Isolation des fractions de sous-nucléaire réplication virale Compartiment enrichies d'adénovirus-infectés cellules humaines normales

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une fraction non nucléaire enrichie en compartiments de réplication formés dans des cellules infectées par des adénovirus pour l’étude détaillée de leur composition, de leur ultrastructure et des activités associées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie de l’ADN, telles que l’étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent la réplication et l’expression du génome viral qui dépendent à leur tour des compartiments de réplication pour la régulation des interactions entre les cellules hôtes du virus. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une procédure simple basée sur le gradient de vitesse pour établir un système acellulaire qui se prête à l’étude des mécanismes qui permettent aux virus à ADN réplicatif nucléaire de prendre le contrôle de la cellule infectée.

Afin d’effectuer ce test, préparez d’abord l’adénovirus de type cinq ou un D cinq et les fibroblastes du prépuce humain ou HFF comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement pour commencer à infecter 10 à la septième HFF dans des boîtes de culture tissulaire de 100 millimètres en utilisant un millilitre de 85 et un DMM par boîte à un MOI de 30 unités formant foyer ou FFU par cellule, incubez les cellules pendant deux heures dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Balancer soigneusement les plats toutes les 15 minutes pour assurer une distribution homogène de l’inoculum viral sur les cellules. Après l’incubation, retirez le milieu et ajoutez-y du dmem frais.

Complété par 10 %FBS, incubez ensuite les cellules pendant 16, 24 ou 36 heures à l’aide d’un grattoir cellulaire. Récoltez doucement les cellules infectées et de contrôle après l’infection et collectez la suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger stériles sur de la glace. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer, puis centrifugez-les à 220 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de centrifugeuse PBS glacée et lavez les cellules trois fois dans cinq millilitres de PBS glacé en jetant les surnageants de lavage afin de poux les cellules. Resus, suspendez la pastille cellulaire dans 700 microlitres de tampon hypotonique glacé avec des inhibiteurs de protéase et laissez les cellules gonfler sur de la glace pendant trois heures. À l’aide d’un pilon en téflon de type A, homogénéisez les cellules avec 10 à 20 coups de bas.

Vérifiez le lysat au microscope périodiquement tous les 20 passages pour surveiller la lyse cellulaire. Répétez le processus pendant environ 80 coups jusqu’à ce que toutes les cellules soient rompues avec succès. Ensuite, centrifugez l’homogénat à 300 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Stockez le surnageant à moins 20 degrés Celsius dans un tube en tant que fraction cytoplasmique pour éliminer les débris cellulaires des noyaux réels. Suspendez la pastille dans 750 microlitres de solution de saccharose à 0,25 molaire, une pipette de 750 microlitres de solution de saccharose à 0,35 molaire dans un tube à centrifuger et superposez soigneusement l’homogénat remis en suspension sur la solution deux. Faites tourner le coussin de saccharose à 1400 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant.

Remettre en suspension la pastille dans 750 microlitres de solution deux contre les poux. Les noyaux sonisent la suspension nucléaire dans un bain d’ultrasons, maintenu à quatre degrés Celsius ou moins en deux impulsions de cinq minutes. Vérifiez la lyse nucléaire sous un microscope à champ clair entre les impulsions et soniquez davantage jusqu’à ce que les noyaux soient complètement couchés.

Pipette suivante : 750 microlitres de saccharose 0,88 molaire La troisième solution dans un tube à centrifuger superpose la solution de lysat nucléaire sur la troisième solution. Centrifugez le lysat à 3000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Le S de 1,5 millilitre nommé est la fraction plasmique nucléo-plasmique, qui est stockée à moins 70 degrés Celsius.

Remettez ensuite le granulé en suspension dans 700 microlitres de la solution deux. Il s’agit de la fraction de 85 compartiments de réplication ou RCF du noyau hôte, qui est également stocké à moins 70 degrés Celsius. Pour commencer l’analyse par immunofluorescence, ajoutez une goutte de cinq microlitres de RCF à une lame de verre à revêtement salin

Laissez la goutte sécher à l’air libre à température ambiante. Ajoutez ensuite 500 microlitres de PBS dans une goutte à côté de l’endroit et inclinez la diapositive pour faire couler le PBS sur l’endroit. Vidangez le PBS de la glissière.

Ensuite, bloquez le point d’échantillonnage avec 500 microlitres de PBS contenant 5 % d’albumine sérique bovine pendant deux heures à température ambiante. Pour éliminer l’excès de solution bloquante, ajoutez doucement 500 microlitres de PBS à l’échantillon repéré sur la lame sans pipeter directement sur l’échantillon. Effectuez le lavage trois fois.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’anticorps primaires dilués contre la protéine virale de liaison à l’ADN E deux A à l’endroit de l’échantillon. Couvrez la lame pour éviter l’évaporation et incubez dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant deux heures. Maintenant, lavez l’échantillon trois fois doucement avec du PBS contenant 0,02 % d’entrepont 20.

Évitez de pipeter directement sur l’échantillon après ces lavages. Ajoutez 20 microlitres d’anticorps secondaires de souris couplés à quatre fluoros directement sur l’échantillon, incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure. Dans une chambre humidifiée, ajoutez 500 microlitres de PBS avec 0,02 % Tween 20 aux lames, en évitant à nouveau de pipeter directement sur l’échantillon.

Ajoutez ensuite deux microlitres de solution de montage et retournez une lamelle sur l’échantillon. Scellez les côtés des lamelles avec du vernis à ongles. Voir la lame sous un microscope à fluorescence avec un objectif 63 x à la longueur d’onde souhaitée spécifique pour le fluoro quatre utilisé, un résultat de l’immunofluorescence de l’adénoviral E deux, une protéine de liaison à l’ADN ou DBP est montré ici.

Les structures contenant le DBP sont sub nucléaires virales rc, notez que le DBP E two A est localisé à l’intérieur du RC et apparaît en vert. De plus, l’enrichissement de l’ADN viral dans le RCF a été confirmé par PCR comparant le RCF et la fraction plasmique nucléo-plasmique ou NPL 24 et 36 heures après l’infection. Le GNA viral a été détecté de manière sélective dans le RCF et non dans la consultation du NPL.

Le texte d’accompagnement pour des preuves supplémentaires de MNA adénoviral dans le RCF Une fois maîtrisé, cette technique peut être réalisée en six à partir du moment où les cellules infectées sont récoltées jusqu’à l’isolement du RCF si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours garder les échantillons sur de la glace et de surveiller les étapes d’homogénéisation du nuclé, d’isolement, de sonication et d’isolement de la fraction subnucléaire par microscopie à fond clair. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes comme la R-T-P-C-R et la microscopie électronique à transmission peuvent être réalisées afin d’étudier la régulation de l’expression des gènes viraux associés aux compartiments de réplication virale et à l’ultra structure de ces particules. Cette technique a le potentiel d’ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie des tumeurs de l’ADN pour explorer les mécanismes moléculaires qui modifient la régulation du cycle cellulaire et favorisent la réplication virale dans les cellules humaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les compartiments de réplication virale des noyaux cellulaires infectés pour effectuer des études morphologiques, fonctionnelles et de composition de ces structures induites par le virus.

N’oubliez pas que travailler avec un indicateur SAN peut être dangereux et que les percussions, telles que le port de la bouche des oreilles, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.