Name: Utilisation de la séquence darrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez l'isolation de complexes ribosome-polypeptide nascent en utilisant la séquence d'arrêt SecM dans un système E. coli in vitro. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de traduction et le repliement protéique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par Human Frontier Science Program de subvention RGP0024.

1. Préparation Patron de l&#39;ADN et la transcription in vitro <ol><li> Le gène d&#39;intérêt est cloné dans un T7 et / ou, par exemple sur la base promoteur SP6 plasmide. Pour obtenir RNC d&#39;intérêt, C-terminale du polypeptide cible est étendu par adjonction séquence inducteur d&#39;arrêt de SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Afin d&#39;assurer que le fragment polypeptide d&#39;intérêt se extruder hors du tunnel ribosomique, la partie C-terminale de la protéine cible doit être augmentée d&#39;au moins 30 acides aminés 12-14. Un flexible glycine-sérine lieur riche peut être introduite entre la protéine et la séquence d&#39;arrêt SecM à éviter toutes contraintes possibles de conformation. </li><li> Pour la transcription in vitro, l&#39;ADN modèle doit être linéarisé par l&#39;enzyme de restriction coupe en aval de l&#39;ORF. Il faut vérifier linéarisation complète de l&#39;ADN plasmidique en exécutant le produit de digestion de restriction à l&#39;électrophorèse sur gel d&#39;agarose. </li><li> Le plasma linéariséIdentifiant est en outre utilisée dans la réaction de transcription in vitro. Concentration différente de la matrice ADN peuvent être testés pour déterminer la concentration d&#39;ADN optimale requise pour la transcription in vitro. En général, avec Ambion Trousse MEGAscript à haut rendement de transcription (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg d&#39;ADN linéarisé donne 40-60 ARNm pg. La transcription in vitro se fait suivant les instructions du fabricant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) . </li><li> Après transcription in vitro, l&#39;ARNm est purifié par précipitation au chlorure de lithium selon les instructions du fabricant (Ambion de MEGAscript Kit Haut de transcription rendement, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> l&#39;intégrité ARNm est encore vérifiée par électrophorèse utilisant de l&#39;acrylamide ou des gels d&#39;agarose. </li></ol> 2. La traduction in vitro Pour la traduction in vitro en utilisant le RTS 100 E. coli HY Kit (5 Premier, Gaithersburg, MD), suivez les étapes ci-dessous: <ol><li> Préparer 100 ul d&#39;instruction dans le fabricant de réaction de traduction in vitro suivante. En bref, dans la nucléase l&#39;eau libre ajouter 24 ul mélange d&#39;acides aminés moins méthionine (1 mM), 10 unités d&#39;inhibiteur de ribonucléase (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi de matières radioactives [35 S]-méthionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 pl mélange réactionnel, 24 pl de tampon de reconstitution et 24 pi de E. coli lysat. </li><li> Incuber la réaction à 30 ° C pendant 5 min à l&#39;avance au chaud la réaction de traduction. Ajouter 1-2 ug d&#39;ARNm de la réaction de traduction et incuber à 30 ° C pendant 10-15 min. </li><li> Arrêter la réaction en plaçant la réaction de traduction sur la glace. </li></ol> 3. Isolement de polypeptide naissant de réaction de traduction in vitro <ol><li> Pour isoler RNC, la réaction de traduction est posée sur le dessus de 4,5 ml de gradient de saccharose 5-30% dans 20 mM HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM d&#39;acétate de potassium, DTT 1 mM et centrifugé à l&#39;aide Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures. </li><li> Après centrifugation, gradient de saccharose est fractionné pour isoler les différentes populations ribosomique et associés des chaînes naissantes. La séparation est contrôlée à l&#39;aide de la CITP système programmable gradient de densité avec un enregistrement en continu à 254 nm en utilisant un détecteur de CITP UA-6 absorbance. </li><li> La fraction (s) contenant des ribosomes 70S sont recueillies et analysées en outre en fonction du but de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Observation de la protéine liée à ribosome avec Tris-tricine SDS-PAGE Pour vérifier si la protéine SecM prolongée reste attaché aux 70S du ribosome, fractions du gradient ont été collectées et traitées comme suit: <ol><li> La protéine dans chaque fraction a été précipité par addition d&#39;acide trichloracétique (TCA) à une concentration finale de 10% et incubées à 4 ° C overniGHT. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, les échantillons ont été centrifugés à 14.000 X g pendant 15 min à la pastille de la protéine. Surnageant de centrifugation suivant a été éliminé et le culot lavé deux fois avec de l&#39;acétone solution contenant: 1 mM de Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet était de l&#39;air encore séché et dissous dans un tampon de chargement SDS-PAGE. </li><li> L&#39;échantillon traité a été résolu et analysé par Tris-tricine SDS-PAGE. </li><li> Après l&#39;électrophorèse, les gels ont été fixés, séché à l&#39;aide de gel sous vide teinturier et soumis à une autoradiographie. La distribution des polypeptides naissants ont été observées à l&#39;aide phosphoimaging. