulaires, le nombre de cellules exprimant la GFP qui ont été rapportés par le cytomètre Tali et comparés aux données provenant des mêmes échantillons analysés sur un cytomètre en flux. En outre, les cellules ont été colorées avec le réactif cellulaire Red Dead utilisant le kit de viabilité Tali pour identifier la population de cellules mortes à la fois sur le cytomètre Tali et sur un cytomètre en flux. Les représentations graphiques de la figure 2 montrent le pour cent de la population totale pour chaque type de cellule qui ont été exprimant la GFP. Ces données démontrent que le cytomètre Tali produit des données comparables aux données générées par un cytomètre en flux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Figure 1. Les cellules doivent être correctement centré avant l&#39;analyse. Diapositives Tali analyse cellulaire à des concentrations de cellules appropriées pour l&#39;analyse (1 x 10 5 à 1 x 10 7 cellules sont recommandés). (Gauche) dans les cellules de mise au point sont uniformément dArche à travers la cellule, avec un halo lumineux autour de chaque cellule cellules. (CENTRE) peut être sous-estimées lors de la transition entre le fond et les bords des cellules sont floues et les cellules ont des limites indéfinies (DROITE) Cellules peut surdénombrées quand ils ont brillants centres et les périmètres sombre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Figure 2. Fluorescent données d&#39;expression de protéines à partir du cytomètre Tali Image-Based est comparable à celle obtenue en utilisant la cytométrie de flux. Une comparaison côte à côte des calculée GFP-expression des résultats en 4 lignées cellulaires différentes dans les cellules viables.

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</ol>

Krissy Remple et Laurel Pierre sont des employés de Life Technologies qui a produit l&#39;instrument utilisé dans cet article. Life Technologies a financé la production de cette vidéo article.

Nous venons tout juste d&#39;une procédure détaillée pour l&#39;exécution et l&#39;évaluation de la viabilité compte expression de la GFP en utilisant l&#39;Image-Based Tali cytomètre. En utilisant la même procédure, ce cytomètre est capable d&#39;effectuer un certain nombre de dosages d&#39;autres, notamment: analyse de la viabilité apoptose, DP et cellulaire à l&#39;aide non-cellules transduites. Dosages fluorométriques de la viabilité cellulaire, l&#39;expression des gènes et de l&#39;apoptose sont devenus des principales méthodes de la recherche biomédicale 7-12. Dans le passé, l&#39;instrumentation distincte a été utilisée pour obtenir des informations quantitatives et visuelles sur les cellules. Alors que des informations quantitatives sur les cellules au sein d&#39;une population hétérogène a été remporté par l&#39;utilisation de la cytométrie de flux, l&#39;information visuelle ou qualitatives ont été recueillies grâce à l&#39;utilisation de la microscopie par fluorescence 1-4. Ici, nous présentons une technologie qui comble le fossé entre la population et les études de cellules individuelles. Utilisation du Tali Image Based Cytomètre, quantitatives daTA et les données des cellules visuelles sur des cellules individuelles ou des populations de cellules peuvent être recueillies simultanément. L&#39;instrument de Tali peut être utilisée pour une gamme d&#39;applications incluant l&#39;évaluation de l&#39;expression génique, les essais apoptose, des études sur l&#39;efficacité des médicaments, et l&#39;évaluation de la progression de la maladie. L&#39;Image-Based Tali capte et analyse Cytomètre champ lumineux, la fluorescence rouge et le vert des images de fluorescence, permettant ainsi des informations sur les sous-populations de cellules à obtenir. Par exemple, dans cet essai, nous avons été en mesure de distinguer les cellules mortes de cellules vivantes au sein du exprimant la GFP de la population de cellules en utilisant Morte Red Cell colorant. Cela donne une précision dans la mesure des cellules viables exprimant la GFP, et identifie la population de cellules utilisables pour le traitement en aval. Il est important de noter que les cellules mortes de la population pourrait provenir de sources diverses, y compris la mort des cellules normales en culture ou la mort cellulaire provoquée par les conditions environnementales (par exemple, la trypsine ou deATH induite par la méthode de transfection / transduction choisi). Ici nous démontrer l&#39;utilisation du cytomètre de Tali avec des cellules U2OS. Des méthodes similaires peuvent être effectuées en utilisant la plupart des cellules de mammifères et d&#39;insectes. Pour chaque lignée cellulaire, le cytomètre Tali produit des données quantitatives expression de la GFP, ce qui n&#39;est pas possible avec une inspection visuelle des cellules en utilisant un microscope standard à fluorescence. Bien que ces résultats sont comparables à la cytométrie de flux, ils sont collectés en une fraction de l&#39;époque. Le cytomètre est capable de précision comptage des cellules entre 5 um à 60 um de diamètre, idéalement à une concentration de 1 x 10 5 à 1 x 10 7 cellules / ml. Il est important de souligner que la plupart des protocoles de coloration standard, y compris le protocole de coloration cellulaire Red Dead décrit ici, l&#39;utilisation d&#39;iodure de propidium pour distinguer les cellules vivantes et mortes. Ceci présente un défi lors de l&#39;évaluation de viabilité des cellules qui ont été perméabilisées pour staining des marqueurs intracellulaires, puisque PI tacher toute cellule avec une membrane compromise. Comme tout colorant fluorescent ou de protéines qui peuvent être détectés avec les canaux de fluorescence verte ou rouge