Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les complexes de chaîne naissante ou RNC liés aux ribosomes de SEC TED 70 s produits lors de la traduction dans un système acellulaire in vitro. Ceci est accompli en introduisant d’abord une séquence de blocage SEC M de 17 acides aminés à l’extrémité C terminale du gène d’intérêt et en la clonant en aval du promoteur transcriptionnel T sept. Ensuite, l’ARNm est transcrit à l’aide d’une réaction de transcription in vitro, puis purifié.

Ensuite, l’ARNm purifié est traduit dans un système d’extraction S 30 E coli avec des acides aminés radioactifs pour marquer la protéine synthétisée ou le polypeptide naissant. Enfin, les complexes de la chaîne naissante liés aux ribosomes de M. Ed sont isolés par saccharose, gradient, centrifugation et fractionnement. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant que les chaînes naissantes sont liées de manière stable au ribosome 70 s par analyse par électrophorèse sur gel des polypeptides marqués isolés des fractions de gradient

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation d’ARNm dépourvu de codon stock est qu’elle assure avec une grande efficacité la fixation de la chaîne polypeptidique naissante au ribosome 70 s pendant la traduction et l’étape de centrifugation ultérieure. De plus, contrairement à la technologie de cordon d’arrêt, cette méthode peut être utilisée avec une efficacité presque égale dans les systèmes in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement des protéines de traduction, telles que le moment de la formation de divers intermédiaires de repliement de la traduction et à analyser leur structure en utilisant une structure directe ou indirecte.

Approches de sonde et de détermination Cette technique peut nous aider à déchiffrer le chemin de repliement des protéines sur le ribosome. Dans ce protocole, nous avons décrit l’isolement de chaînes naissantes cristallines bine gamma B de pleine longueur liées au ribosome 70. Mais cette technique peut être utilisée pour l’isolement de la maladie vari de pratiquement n’importe quelle protéine d’intérêt.

Cette stratégie peut également être adoptée pour isoler les chaînes polypeptidiques tronquées de natine du derme Es.Généralement, les individus novices dans cette méthode peuvent avoir des difficultés lors de l’étape de centrifugation par gradient de saccharose. Cependant, pour la première expérience, cela ne devrait pas poser de problème. Nous avons décidé d’utiliser la deuxième séquence de décrochage pour isoler les polypeptides naissants cristallins gamma B liés à 70 en tant que ribosome après des tentatives initiales, moins réussies, impliquant l’utilisation d’ARNm sans cordon d’arrêt.

Cette dernière technique n’a pas permis d’assurer la stabilité des RNC lors des étapes de centrifugation ultérieures avec la même efficacité que la technique impliquant l’utilisation de la séquence d’arrêt SECM. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes impliquant la préparation du gradient et la séparation du RNC peuvent être difficiles à apprendre et nécessitent un certain niveau d’expertise pour garantir des résultats reproductibles. Commencez avec un gène d’intérêt qui est cloné dans n’importe quel plasmide basé sur T sept et/ou SP six pour générer des complexes de chaîne naissante de ribosomes ou RNC.

Étendez l’extrémité C du polypeptide cible en ajoutant la séquence induisant l’arrêt de M afin de s’assurer que le fragment de polypeptide sortira du tunnel ribosomique. Ajoutez un linker riche en glycine syrien flexible entre la protéine et la séquence d’arrêt SEC M pour préparer la transcription in vitro, l’enzyme de restriction de l’utilisateur qui coupera en aval du cadre de lecture ouvert pour linéariser l’ADN de la matrice et exécuter l’électrophorèse sur gel AROS pour vérifier la digestion complète de l’échantillon. Après avoir vérifié la concentration optimale d’ADN, utilisez un kit de transcription à haut rendement selon les instructions du fabricant pour synthétiser l’ARN messager.

Utilisez la précipitation du chlorure de lithium pour purifier l’ARNm. Ensuite, analysez un échantillon sur un gel d’acrylamide ou d’aros pour vérifier sa pureté. Pour la traduction in vitro.

