Isolation des fractions de sous-nucléaire réplication virale Compartiment enrichies d'adénovirus-infectés cellules humaines normales

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une fraction non nucléaire enrichie en compartiments de réplication formés dans des cellules infectées par un adénovirus, afin d'étudier en détail leur composition, leur ultrastructure et les activités associées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie de l'ADN, telles que l'étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent la réplication et l'expression du génome viral, lesquels dépendent à leur tour des compartiments de réplication pour réguler les interactions entre le virus et la cellule hôte. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité, car elle repose sur une méthode de gradient de vitesse permettant d'établir un système dépourvu de cellules, qui se prête bien à l'étude des mécanismes par lesquels les virus à ADN se répliquant dans le noyau prennent le contrôle de la cellule infectée.

Afin de réaliser ce dosage, préparez d'abord l'adénovirus de type 5 ou D5 et les fibroblastes humains de prépuce ou HFF comme décrit dans le protocole textuel accompagnant, puis infectez 107 HFF dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm en utilisant 1 ml de D5 et DMEM par boîte à un taux de multiplicité d'infection (MOI) de 30 unités formant des foyers (U.F.F.) par cellule. Incubez les cellules pendant deux heures dans une étuve de culture cellulaire humidifiée à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone, en agitant doucement les boîtes toutes les 15 minutes afin d'assurer une répartition homogène de l'inoculum viral sur les cellules. Après l'incubation, retirez le milieu et ajoutez du DMEM frais.

Supplémenté avec 10 % de FBS, puis incuber les cellules pendant 16, 24 ou 36 heures à l’aide d’un grattoir à cellules. Récolter délicatement les cellules infectées et les cellules témoins après l’infection et recueillir la suspension cellulaire dans des tubes de centrifugation stériles placés sur de la glace. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer, puis centrifuger les cellules à 220 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans cinq millilitres de PBS glacé, centrifuger et laver les cellules trois fois dans cinq millilitres de PBS glacé en éliminant les surnageants de lavage afin de lyser les cellules. Resuspendre le culot cellulaire dans 700 microlitres de tampon hypotonique glacé contenant des inhibiteurs de protéases et laisser les cellules gonfler sur de la glace pendant trois heures. À l’aide d’un piston en téflon de type A, homogénéiser les cellules par 10 à 20 mouvements descendants.

Vérifiez périodiquement le lysat au microscope toutes les 20 impulsions afin de surveiller la lyse cellulaire. Répétez le processus pendant environ 80 impulsions jusqu'à ce que toutes les cellules soient correctement rompues. Ensuite, centrifugez l'homogénéat à 300 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Conserver le surnageant à moins 20 degrés Celsius dans un tube comme fraction cytoplasmique afin d'éliminer les débris cellulaires des noyaux réus. Resuspendre le culot dans 750 microlitres de solution de saccharose 0,25 molaire un, puis pipeter 750 microlitres de solution de saccharose 0,35 molaire deux dans un tube de centrifugeuse et superposer délicatement l'homogénat resuspendu sur la solution deux. Faire tourner l'excédent de saccharose à 1400 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis jeter le surnageant.

Resuspendre le culot dans 750 microlitres de solution deux pour lyser. Soniquer la suspension nucléaire dans un bain ultrasonique, maintenu à 4 °C ou en dessous, selon deux impulsions de cinq minutes. Vérifier la lyse nucléaire au microscope champ clair entre les impulsions et poursuivre la sonication jusqu'à ce que les noyaux soient complètement lysés.

Ensuite, pipeter 750 microlitres de la solution trois de saccharose 0,88 molaire dans un tube de centrifugation, puis déposer délicatement la solution de lyzat nucléaire au-dessus de la solution trois. Centrifuger le lyzat à 3000 × g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Le surnageant de 1,5 millilitre obtenu correspond à la fraction nucléoplasmatique, qui est conservée à −70 degrés Celsius.

Ensuite, resuspendre le culot dans 700 microlitres de solution deux. Il s'agit de la fraction du compartiment de réplication 85 ou RCF du noyau hôte, qui est également conservée à moins 70 degrés Celsius. Pour commencer l'analyse par immunofluorescence, ajouter une goutte de cinq microlitres de la RCF sur une lame de verre recouverte de solution saline.

Laisser sécher la goutte à température ambiante. Ensuite, ajouter 500 microlitres de PBS en une goutte à côté du spot et incliner la lame pour faire couler le PBS sur le spot. Éliminer le PBS de la lame.

Ensuite, bloquer le point d'échantillon avec 500 microlitres de PBS contenant 5 % d'albumine de sérum bovin pendant deux heures à température ambiante. Pour éliminer l'excès de solution de blocage, ajouter délicatement 500 microlitres de PBS sur l'échantillon déposé sur la lame sans pipeter directement sur l'échantillon. Réaliser ce lavage trois fois.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres d'anticorps primaire dilué dirigé contre la protéine virale de liaison à l'ADN E deux A sur le spot d'échantillon. Recouvrez la lame pour éviter l'évaporation et incubez dans une chambre humide à température ambiante pendant deux heures. Lavez maintenant l'échantillon trois fois délicatement avec du PBS contenant 0,02 % de Tween 20.

Éviter de pipeter directement sur l'échantillon après ces lavages. Ajouter 20 microlitres d'anticorps secondaire marqué au fluorochrome, de souris, directement sur l'échantillon, puis incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure. Dans une chambre humidifiée, ajouter 500 microlitres de PBS contenant 0,02 % de Tween 20 sur les lames, en évitant à nouveau de pipeter directement sur l'échantillon.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution de montage et placez délicatement une lame couvre-objet au-dessus de l'échantillon en l'inversant. Scellez les bords des lames couvre-objets avec du vernis à ongles. Observez la préparation au microscope à fluorescence avec un objectif 63 x, à la longueur d'onde souhaitée spécifique au fluorochrome utilisé. Un résultat provenant de l'immunofluorescence de la protéine de liaison à l'ADN E2A d'adénovirus, ou DBP, est montré ici.

Les structures contenant la DBP sont des rc viraux sous-nucléaires ; notez que la DBP E deux A est localisée au sein du rc et apparaît en vert. De plus, l'enrichissement en ADN viral dans la fraction rc a été confirmé par PCR en comparant la fraction rc et la fraction nucléoplasmique ou NPL à 24 et 36 heures après infection. L'ADN viral a été spécifiquement détecté dans la fraction rc et non dans la fraction NPL, voir consultation.

Le texte accompagnant fournit des preuves supplémentaires de la présence d'ARNm d'adénovirus dans le RCF. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures environ, du prélèvement des cellules infectées à l'isolement du RCF, à condition qu'elle soit effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de toujours garder les échantillons sur glace et de surveiller par microscopie en champ clair les étapes d'homogénéisation nucléaire, d'isolement, de sonication et d'isolement des fractions sous-nucléaires. Suivre cette procédure.

D'autres méthodes telles que la R-T-P-C-R et la microscopie électronique en transmission peuvent être réalisées afin d'étudier la régulation de l'expression des gènes viraux associée aux compartiments de réplication virale et à l'ultrastructure de ces particules. Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la virologie des tumeurs à ADN pour explorer les mécanismes moléculaires qui altèrent la régulation du cycle cellulaire et favorisent la réplication virale dans les cellules humaines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les compartiments de réplication virale à partir des noyaux de cellules infectées afin de réaliser des études morphologiques, fonctionnelles et compositionnelles de ces structures induites par le virus.

N'oubliez pas que le travail avec un indicateur SAN peut être dangereux, et des précautions, telles que le port de protections auditives, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.