peut être analysée sur la base d&#39;images Tali Cytomètre, les études futures pourraient explorer l&#39;utilisation de colorants suppléant, tels que la viabilité d&#39;amine teintures réactives 4. Une étude menée en 2006 par Perfetto et al. 12 trouvé ces colorants pour être facile à utiliser et reproductible pour discriminer les populations de cellules vivantes et mortes. Notez que le Tali a des limites à l&#39;égard des types de tests qu&#39;il peut effectuer. Par exemple, puisque l&#39;objectif utilisé par l&#39;instrument est 4X, les opérations de comptage sont limités à des types de cellules plus grandes: les structures sub-cellulaires comme les mitochondries ou des vésicules, et des cellules bactériennes ne peuvent pas être quantifiés. A noter également que les canaux de détection dans Tali sont limitées à des fluorophores qui fera vibrer et émettre dans les canaux. Alors que la YFP et lumineux signaux mCherry cune être détecté, gradateur signaux mCherry ne peut pas. Enfin, le Tali analyses uniquement les cellules en suspension. Il ne sera pas de compter exactement les cellules adhérant à une diapositive. De plus, alors il ya seulement une capacité limitée pour le comptage des cellules qui sont de forme irrégulière, dont certaines levures et cellules primaires. En outre, les études à venir seront probablement aborder l&#39;utilisation de ce système dans l&#39;évaluation de l&#39;expression des marqueurs intracellulaires. Colorants individuels peuvent être vérifiés de chevauchement spectral avec les canaux adjacents, en utilisant l&#39;outil d&#39;Invitrogen SpectraViewer ligne ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Etant donné la nouveauté de cette technologie, la gamme complète d&#39;applications n&#39;a pas encore été découvert. En résumé, le Tali Image Based Cytomètre démontré ici présente une nouvelle technologie qui permet la visualisation simultanée et l&#39;analyse de populations cellulaires, permettant l&#39;évaluation des cellules individuelles ainsi que celL populations dans un format compact avec un workflow simple.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Tali Image Based Cytomètre </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Diapositives Tali analyse cellulaire, 50 Diapositives </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Diapositives Tali analyse cellulaire, 500 diapositives </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Kit viabilité Tali - Red Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Kit viabilité Tali - Vert Dead Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali apoptose Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> Cellules U2OS </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation de l&#39;expression de gfp et viabilité en utilisant le tali image based cytomètre

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Une seule cellule et d&#39;information de la population sont généralement obtenus soit par cytométrie de flux ou microscopie par fluorescence. Cependant, ces deux méthodes fournissent des informations différentes. La cytométrie en flux quantitative donne des informations multi-paramétriques sur les caractéristiques physiques et de la coloration ou l&#39;expression, mais ne permet pas de visualisation. Stand-alone de microscopie par fluorescence fournit des données visuelles, mais ne permet pas de simples mesures quantitatives 1. À base d&#39;images cytométrie comble le fossé entre ces deux méthodes, permettant la visualisation rapide et simultanée des analyses quantitatives de milliers de cellules dans des populations hétérogènes 2. Ici, nous présentons une méthode pour réaliser la viabilité cellulaire et vert fluorescent des dosages d&#39;expression de protéines (GFP) en utilisant le Tali Image Based Cytomètre 3. L&#39;instrument Tali est une plate-forme 3-canal (champ clair, fluorescence verte, fluorescence rouge) dosage de paillasse que Offeavantages rs plusieurs reprises cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. Le cytomètre de Tali est moins cher, prend moins d&#39;espace banc, nécessite moins d&#39;entretien, et le flux de travail a été simplifié afin que l&#39;opération et l&#39;analyse est beaucoup plus simple et plus rapide. Le cytomètre de Tali est capable d&#39;exécuter une gamme de suspension dosages cellulaires, y compris la GFP et une protéine fluorescente rouge (RFP) l&#39;expression, l&#39;apoptose 4-6 et l&#39;analyse de la viabilité cellulaire avec de l&#39;iodure de propidium (PI) 7-11. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation de l&#39;instrument de Tali en effectuant une analyse de viabilité cellulaire dans les cellules exprimant la GFP. GFP-cellules transduites sont colorées en utilisant le kit de viabilité Tali - Red Dead Cell. Les cellules sont ensuite à la pipette dans une diapositive Tali analyse cellulaire et chargé dans le cytomètre. Fond clair, fluorescence rouge et le vert des images de fluorescence sont capturés et analysés en utilisant des algorithmes de dosage précis. Les histogrammes sont ensuite générés à afficher la taille des cellules, PI fluocence d&#39;intensité, et l&#39;intensité de fluorescence de la GFP. Ces paramètres peuvent ensuite être seuillée à la maison dans une population cellulaire spécifique. Un side-by comparaison côte du cytomètre de Tali à base d&#39;images et cytométrie de flux traditionnels démontre que les deux méthodes fournissent des données comparables sur la viabilité cellulaire et l&#39;expression des protéines. Toutefois, l&#39;instrument Tali fournit des informations supplémentaires visuelles sur la population de cellules qui ne peuvent être obtenues en utilisant un cytomètre de flux.