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Nous présentons ici une expérience décrivant l&#39;isolement de la pleine longueur bovine Gamma-B cristallin stable lié aux ribosomes 70S. La figure 1 illustre les étapes impliquées dans l&#39;isolement de l&#39;espèce bovine RNC cristallines Gamma-B. Le C-terminale de la Gamma-cristallin B a été prolongé d&#39;ensemble de 32 acides aminés to s&#39;assurer que les extrusions de protéines pleine longueur la sortie du tunnel du ribosome, ce qui inclut également la séquence SecM décrochage mis à la très extrémité C-terminale du polypeptide de fusion. Après la traduction in vitro, les ribosomes 70S ont été isolées par centrifugation sur gradient de saccharose (Figure 2.1). Afin de veiller à ce que la protéine reste stable lié au ribosome, les 70S contenant fractions ont été réunies, dessalée, un échange de tampon et soumis à une série supplémentaire de centrifugation en gradient de saccharose (Figure 2.2). Le résultat présenté dans la figure 2 montre clairement que SecM peut induire efficacement arrestation de translation des RNC cristallines Gamma-B. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> Figure 1. Explication schématique des étapes impliquées dans l&#39;isolement de RNC. C-terminale de bovins Gamma-B cristallin a été prolongée de 32 séquence d&#39;acides aminés. Cette étendueC-terminales des régions inclut également la séquence d&#39;arrêt SecM. Gamma-B cristallin avec une séquence SecM a été cloné dans PIVEX 2.3 (basé sur T7) plasmide. Pour la transcription in vitro de l&#39;ADN modèle a été linéarisé par XbaI. Modèle linéarisé a en outre été utilisé pour la transcription in vitro. Le T7 dans la matrice d&#39;ADN est reconnu par l&#39;ARN polymérase T7 qui transcrit en aval gamma-B cristallin gène situées du promoteur T7. ARNm a été purifié en utilisant la méthode de précipitation au chlorure de lithium. L&#39;ARNm purifié a ensuite été utilisé pour la traduction in vitro. Après l&#39;incubation, la réaction de traduction a été superposé au-dessus de gradient de saccharose 5-30% et centrifugé dans Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures. <spune classe = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> Figure 2. Isolement de bovins Gamma-B cristallin stable RNC liés au ribosome 70S. 1 ug d&#39;ARNm a été mélangé dans 100 ul de réaction E. Système coli Extrait S30 tel que mentionné dans la section du protocole avec 20 pCi de [35 S]-méthionine et incubées à 30 ° C pendant 15 min. Après l&#39;incubation, la réaction de traduction a été superposé au-dessus de gradient de saccharose 5-30% dans 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM d&#39;acétate de potassium, DTT 1 mM et centrifugé dans Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures. Après la sédimentation de vitesse, le gradient a été déchargé et le ribosome pro le a été obtenu. Les données ont été enregistrées par le programme PeakTrak (gradient de densité CITP fractionnement dégradé système). Les fractions ont été recueillies, la protéine a été précipité TCA et résolu sur T 16,5%, 6% C Tris-Tricine PAGE gel à 15. Le gel a été séché et exposé pour autoradiographie. Après l&#39;exposition du gel a été numérisé à l&#39;aide du scanner Typhoon imagerie 9410. Figure 2.1 montre que sur toute la longueur Gamma-B cristallin est présent dans 70S du ribosome fractions. Ainsi, la séquence SecM décrochage permet l&#39;isolement de l&#39;écurie de l&#39;espèce bovine RNC cristallines Gamma-B. Les données de la figure 2.2 indiquent clairement que les RNC isolés sont en effet stables. Dans l&#39;expérience en cours des fractions 70S après première série de centrifugation en gradient de saccharose ont été regroupés et le saccharose a été éliminé à l&#39;aide Amicon ultra-4 Unité de filtre centrifuge (Millipore), suivie par un tampon d&#39;échange en solution contenant 20 mM de HEPES KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM acétate de potassium, DTT 1 mM. Cet échantillon a été ensuite soumis à une série supplémentaire de centrifugation à travers gradient de saccharose 5-30% et fractionnés. Chaque fraction a été traité et analysé comme dans la Figure 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Pour obtenir des résultats reproductibles, la qualité et la concentration des composants utilisés pour la transcription in vitro et la traduction sont essentielles. Nous avons utilisé commercialement disponibles dans la transcription in vitro et des extraits de la traduction et elles donnent des résultats efficaces et reproductibles, s&#39;il est manipulé avec soin. Qualité de l&#39;ARNm peut affecter la traduction, de sorte qu&#39;il est d&#39;une importance capitale pour tester l&#3...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Kit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 haute Kit de transcription rendement </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E. coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la ribonucléase </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Unité de filtre centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Luminophore de mémorisation autoradiographie </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imageur mode variable </td></tr><tr><td> Systèmes gradient de densité de fractionnement </td><td> Teledyne Isco, Inc </td><td> CITP système programmable gradient de densité </td></tr><tr><td> Le saccharose dégradé Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K préparative Ultracentrifugeuse </td></tr></tbody></table>

