Name: Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez une technique d'injection intracanalaire de LPS pour modéliser la mammite chez la souris lactante. Visualisez l'activité NF-κB par imagerie bioluminescente et quantifiez les réponses inflammatoires en temps réel.

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Ce travail a été financé par le NIH subvention accordée à CA113734 F Yull et le ministère des Affaires des anciens combattants (TS Blackwell).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par les soins des animaux Vanderbilt University institutionnel et Use Committee. 1. Préparation des souris transgéniques <ol><li> Chez les souris femelles, positifs pour le journaliste NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) transgène (décrit précédemment 1) sont utilisés pour cette procédure. Lorsque les femmes sont au moins 6 semaines d&#39;âge, les accoupler avec un mâle de type sauvage FVB. Harem reproduction peut être utilisé (jusqu&#39;à 4 femelles dans une cage avec 1 mâle). (S&#39;il vous plaît noter: des souris de souche FVB ont été utilisés pour l&#39;étude des souris de souche comme les plus sombres C57BL6 peuvent aussi être utilisés, mais ces souris doit être rasée avant l&#39;imagerie.). </li><li> À partir de 15 jours après l&#39;accouplement, les femelles vérifier régulièrement les signes de la grossesse (grande circonférence en saillie). Chaque femelle doivent être séparés une fois enceinte et le mâle retiré de la cage d&#39;élevage une fois que la dernière femelle devient enceinte. </li><li> Regardez les femelles séparés d&#39;uned notez la date de naissance lors d&#39;une litière apparaît. Une portée de 6 chiots au moins est nécessaire pour la lactation adéquate. Huit jours après la naissance de la litière, procéder avec le protocole (voir la figure 1 pour un schéma chronologique). </li></ol> 2. Préparation pour injection <ol><li> Dissoudre le E. LPS coli dans du PBS à une concentration finale de 0,1 ug / ul. 50 ul de cette solution, soit un total de 5 ug, sera injecté dans la glande mammaire. Préparer un second tube de PBS seul à être utilisé pour le contrôle d&#39;injection. </li><li> Mise en place d&#39;un microscope à dissection et de l&#39;équipement anesthésie à l&#39;isoflurane. Un appareil ogive doit être fixé au stade de la portée de dissection où la souris sera placé. Une bonne source de lumière, qu&#39;il s&#39;agisse du champ d&#39;application lui-même ou de projecteurs supplémentaires devraient également être préparés. </li><li> Une fois que l&#39;installation est terminée, démarrez la machine isoflurane et le débit d&#39;air. </li></ol> 3. Injection intra-canalaire de LPS <ol><li> Chargez la seringue à aiguille courte avec 50 ul de la solution de LPS. Mettre cela de côté. </li><li> Anesthésier la souris pour être injecté en plaçant d&#39;abord la femelle dans une boîte remplie isoflurane et puis une fois que la respiration est ralentie, la déplacer sur la scène et placez son nez dans le ogive. Utilisez un pincement de l&#39;orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Surveiller la respiration de la souris tout au long de la procédure et ajuster le niveau de l&#39;isoflurane en conséquence. La cage contenant la portée de chiots que la femelle a été prise à partir devraient être soigneusement mis de côté jusqu&#39;à ce que le barrage peut être retourné après la procédure. </li><li> Utilisez une petite goutte d&#39;éthanol à 70% pour rendre la couche à plat et pour aider à visualiser le mamelon attachée au droit n ° 4 glande mammaire inguinale sur le bas-ventre de la souris. </li><li> Faites la mise au microscope à dissection pour une vue optimale sur le mamelon. Soigneusement utiliser un ensemble de pinces fines pour mieux tirer sur le mamelon de la peau, mais ne pas percer ou de blesser le mamelon en aucune façon. Lapince ne doit jamais être étroitement serrées ensemble lors de la manipulation des tissus, mais utilisé avec une tenue légère qui exige le minimum de stress sur le mamelon. </li><li> Utilisez la pince à la main gauche pour tenir doucement le mamelon en place. Ramenez lentement la seringue préremplie dans le champ de vision avec la main droite. La seringue doit être maintenu de façon qu&#39;aucun repositionnement doit se produire afin d&#39;injecter du contenu. </li><li> Lorsque la seringue est en vue, viser soigneusement à la petite ouverture canalaire dans le centre du mamelon, et insérez la seringue. </li><li> Sans repositionner la main, injecter le contenu de la seringue et retirer l&#39;aiguille de la tétine. </li><li> Chargez une seconde seringue avec 50 ul de PBS pour l&#39;injection de commande. Repositionner la souris sur la scène et de la meilleure vue de la gauche N ° 4 mamelon glande mammaire