Ce protocole décrit comment effectuer la viabilité cellulaire et des dosages d&#39;expression de fluorescence en utilisant le Tali Image Based cytomètre.

Evaluation de l&#39;expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Les informations relatives aux cellules individuelles et aux populations sont couramment obtenues soit par cytométrie en flux, soit par microscopie à fluorescence. Cependant, ces deux méthodes fournissent...

Ce vidéo montre une procédure permettant de déterminer la viabilité cellulaire dans des cellules exprimant la GFP à l’aide du cytomètre imageant Tally. Les cellules transduites avec la GFP sont marquées à l’aide du kit de viabilité Tally Dead Cell Red, qui colore en rouge toutes les cellules mortes grâce à l’iodure de propidium. Les cellules sont pipetées dans une lame d’analyse cellulaire Tally puis chargées dans le cytomètre, qui acquiert et analyse des images en champ clair ainsi qu’en fluorescence rouge et verte. Des histogrammes sont ensuite générés pour afficher le nombre de cellules, la taille cellulaire, l’intensité de fluorescence de l’iodure de propidium (PI) et l’intensité de fluorescence de la GFP, par comparaison avec la cytométrie en flux traditionnelle.Tali peut fournir des données similaires concernant la viabilité cellulaire et l'expression. Toutefois, cette cytométrie basée sur l'image offre des informations visuelles supplémentaires sur la population cellulaire analysée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cytométrie en flux ou la microscopie à fluorescence, est que le cytomètre image Tali fournit simultanément des informations quantitatives et visuelles sur votre échantillon cellulaire.En outre, l'instrument de comptage est plus facile à utiliser, moins coûteux et occupe moins d'espace qu'un cytomètre en flux ou qu'un microscope à fluorescence. Cela permet aux chercheurs d'effectuer rapidement des dosages quantitatifs, tels que la viabilité, sur des cellules exprimant la GFP directement sur la paillasse. Dans cette procédure, des cellules U2 OS à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre ont été transduites avec un vecteur viral exprimant la GFP ciblée vers le noyau, puis les cellules mortes ont été marquées avec de l'iodure de propidium ; transférez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube microcentrifuge.Remarquez qu'une concentration de un fois dix puissance cinq à un fois dix puissance sept cellules par millilitre est recommandée pour le test, bien que la concentration n'ait pas besoin d'être exacte. Ensuite, ajoutez un microlitre de réactif Tally Dead Cell Red. Puis vortexez brièvement pour homogénéiser, incubez le mélange de réactif de marquage et de cellules à température ambiante à l'abri de la lumière pendant un à cinq minutes.Après l'incubation, passez immédiatement à l'analyse sur le cytomètre imageant tally. Le tally utilise des lames en plastique jetables conçues spécifiquement pour l'appareil. Veillez toujours à tenir la lame par les bords pour la charger.Introduisez lentement 25 microlitres d'échantillon à l’aide d’une pipette dans l’une des zones de chargement d’échantillon en forme de demi-lune. Ici, les cellules contrôles non transduites non marquées sont chargées dans la chambre A et les cellules marquées exprimant la GFP sont chargées dans la chambre B. Pour réaliser un test de viabilité sur des cellules exprimant la GFP, touchez G-F-P-R-F-P sur l’écran d’accueil du cytomètre. Les options du test apparaîtront alors à droite ; sélectionnez GFP plus viabilité.L'appareil demandera ensuite s'il faut nommer la série d'échantillons pour nommer la série d'échantillons. Appuyez sur nommer maintenant. Ensuite, à l'aide de l'écran tactile, saisissez le nom de la série d'échantillons et appuyez sur enregistrer ; le cytomètre de comptage passera automatiquement à l'écran de mesure.Ensuite, pour mesurer la fluorescence de fond, appuyez sur l'onglet «&nbsp;fond&nbsp;» situé dans la moitié inférieure droite de l'écran de mesure, comme indiqué ici. Le paramètre par défaut indique que neuf champs de cellules seront imagés. Maintenant, avec l'échantillon témoin orienté à l'opposé de l'appareil, insérez la lame dans le port de chargement jusqu'à ce qu'elle s'arrête.Ne pas appliquer de pression sur l'écran tactile en arrière-plan pour