utilisation de la séquence d&#39;arrêt secm comme un outil pour isoler les polypeptides ribosome bound

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Des recherches approfondies ont fourni des preuves suffisantes indiquant que repliement des protéines dans la cellule est un processus de co-traductionnelle 1-5. Toutefois, la voie exacte que la chaîne polypeptide suit au cours de co-traductionnelle de pliage pour réaliser sa forme fonctionnelle est encore une énigme. Afin de comprendre ce processus et de déterminer la conformation exacte des intermédiaires co-traductionnelles de pliage, il est essentiel de développer des techniques qui permettent l&#39;isolement des porteurs de chaînes naissantes RNC de tailles prédéterminées afin de permettre leur analyse ultérieure structurelle. SecM (moniteur sécrétion) est un acide aminé 170 E. protéines coli qui régule l&#39;expression de l&#39;aval Seca (conduite sécrétion) ATPase dans l&#39;opéron SECM-secA 6. Nakatogawa et Ito initialement que une séquence de 17 acides aminés de longueur (G 150-FSTPVWISQA QGIRA P-166) dans la région C-terminale de la protéine SecM est nécessaire et suffisant pourprovoquer de décrochage de l&#39;allongement SecM à Gly165, produisant ainsi peptidyl-glycyl-ARNt stable lié à la ribosomal P place 7-9. Plus important encore, il a été constaté que cette séquence de 17 acides aminés de long peut être fusionné à l&#39;extrémité C-terminale de pratiquement n&#39;importe quelle protéine de pleine longueur et / ou tronquée permettant ainsi la production de RNC porteurs de chaînes naissantes de tailles prédéterminées 7. Ainsi, lorsqu&#39;il est fondu ou est insérée dans la protéine cible, la séquence de décrochage SecM produit arrêt de l&#39;allongement de la chaîne polypeptidique et génère RNC stables in vivo dans E. coli et les cellules in vitro dans un système acellulaire. Centrifugation en gradient de saccharose est en outre utilisé pour isoler RNC. Les RNC isolés peuvent être utilisés pour analyser les caractéristiques structurales et fonctionnelles des intermédiaires co-traductionnelles de pliage. Récemment, cette technique a été utilisée avec succès pour mieux comprendre la structure de plusieurs chaînes de ribosomes liés naissantes 10,11. Ici on décrit l&#39;isolement de bovin gamma-B cristallin fusionné à RNC SecM et généré dans un système de traduction in vitro.

