Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d'injection de lipopolysaccharide à l'augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l'imagerie de bioluminescence d'une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la mammite ou l’inflammation de la glande mammaire, et plus précisément de visualiser et de quantifier l’activité de NF Kary au sein d’une glande allaitante enflammée. Ceci est accompli en croisant d’abord une femelle NF Kappa b reporter transgénique avec un mâle de type sauvage. Huit jours après la naissance des petits, le lipopolysaccharide est introduit dans la glande allaitante de la femelle via une technique d’injection d’introduction, qui n’endommage pas toutes les plaies du site d’injection six heures après l’injection.

La souris subit une imagerie bioluminescente pour détecter l’activité de la luciférase dans la glande mammaire. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une activité significative de NF KB dans les glandes traitées au LPS grâce à l’utilisation de la méthode d’injection intracanalaire, suivie d’une imagerie bioluminescente. Le principal avantage de notre approche par rapport aux autres méthodes d’injection intracanalaire est que le site d’injection n’est en aucun cas endommagé.

C’est absolument essentiel si vous envisagez d’étudier l’inflammation associée à l’injection de LPS, car tout dommage au site ou au mamelon se superposerait et confondrait ces analyses. Des souris femelles positives pour le transgène NGL Reporter sont utilisées pour cette procédure. Un. Les femelles sont âgées d’au moins six semaines.

M les accouplent avec un mâle de type sauvage FVB par har et se reproduisant 15 jours après l’accouplement. Commencez à vérifier régulièrement les femelles pour détecter des signes de gestation, à savoir une grande circonférence saillante. Séparez les femelles gestantes dans leurs propres cages, et lorsque la dernière femelle devient enceinte, retirez le mâle de la cage de reproduction.

Une portée d’au moins six petits est nécessaire pour une lactation adéquate. Huit jours après la naissance d’une telle portée. Poursuivez avec le protocole.

La partie la plus difficile de la procédure est l’injection d’introduction elle-même. Avoir des mains stables et beaucoup de pratique aidera, mais des pièges peuvent toujours survenir. Soyez prêt à avoir plusieurs souris prêtes le jour de l’injection afin d’assurer le succès.

Commencez par diluer le lipopolysaccharide dérivé d’E. coli dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 0,1 microgramme par microlitre. 50 microlitres de cette solution de LPS seront injectés dans la glande mammaire. Préparez un deuxième tube de PBS seul à utiliser pour l’injection de contrôle.

À côté de l’étape de la lunette de dissection. Fixez un appareil à cône nasal pour administrer l’anesthésie. Préparez un éclairage lumineux de la scène à l’aide de projecteurs supplémentaires si nécessaire.

Une fois la configuration de la dissection prête, démarrez la machine à fluor isof et le flux d’air. Ensuite, chargez la seringue à insuline de calibre 31 avec 50 microlitres de solution LPS et mettez la seringue de côté pour les injections d’entraînement. Utilisez un colorant bleu triam dilué dans du PBS pour visualiser les résultats.

Ensuite, anesthésie la souris à injecter une fois que sa respiration a ralenti. Placez-le sur la platine et fournissez de l’isofluor via le cône nasal. Utilisez un pincement pour confirmer l’anesthésie complète tout au long de la procédure.

Surveillez le rythme respiratoire de la souris. Ajustez continuellement l’intensité du fluor pour la maintenir stable. Utilisez une petite goutte d’éthanol à 70 % pour aplatir les poils sur l’abdomen ventral de l’animal et localiser les mamelons.

Localisez le mamelon de la glande mammaire inguinale numéro quatre droite sur le bas-ventre avec de fines pinces dans la main non dominante. Retirez délicatement le mamelon de la peau. La pince ne doit jamais être serrée.

Seule une légère prise doit être appliquée sur le mamelon de la main dominante. Amenez la seringue préremplie dans le champ de vision et maintenez-la de manière à ce qu’il ne soit pas nécessaire de repositionner son contenu pour l’injection. Dirigez soigneusement l’aiguille vers la petite ouverture ductile au centre du mamelon.