insérer une nouvelle cellule témoin non colorée. La lame sera automatiquement introduite dans l'appareil et une image en direct des cellules s'affichera à l'écran. À l'aide de la molette de mise au point, amener les cellules dans le plan de vision approprié tout en effectuant la mise au point.Faites glisser le bouton de zoom rouge vers 4 x ou 16 x. Pour mieux visualiser la population cellulaire, les cellules doivent être uniformément sombres avec un halo lumineux autour de chacune. Comme illustré ici, les cellules peuvent être sous-comptées lorsque la transition entre le fond et les bords des cellules est floue, de sorte que les limites cellulaires ne soient pas bien définies.Les cellules peuvent être comptées en excès lorsqu'elles présentent un centre brillant et des périphéries sombres. Une fois les cellules mises au point, touchez ou appuyez pour exécuter le contrôle des cellules non colorées. Pour mesurer la fluorescence de fond, le cytomètre capturera automatiquement des images et affichera des miniatures de chaque champ observé.La barre de progression fournit une mise à jour continue de l'analyse. Une fois la capture d'image terminée, le cytomètre éjecte automatiquement la lame et fournit les données issues de l'analyse des images capturées. Les données stockées s'affichent dans le menu déroulant de l'onglet arrière-plan.L'échantillon témoin de fond sera attribué du même nom que celui donné à l'expérience. Pour exécuter l'échantillon transduit GFP coloré au PI, retirez la lame de l'appareil, retournez-la et réinsérez-la de sorte que l'échantillon transduit soit orienté à l'opposé de l'appareil. Appuyez sur l'onglet échantillon, puis touchez appuyez pour insérer le nouvel échantillon.Lorsque l'image apparaît à l'écran, utilisez le bouton de mise au point pour focaliser les cellules. Comme précédemment, appuyez ensuite brièvement pour exécuter l'échantillon. Une fois la capture d'image terminée, les données de l'analyse s'affichent sous l'onglet échantillon et le cytomètre éjecte automatiquement la lame de manière appropriée.Jetez la lame d'analyse cellulaire. Ces lames, considérées comme des déchets biologiques dangereux, ne peuvent pas être réutilisées. Une fois l'échantillon analysé, des seuils peuvent être appliqués à l'échantillon.Pour analyser des populations cellulaires spécifiques ici, nous ajusterons les seuils afin de déterminer le pourcentage de cellules vivantes et mortes. Dans les cellules exprimant la GFP sous l'onglet échantillon, le nombre et le pourcentage de cellules exprimant la GFP, les cellules vivantes, les cellules mortes exprimant la GFP, la viabilité totale, la taille moyenne des cellules, le nombre de cellules comptées et la concentration cellulaire sont affichés.En outre, des histogrammes affichant la taille des cellules, la fluorescence verte et la fluorescence rouge sont présentés en bas de l'écran. Pour définir le seuil de taille des cellules, touchez la vignette de taille cellulaire afin d'ouvrir l'histogramme de taille des cellules et d'exclure tous les débris. Déplacez les barres coulissantes bleues pour exclure les événements de grande et de petite taille.Appuyez pour appliquer et inclure les cellules à l'intérieur des fenêtres. Pour ajouter la fluorescence GFP à l'analyse, appuyez sur la vignette de l'histogramme GFP. Pour l'ouvrir.Déplacez la barre du curseur bleu pour régler le seuil juste à droite du pic le plus faible. Utilisez l'échantillon témoin comme guide. Cela permet à l'analyse d'inclure les cellules positives pour la GFP, tout en excluant les cellules autofluorescentes.L'autofluorescence est fréquemment observée lorsque des molécules biologiques à l'intérieur des cellules sont mises en évidence. Appuyez sur écran tactile pour confirmer et revenir à l'écran précédent. Les données affichées sous l'onglet échantillon doivent maintenant refléter les seuils et les fenêtres définis pour les deux canaux de fluorescence. Ensuite, pour distinguer les cellules marquées au PI de l'autofluorescence ou de tout fond présent dans l'échantillon, appuyez sur la miniature de l'histogramme du PI afin de le rouvrir.Le pic de l'échantillon témoin sera affiché sous forme d'un pic gris sur l'histogramme. Le pic rouge correspond à la fluorescence de l'échantillon. La fluorescence de fond est représentée