Nous décrivons ici une technique qui est maintenant couramment utilisé pour isoler de manière stable liés ribosome complexes de la chaîne naissante (RNC). Cette technique tire parti de la découverte que de 17 acides aminés de long &quot;séquence d&#39;arrêt&quot; SecM peut arrêter élongation de la traduction dans un procaryote (<em&gt; E. coli</em&gt;) Du système, lorsqu&#39;il est inséré dans (ou fusionné à l&#39;extrémité C-terminale) de pratiquement toute la protéine.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Des recherches approfondies ont fourni d'abondantes preuves suggérant que le repliement des protéines dans la cellule est un processus co-traductionnel1-5. Cependant, la voie exacte...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des complexes ribosomaux liés aux chaînes naissantes, ou RNCs, associés aux ribosomes SEC TED 70 s et produits lors de la traduction dans un système cellulaire in vitro sans cellules. Cette isolation est réalisée en introduisant d'abord une séquence d'arrêt de 17 acides aminés provenant de SEC M à l'extrémité C-terminale du gène d'intérêt, puis en l'insérant en aval du promoteur transcriptionnel T seven. Ensuite, l'ARNm est transcrit à l'aide d'une réaction de transcription in vitro, puis purifié.Ensuite, l'ARNm purifié est traduit dans un système d'extrait S30 d'E. coli en présence d'acides aminés radioactifs afin de marquer la protéine synthétisée ou le polypeptide naissant. Enfin, les seconds complexes ribosomaux Mr.Ed liés à la chaîne naissante sont isolés par centrifugation sur gradient de saccharose et fractionnement. En définitive, les résultats obtenus peuvent démontrer que les chaînes naissantes sont stables et liées au ribosome 70 S, grâce à une analyse par électrophorèse sur gel des polypeptides marqués isolés des fractions du gradient.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation d'ARNm dépourvu de codon stop, réside dans sa capacité à assurer avec une grande efficacité l'attachement de la chaîne polypeptidique naissante au ribosome 70 S durant la traduction et l'étape ultérieure de centrifugation. De plus, contrairement à la technologie du codon stop absent, cette méthode peut être utilisée avec une efficacité presque équivalente aussi bien dans des systèmes in vitro qu'in vivo. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du repliement protéique traductionnel, telles que la manière dont différents intermédiaires de repliement traductionnel pourraient se former précocement durant la traduction, et contribue également à l'analyse de leur structure par des méthodes structurales directes ou indirectes.Approches d'exploration et de détermination Cette technique peut nous aider à décrypter la voie du repliement des protéines sur le ribosome. Dans ce protocole, nous avons décrit l'isolement de chaînes naissantes de cristalline bine gamma B liées aux ribosomes 70 s. Toutefois, cette technique peut être utilisée pour l'isolement de diverses maladies de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt.Cette stratégie peut également être adoptée pour isoler des chaînes polypeptidiques tronquées de la derm Es. En général, une personne novice avec cette méthode pourrait éprouver des difficultés lors de l'étape de centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, pour une personne expérimentée, ceci ne devrait pas poser de problème. Nous avons décidé d'utiliser une deuxième séquence d'arrêt pour isoler les polypeptides naissants de la gamma B cristalline liés au ribosome 70S, après des tentatives initiales moins concluantes qui impliquaient l'utilisation d'un ARNm dépourvu de codon d'arrêt.La technique ultérieure ne permet pas d'assurer la stabilité des complexes ribosome-chaîne naissante (RNC) durant les étapes ultérieures de centrifugation avec la même efficacité que la technique impliquant l'utilisation de la séquence d'arrêt SECM. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes relatives à la préparation du gradient et à la séparation des RNC peuvent être difficiles à maîtriser et exigent un certain niveau d'expertise afin d'obtenir des résultats reproductibles. La démonstration des manipulations sera effectuée par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour réaliser la transcription et la traduction in vitro, commencez par un gène d'intérêt cloné dans un plasmide dérivé de T7 ou de SP6 afin de produire des complexes ribosome-chaîne naissante, ou RNCs.Prolonger l'extrémité C du polypeptide cible en ajoutant la séquence inductrice d'arrêt provenant de M afin de s'assurer que le fragment polypeptidique s'extrudera hors du tunnel ribosomique. Ajouter un brin flexible riche en glycine et en sérine entre la protéine et la séquence d'arrêt SEC M pour préparer la transcription in vitro ; utilisez un enzyme de restriction qui coupe en aval du cadre de lecture ouvert afin d'obtenir une ADN matrice linéarisée, puis réalisez une électrophorèse sur gel AROS pour vérifier la digestion complète de l'échantillon. Après avoir vérifié la concentration optimale d'ADN, utilisez un kit de transcription à haut rendement selon les instructions du fabricant pour synthétiser l'ARN messager.Utiliser la précipitation par chlorure de lithium pour purifier l'ARNm. Ensuite, analyser un échantillon sur un gel d'acrylamide ou d'agarose afin de vérifier sa pureté. Pour la traduction in vitro.