inguinale de l&#39;autre côté du bas-ventre de la souris. Répétez les étapes 3,4 à 3,7 à l&#39;aide de la seringue PBS-chargé. </li><li> Une fois que les injections sont complEté, cesser l&#39;anesthésie et déplacez la souris dans une cage de récupération. Surveiller la femelle afin d&#39;assurer qu&#39;elle devient mobile dans les 5 min. Laissez la souris pour rester dans la cage de récupération pendant 1 heure. Après 1 heure de récupération, placez le dos femelle dans la cage avec sa portée de chiots. Les souris doivent être surveillés régulièrement pendant 6 heures après l&#39;injection avant de procéder à l&#39;imagerie. Dans notre expérience, pas de conséquences indésirables ont été observés dans les deux la femelle ou les chiots pendant la période entre l&#39;injection et l&#39;imagerie. Cependant, si les signes de détresse sont observées chez la femelle (par exemple une posture voûtée, mordre ou de gardiennage du site d&#39;injection, léthargie générale) ou les petits (pas de mouvement, la couleur bleutée de la peau), l&#39;expérience devrait être abandonnée. </li></ol> 4. Bioluminescent d&#39;imagerie pour visualiser l&#39;activité de NF-kB <ol><li> Une fois que les souris ont été transportés à l&#39;établissement d&#39;imagerie, commencer la procédure d&#39;imagerie en ouvrant le logiciel et l&#39;initialisation de la machine. Allumez l&#39;estMachine oflurane et du débit d&#39;air, en sorte que l&#39;anesthésie est fluide à la fois le boîtier et la chambre d&#39;imagerie. </li><li> Placez la souris sous anesthésie à l&#39;isoflurane dans la zone de l&#39;anesthésie clair. Une fois que la respiration s&#39;est ralentie, utilisez un pincement de l&#39;orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Puis, injecter 100 ml de substrat luciférine dans la souris par injection rétro-orbitale 5 à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile. </li><li> Transférer immédiatement la souris vers la chambre d&#39;imagerie et de placer son nez sous l&#39;isoflurane ogive qui s&#39;y trouvent. La souris doit être en position couchée. Fixez chaque pied de la scène avec du ruban adhésif. </li><li> Entrée des paramètres appropriés pour le logiciel IVIS de prendre à la fois une image de lumière blanche et d&#39;une image photographique de l&#39;activité bioluminescente. Le temps d&#39;exposition doit être de 10 sec. Acquérir l&#39;image. </li><li> Une fois que les images ont été acquises, permettent de récupérer la souris, puis placez le dos dans la cage avec ses chiots et de surveiller périodiquement. </li><li> La photographie et luminescentles images sont automatiquement superposées et affichées sur l&#39;écran, comme dans la figure 2. Analyser les images acquises par la mise région d&#39;intérêt ROI &quot;ou&quot; cercles de taille égale sur chaque côté du bas de l&#39;abdomen de la souris (une au-dessus de la glande PBS-injectée et une sur la glande LPS-injecté). Réglez la lecture à des photons. Un certain nombre devrait s&#39;afficher, indiquant la luminescence détectée à l&#39;intérieur de chaque ROI (voir la figure 2B). Utilisez ce numéro dans l&#39;analyse statistique. </li><li> Pour afficher une image optimale, ajuster encore le seuil du signal affiché. Cela ne modifie pas la luminescence totale de lecture, mais vous permettra de retirer signal de fond et de visualiser les différences entre le contrôle et la LPS-traitée glande. Diminuer la quantité de luminescence montre jusqu&#39;à ce que la glande PBS-injecté est exempt de bruit de fond. Cela devrait laisser le signal accrue dans la glande LPS-traitée encore visible dans l&#39;image, comme le montre la figure 2. </li><li> Additionaanalyse l, y compris les protéines et les analyses de l&#39;ARN, peut être complété par des tissus mammaires de la femelle recueillies post-mortem 6. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Pour obtenir des résultats interprétables par ces méthodes, le LPS (ou PBS) doit être perfusé uniquement dans les canaux galactophores, laissant intacts les tissus adjacents. L&#39;injection dans le tissu sous-cutané entourant le mamelon se traduira par une inflammation due à une blessure plutôt que l&#39;infection simulée. L&#39;injection de colorant bleu trypan dilué dans du PBS est utile lors de l&#39;apprentissage de la technique. Figure 3A montre une glande injecté avec succès infusé avec 100 pi de bleu trypan dans du PBS. Comme le montre, seul l&#39;arbre canalaire doit être rempli avec la solution injectée, et il ne devrait pas être bolus au site d&#39;injection. Un «bolus» dans ce contexte est une accumulation de liquide injecté au niveau du mamelon ou dans le tissu qui entoure le mamelon sans perfusion dans l&#39;arbre canalaire. C&#39;est shpropres à la figure 3B. S&#39;il vous plaît