Insérez environ un quart de l’aiguille dans le conduit sans repositionner. Injectez le contenu de la seringue pendant trois à cinq secondes. Retirez ensuite délicatement l’aiguille de la mamelon.

Chargez une deuxième seringue avec 50 micro-lâchers de PBS et répétez la procédure sur la gauche. Numéro quatre, mamelon de la glande mammaire inguinale à l’aide du contrôle PBS. Une fois les deux injections terminées, arrêtez l’anesthésie et déplacez la souris dans une cage de récupération.

La femelle devrait se déplacer dans les cinq minutes. Au bout d’une heure, ramenez-la dans une cage familiale avec ses bouffées. La souris doit être imagée six heures d’injection.

Pendant ce temps, surveillez la souris si des signes de détresse sont observés. Interrompez l’expérience et euthanasiez les souris à l’installation d’imagerie. Préparez-vous à anesthésier la femme à l’aide de fluor.

Assurez-vous que l’anesthésie s’écoule à la fois vers la boîte et la chambre d’imagerie. Placez la souris sous anesthésie au fluor dans la boîte d’anesthésie transparente. Une fois que la respiration a ralenti, utilisez un pour pincer pour confirmer que la souris est complètement anesthésiée.

Ensuite, injectez 100 microlitres de substrat Lucifer à travers une aiguille de calibre 26. Transférez immédiatement la souris dans la chambre d’imagerie après l’injection et fixez le cône nasal délivrant l’Isof Lorraine. Placez la souris en position couchée et fixez chaque pied à la scène avec du ruban adhésif opaque noir.

Entrez les paramètres appropriés dans le logiciel IVIS pour prendre à la fois une image photographique en lumière blanche et une image de l’activité bioluminescente. Le temps de pose doit être de 10 secondes une fois les images acquises. Suivez le même protocole de récupération que celui décrit pour la post-injection.

Les images photographiques et luminescentes sont automatiquement superposées et affichées à l’écran. Analysez les images acquises en plaçant des cercles de région d’intérêt ou de retour d’intérêt de taille égale de chaque côté du bas-ventre de la souris. L’une sur la glande injectée PBS et l’autre sur la glande injectée LPS.

Réglez l’affichage sur les photons. Un nombre doit être affiché indiquant la luminescence détectée dans chaque retour sur investissement, utilisez ce nombre dans l’analyse statistique pour afficher l’image optimale. Ajustez davantage le seuil du signal affiché.

Cela ne modifiera pas la lecture de la luminescence totale, mais permettra de supprimer le signal de fond lorsque le presse-étoupe injecté par PBS est libre du signal de fond. L’augmentation du signal dans la glande traitée au LPS devrait être apparente dans la pratique de l’image. Les injections ont été effectuées le 21e jour de lactation, lorsqu’il y a moins de production de lait et que le succès d’une injection peut être facilement visualisé par le bleu trian. Il y avait une accumulation de liquide au niveau du mamelon ou des tissus environnants.

L’injection réussie de LPS dans les canaux mammaires au huitième jour a entraîné une augmentation de l’activité NF KB dans la glande en raison de l’activité constitutive de NF KB dans le cerveau et d’autres organes abdominaux. Il y avait un signal de base cohérent avant toute manipulation. L’activité de la luciférase était nettement plus élevée dans la glande injectée LPS que dans la glande injectée PBS d’un groupe de quatre souris.

Une augmentation statistiquement significative de la luminescence dans les glandes traitées au LPS a été mesurée. Cette méthode peut donner un aperçu de l’inflammation des glandes mammaires. Il peut également être appliqué à d’autres domaines de recherche tels que la recherche sur le cancer.

Vous pouvez injecter des cellules cancéreuses ou des agents cancérigènes directement dans le canal mammaire.