À l'aide d'un système E. coli dans de l'eau sans nucléase, ajouter un mélange d'acides aminés à une concentration de un millimolaire, en omettant la méthionine, 10 unités d'inhibiteur de ribonucléase, 20 microcuries de méthionine 35S, 20 microlitres de mélange réactionnel, 24 microlitres de tampon de reconstitution et 24 microlitres de lysat d'E. coli. Préchauffer la réaction en l'incubant à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter ensuite un à deux microgrammes d'ARNm et poursuivre l'incubation pendant 10 à 15 minutes supplémentaires à 30 degrés Celsius.Arrêter la réaction en plaçant le mélange sur de la glace afin d'isoler les complexes ribosome 70 S liés aux chaînes peptidiques naissantes ou ncs. Déposer la réaction de traduction sur 4,5 millilitres d'un gradient de saccharose de 5 à 30 % dans 20 millimolaire de heaps, hydroxyde de potassium, pH 7,5, 15 millimolaire de magnésium, 100 millimolaire d'acétate de potassium et 1 millimolaire de DTT. Centrifuger à 41 000 tr/min pendant deux heures à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, fractionner le gradient de saccharose à l'aide d'un système programmable de gradients de densité et d'un détecteur d'absorbance réglé à 254 nanomètres.Recueillir les fractions contenant les ribosomes 70 s pour une analyse ultérieure afin de déterminer si la protéine étendue SEC M reste associée au ribosome 70 s. Précipiter la protéine dans chaque fraction du gradient en ajoutant de l'acide trichloroacétique. Incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius ; le lendemain, centrifuger les échantillons à 14 000 × g pendant 15 minutes pour former un culot protéique, puis laver les culots dans un rapport de quatre parts d'acétone pour une part de tris à une millimolaire, HCl pH 7,6.Séchez les culots à l'air, puis resuspendez-les dans un tampon de charge pour électrophorèse SDS-PAGE. Séparez les échantillons par électrophorèse SDS-PAGE Tris-Trice, puis fixez et faites sécher les gels, et soumettez-les à une autoradiographie et à une imagerie phospho, comme illustré ici. Après la traduction in vitro, les ribosomes 70 S ont été isolés par centrifugation sur gradient de saccharose et fractionnement, afin de garantir que la protéine cristalline gamma B reste stablement liée au ribosome.Les fractions contenant les particules 70 s ont été regroupées, désalinisées par échange de tampon, puis soumises à un cycle supplémentaire de centrifugation sur gradient de saccharose. Les résultats présentés ici suggèrent que le SEC M peut induire efficacement l'arrêt traductionnel des RNC de la cristalline gamma B. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée de travail, à l'exception de l'analyse par électrophorèse sur gel de la chaîne naissante, qui implique généralement une étape de précipitation à l'acide trichloracétique (TCA) effectuée pendant la nuit.Lors de la réalisation de cette procédure, il est évidemment essentiel d'éviter toute contamination par les ARN à n'importe quelle étape. Une contamination par les ARN peut affecter l'efficacité traductionnelle de l'extrait et entraîner le relâchement du polypeptide naissant à partir du ribosome 70S. En suivant cette procédure, on peut obtenir des complexes NAST et des polypeptides de longueur prédéterminée stables associés au ribosome 70S, selon l'objectif final recherché.Ces complexes peuvent être utilisés à diverses fins, telles que la détermination de la conformation des chaînes naissantes liées au ribosome à l’aide d’approches directes et indirectes comme la RMN ou la FRET, ou encore l’analyse de la liaison de facteurs et de ligands après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale et du repliement des protéines, leur permettant d’explorer la conformation de protéines entières liées au ribosome, ainsi que des intermédiaires de repliement co-traductionnels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de l’isolement de polypeptides naissants, stables et liés au ribosome 70 S, qui peuvent ensuite être utilisés pour répondre à diverses questions dans le domaine du repliement protéique traductionnel.N'oubliez pas que le travail avec des isotopes radioactifs et des acides aminés marqués, tels que, par exemple, la méthionine A 35, exige des précautions particulières et doit toujours être pris en compte lors de l'exécution de cette procédure.

using-secm-arrest-sequence-as-tool-to-isolate-ribosome-bound

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Une technique pour identifier les sites de pause translationnelle sur l'ARNm est décrite. Cette procédure est basée sur l'isolement des polypeptides naissants qui s'accumulent sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d'un ARNm cible, suivie par l'analyse de la taille des chaînes naissantes en utilisant une électrophorèse sur gel dénaturant.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la...

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

Un tandem RNA isolation (TRIP) pour la récupération des complexes protéine-ARNm endogène formé décrit. Plus précisément, complexes ARN-protéine sont réticulés en vivo, polyadénylé RNAs sont isolés des extraits avec oligo (décollement) perles et ARNm particulier est capturés avec des oligonucléotides antisens RNA mis à jour le. Protéines liés à l’ARNm sont détectés par l’analyse par immunotransfert.

Une procédure d’Isolation RNA axée sur les oligonucléotides Tandem pour récupérer des Complexes protéine-ARNm eucaryotes

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Découvrez l'isolation de complexes ribosome-polypeptide nascent en utilisant la séquence d'arrêt SecM dans un système E. coli in vitro. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de traduction et le repliement protéique.

Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Explorer plus de vidéos