noter que les injections pratique montre la figure 3 ont été achevés en une femme au jour 21 de la lactation. Au plus fort de la lactation (jour 8-10, le stade auquel le LPS est injecté à l&#39;aide du protocole actuel), le lait est abondant et il est difficile de visualiser les conduits et déterminer si l&#39;injection a été effectuée correctement. Par conséquent, les points plus tard, le temps de l&#39;allaitement sont meilleurs pour la pratique des injections. Injection réussie de LPS dans les résultats des conduits mammaires chez augmenté l&#39;activité de NF-kB dans la glande. Cela devrait être évident chez la souris journaliste sur IVIS imagerie, et la glande LPS-injecté devrait avoir sensiblement plus forte activité luciférase (mesurée par comptage de photons) que la glande PBS-injecté, comme le montre la figure 2 (en moyenne, la glande LPS lit 200% du signal de commande PBS). Une augmentation statistiquement significative de la luminescence dans les glandes LPS traités comme un échantillonARED au contrôle controlatérale a été réalisé si la fin d&#39;un groupe de 4 souris 4. Une autre étude a également utilisé l&#39;injection intra-canalaire mammaire soit E. coli ou de LPS dans le NF-kB journaliste transgéniques. Semblable à notre propre travail, ces auteurs ont constaté une augmentation significative de l&#39;activité du rapporteur 6 heures après E. coli injection 2. S&#39;il vous plaît noter qu&#39;en raison constitutive de NF-kB activité dans le cerveau et d&#39;autres organes de l&#39;abdomen, la tête et l&#39;abdomen de souris nos reporters montrent régulièrement un signal lorsque imagé, même au départ, avant toute manipulation. Ainsi, ce signal doit être ignoré en ce qui concerne cette expérience. Un signal clair doit rester dans la glande mammaire LPS-injectée après la lecture d&#39;image est ajustée pour réduire la luminescence d&#39;arrière-plan dans la glande PBS. Figure 2 montre des images avec le fond réduit. Échec de l&#39;injection de la glande seraplus probable résultat d&#39;endommager le mamelon. Cela entraînera fait, la peau au niveau de l&#39;inflammation qui sera évident sur l&#39;imagerie. Ce type de signal blessure sera très forte et confinée à la région du mamelon où le dommage est survenu, n&#39;émanant pas toute la glande, comme on le voit, après une injection de LPS succès dans les conduits. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de procédure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie IVIS bioluminescente. (A) Acquisition de l&#39;image avec un fond réduit, révélant augmentation de l&#39;activité luciférase dans la glande LPS-injecté. (B) l&#39;image de A avec la région de quantifications d&#39;intérêt ajouté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3 d&#39;injection de pratique:.. Glande mammaire injection de colorant par injection intracanalaire Pour tester la précision de l&#39;administration par l&#39;intermédiaire du mamelon, une souris au jour 21 de la lactation a été injecté avec 100 ul de colorant bleu trypan dilué dans du PBS. Après le sacrifice, la glande a été exposé pour la visualisation. (A) d&#39;injection de succès et (B) un bolus de colorant à la tétine.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous utilisons une souris transgénique journaliste NF-kB et une technique d&#39;injection optimisé à la mammite modèle, une inflammation du tissu mammaire le plus souvent causée par une infection bactérienne. L&#39;étape la plus critique dans cette procédure est l&#39;injection intracanalaire lui-même. Dans la pratique, il est généralement difficile de déterminer si l&#39;injection intracanalaire a été couronnée de succès. L&#39;injection des agents (LPS ou PBS) devrait se sentir fluide...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide d&#39;Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sérotype 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 46-013 CM- </td><td></td></tr><tr><td> 31 seringue à insuline Gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Aiguille courte </td></tr><tr><td> Forceps </td><td> World Precision Instruments </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection portée </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell Isoflurane, USP </td><td> Minrad Inc pour Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 système d&#39;imagerie &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (anciennement Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Seringue pour injection luciférine </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciférine Firefly, monohydrate de sel de sodium (Substrat luciférine) </td><td> Chimie et Biologie Biosynth </td><td> L-8240 </td><td> Diluer à 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