par le pic le plus proche de la valeur zéro en unités de fluorescence relative (RFU) sur cet appareil.Pour éliminer la fluorescence de fond dans le canal PI, déplacez la barre de défilement bleue afin d'ajuster le seuil. Pour exclure ce pic, utilisez le pic gris provenant de l'échantillon témoin comme référence. Une fois le seuil dans le canal PI correctement défini, appuyez sur appliquer pour confirmer et revenir à l'écran précédent ; l'instrument de comptage analysera de nouveau automatiquement les données et mettra à jour les résultats dans l'onglet échantillon.Ensuite, pour confirmer visuellement que chaque cellule est correctement attribuée, appuyez sur l'onglet de zoom, puis sélectionnez un champ capturé à examiner en appuyant sur la miniature de l'image. Ensuite, appuyez sur l'onglet couches. Puis, appuyez sur le bouton GFP ou PI pour afficher l'image capturée à travers ce canal.Appuyez à nouveau sur le même bouton pour supprimer la couche de l'affichage ou pour superposer les couches. Appuyez sur les boutons correspondant à chaque canal afin d'identifier la manière dont les cellules sont comptées via un canal particulier. Des cercles entourent les cellules qui ont été comptées uniquement à travers le canal de champ clair ; celles qui n'expriment pas de fluorescence seront entourées en bleu. Cela indique qu'une cellule particulière est une cellule vivante exprimant un signal dans le canal vert.Les cellules exprimant GFP seront entourées en vert dans le canal rouge. Les cellules marquées au PI seront entourées en rouge et correspondent aux cellules mortes comptées dans les deux canaux. Les cellules apparaissant dans les canaux rouge et vert seront entourées en jaune.Cela indique que la cellule exprime la GFP mais est également marquée au PI et est donc morte. Parfois, un cercle noir apparaît à l'écran. Il s'agit d'objets qui ont été identifiés mais exclus de l'analyse en fonction de la taille de la cellule.Continuez à régler finement le seuil sur l'histogramme de fluorescence en suivant les étapes décrites ci-dessus jusqu'à ce que chaque cellule exprimant une fluorescence soit entourée de la couleur appropriée. Tous les paramètres d'analyse sont automatiquement enregistrés sur l'appareil sous l'onglet des données.Le compteur peut stocker des fichiers de données provenant de 500 analyses d'échantillons. Chaque fichier enregistré dans l'onglet de données est disponible pour une nouvelle analyse. En sélectionnant le fichier dans l'onglet de données, celui-ci sera rouvert et tous les histogrammes et calques deviendront actifs afin d'archiver les données et de générer des rapports.Les données stockées dans l'appareil peuvent être transférées vers un ordinateur à l'aide d'une clé USB. Quatre types cellulaires représentatifs ont été transduits avec une construction virale exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) ciblée vers le noyau, puis colorés avec un kit de viabilité Tally utilisant le réactif Dead Cell Red, et analysés à l’aide du Tally sur un cytomètre en flux, comme illustré ici. Les deux méthodes ont indiqué approximativement le même pourcentage de la population exprimant la GFP pour chaque type cellulaire, ainsi que le pourcentage de la population totale à la fois viable et exprimant la GFP.Ces données démontrent que le cytomètre Tali est capable de distinguer l'expression totale de la GFP dans une population de l'expression de la GFP dans la population vivante. Nous venons de montrer comment utiliser le cytomètre imageant Tali pour évaluer l'expression de la fluorescence et la viabilité dans votre échantillon cellulaire. Cette technologie comble le fossé entre les études cellulaires individuelles et celles portant sur des populations.À l'aide du cytomètre imageant par comptage, vous pouvez recueillir des informations visuelles quantitatives et qualitatives sur des cellules individuelles ainsi que sur des populations cellulaires plus importantes. En utilisant la même procédure, plusieurs autres tests peuvent être réalisés, notamment l'apoptose, l'expression de RFP et la viabilité cellulaire. Pour les cellules non exprimantes, les applications potentielles incluent l'évaluation de l'expression génique jusqu'aux études sur l'efficacité des médicaments.

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