À l’aide d’un système E coli dans de l’eau sans nucléases, ajoutez un mélange d’acides aminés millimolaires moins de méthionine, 10 unités d’inhibiteur de ribonucléase 20, des micro-curies de 35 s méthionine, 20 microlitres de mélange réactionnel, 24 microlitres de tampon de reconstitution et 24 microlitres d’e coli. Lysat. Préchauffez la réaction en l’incubant à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite un à deux microgrammes d’ARNm et incubez pendant 10 à 15 minutes supplémentaires à 30 degrés Celsius.

Arrêtez la réaction en la plaçant sur de la glace pour isoler les complexes de chaîne naissante ou ncs liés aux ribosomes 70. Superposez la réaction de traduction sur 4,5 millilitres d’un gradient de 5 à 30 % de saccharose en tas de 20 millimolaires. Hydroxyde de potassium pH 7,5 15 millimolaires de magnésium, 100 millimolaires d’acétate de potassium et une centrifugeuse DTT millimolaire à 41 000 tr/min pendant deux heures à quatre degrés Celsius après la centrifugation, fractionnent le gradient de saccharose à l’aide d’un système de gradient de densité programmable et d’un détecteur d’absorbance réglé à 254 nanomètres.

Collectez les fractions contenant les ribosomes 70 s pour une analyse plus approfondie afin de déterminer si la protéine étendue SEC M reste attachée au ribosome 70 s. Précipitez la protéine dans chaque fraction de gradient en ajoutant de l’acide trichloracétique. Incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain, centrifuger les échantillons à 14 000 fois G pendant 15 minutes pour granuler la protéine, laver les granulés dans un rapport de quatre pour un d’acétone pour un tris millimolaire, HCL pH 7,6.

Faites sécher les pastilles à l’air, puis remettez-les en suspension dans le tampon de chargement de page SDS. Résolvez les échantillons à l’aide de la page FDS tristrice, puis fixez et séchez les gels et soumettez-les à l’autoradiographie et à l’imagerie phospho comme indiqué ici. Après traduction in vitro, les ribosomes 70 S ont été isolés par saccharose, gradient, centrifugation et fractionnement pour s’assurer que la protéine cristalline gamma B reste liée de manière stable au ribosome.

Les fractions contenant 70 s ont été regroupées, remplacées et soumises à un cycle supplémentaire de centrifugation par gradient de saccharose. Les résultats présentés ici suggèrent que SEC M peut induire efficacement l’arrêt translationnel des RNC cristallins gamma B. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée ouvrable, à l’exception de l’analyse par électrophorèse sur gel de la chaîne naissante, qui implique généralement une étape de précipitation du TCA pendant la nuit.

Lors de la tentative de cette procédure, il est évidemment essentiel d’éviter la contamination par les ARN à toutes les étapes. La contamination par le RNS peut affecter l’efficacité de la traduction de l’extrait et conduire à la libération d’un polypeptide naissant à partir du 70e ribosome. Suite à cette procédure, on peut obtenir des NAST et des polypeptides de lanxess prédéterminés liés de manière stable au 70e ribosome en fonction de l’objectif final.

Ces complexes peuvent être utilisés à diverses fins, comme la détermination de la confirmation des chaînes naissantes liées aux ribosomes à l’aide d’approches directes et indirectes telles que la RMN ou la fre, ou le test de la liaison du facteur et du ligand après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale et du repliement des protéines pour explorer la confirmation des protéines de pleine longueur liées au ribosome, ainsi que des intermédiaires de repliement translationnel cot. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et d’isoler un polypeptide naissant, lié de manière stable au ribosome 70 s, qui peut être utilisé pour répondre à diverses questions dans le domaine du repliement des protéines de traduction.

N’oubliez pas que travailler avec des isotopes radioactifs et des acides aminés marqués, tels que, par exemple, la méthionine A 35, nécessite des précautions particulières et doit toujours être pris en compte lors de l’exécution de cette procédure.