injection intra-canalaire de lps comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique nf-kb reporter

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Les modèles animaux de maladies humaines sont nécessaires afin d&#39;étudier rigoureusement les étapes de progression de la maladie et des mécanismes connexes, et finalement, comme modèles pré-cliniques pour tester les interventions. Dans ces méthodes, nous décrivons une technique dans laquelle le lipopolysaccharide (LPS) est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon, mastite modélisation efficace, ou l&#39;inflammation, de la glande. Il en résulte une augmentation des infections simulées du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, tels que révélés par l&#39;imagerie de bioluminescence d&#39;une souris NF-kB rapporteur de la luciférase 1. Notre but ultime dans le développement de ces méthodes était d&#39;étudier l&#39;inflammation associée à la mammite dans la glande en lactation, qui comprend souvent des rougeurs, de l&#39;enflure et l&#39;infiltration de cellules immunitaires 2,3. Par conséquent, nous étions tout à fait conscients que l&#39;incision ou tout autre type de blessure de la peau, le mamelon, ou de la glande afin d&#39;introduire les LPS pourraitpas être utilisés dans nos méthodes comme l&#39;approche serait probablement confondre la lecture de l&#39;inflammation. Nous avons également souhaité une méthode straight-forward qui ne nécessitent pas spécialement conçus dessinés à la main pipettes ou l&#39;utilisation de micro-manipulateurs d&#39;organiser ces outils spécialisés en place. Ainsi, nous avons décidé d&#39;utiliser une seringue à insuline disponible dans le commerce et d&#39;injecter l&#39;agent dans le conduit mammaire d&#39;un mamelon intacte. Cette méthode a été un succès et nous a permis d&#39;étudier l&#39;inflammation associée à l&#39;injection de LPS, sans effets supplémentaires recouvertes par le processus d&#39;injection. En outre, cette méthode a également utilisé un NF-kB luciférase reporter souris transgénique et la technologie d&#39;imagerie bioluminescente pour montrer visuellement et quantitativement augmenté de signalisation NF-kB dans la glande LPS-injecté 4. Ces méthodes sont d&#39;intérêt pour les chercheurs de nombreuses disciplines qui souhaitent modèle de maladie dans la glande mammaire en lactation, en fin de compte, la techniquedécrit ici pourrait être utilisée pour l&#39;injection d&#39;un certain nombre de substances, et ne se limite pas au LPS seulement.

Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d&#39;injection de lipopolysaccharide à l&#39;augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l&#39;imagerie de bioluminescence d&#39;une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.

Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

Les modèles animaux de maladies humaines sont nécessaires pour étudier rigoureusement les stades de la progression de la maladie et les mécanismes associés, et à terme, en tant que...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la mammite ou l'inflammation de la glande mammaire, et plus spécifiquement de visualiser et de quantifier l'activité de NF Kary au sein d'une glande lactante enflammée. Cela est réalisé en croisant d'abord une femelle transgénique rapportant NF Kappa b avec un mâle de type sauvage. Huit jours après la naissance des petits, du lipopolysaccharide est introduit dans la glande lactante de la femelle par une technique d'injection introductive, qui ne lèse pas entièrement le site d'injection six heures après l'injection.La souris subit un examen d'imagerie bioluminescente afin de détecter l'activité de la luciférase dans la glande mammaire. En fin de compte, les résultats peuvent révéler une activité importante de NF-κB dans les glandes traitées au LPS grâce à la méthode d'injection intraductale, suivie d'une imagerie bioluminescente. Le principal avantage de notre approche par rapport à d'autres méthodes d'injection intraductale est que le site d'injection n'est endommagé d'aucune manière.Ceci est absolument essentiel si vous prévoyez d'étudier l'inflammation associée à l'injection de LPS, car tout dommage au site ou au mamelon superpo

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Source : Radulovic, K., et al. Injections de lipopolysaccharides dans des souris pour imiter l’entrée de produits d’origine microbienne après une rupture de la barrière intestinale. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo présente une procédure étape par étape pour injecter des lipopolysaccharides (LPS) intrapéritonéalement chez des souris afin d’induire une inflammation systémique.

Injection intrapéritonéale de lipopolysaccharides bactériens chez la souris pour étudier les réponses immunitaires systémiques

Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Ce protocole actuel utilise des rapporteurs fluorescents, le marquage in vivo et des techniques d’imagerie intravitale pour permettre la surveillance du processus dynamique d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

La méthode décrite ici permet la visualisation de l'activation de l'inflammation dépendante du promoteur de l'IL-8 dans les poumons de la souris par une imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Le même animal peut être soumis à BLI à plusieurs reprises pendant jusqu'à deux mois à partir du moment de la livraison de la construction de journaliste de luciférase.

Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Un protocole pour simuler l’entrée de composés d’origine bactérienne après rupture de la barrière intestinale est présenté ici. Une faible dose de lipopolysaccharide a été injectée systémique chez la souris, qui ont été observées pendant l’injection après 24 h. L’expression des cytokines pro-inflammatoires était déterminée à plusieurs moments dans la rate, du foie et du colon.

Injections de lipopolysaccharides dans souris pour imiter l’entrée des produits d’origine microbienne après rupture de la barrière intestinale

Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l'injection intraductale de l'adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d'organe d'événements oncogènes d'une manière contrôlée temporellement.

Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Ici, nous décrivons une méthode simple de formation image confocale pour visualiser la localisation in situ des cellules sécrétant le gamma d'interféron de cytokine dans les organes lymphoïdes secondaires murines. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation d'autres cytokines dans divers tissus.

Imagerie de la production gamma d'interféron in situ dans la rate de souris suite à l'infection à Listeria monocytogenes

Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.

Induction de modification des cellules leptomeningeales par injection intracisterale

Une méthode d’injection intracanalaire de réactifs pour une solution ablative à base d’éthanol dans l’arbre canalaire mammaire de la souris pour l’imagerie in vivo et la prévention du cancer du sein est décrite. L’injection directement dans l’ouverture du mamelon permet de cibler les cellules épithéliales mammaires avec un minimum de dommages aux tissus collatéraux.

Administration intracanalaire et visualisation aux rayons X d’une solution ablative à base d’éthanol pour la prévention et le traitement local du cancer du sein dans des modèles murins

Le présent protocole décrit l’injection intracanalaire de vecteurs viraux via la tétine pour délivrer des gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires.

In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire

Découvrez une technique d'injection intracanalaire de LPS pour modéliser la mammite chez la souris lactante. Visualisez l'activité NF-κB par imagerie bioluminescente et quantifiez les réponses inflammatoires en temps réel.

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Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

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