Name: Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:21:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Apprenez à établir un modèle orthotopique de cancer colorectal chez la souris pour étudier la progression tumorale et tester de nouveaux agents thérapeutiques. Cette méthode offre des résultats plus pertinents que les modèles sous-cutanés traditionnels.

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Département de chirurgie, Université de Californie à San Francisco Raymond Shaheen, MD

Préparation des cellules I. <ol><li> Cellules du cancer colorectal sont mis en culture et récoltés lors subconfluentes. </li><li> Une suspension cellulaire unique est préparé en tampon phosphate salin et conservé sur glace. </li></ol> II. Préparation tumeur <ol><li> Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié. </li><li> La tumeur est enlevée sous-cutanée à l&#39;aide technique stérile et divisées en 2-3 morceaux mm </li><li> Les morceaux de tumeur sont conservés dans un tampon phosphate salin sur la glace. </li></ol> III. Préparation de la souris Remarque: Dans notre laboratoire, nous utilisons inhalation d&#39;isoflurane à anesthésier la souris, ou alternativement, on peut utiliser des anesthésiques injectables pour obtenir le même effet <ol><li> La profondeur de l&#39;anesthésie est évaluée à l&#39;aide pincement de l&#39;orteil. Il ne faut pas retirer reflex avec pincement de l&#39;orteil. </li><li> Les antibiotiques peuvent être donnés à ce point. </li><li> La souris anesthésiées, qui a été préalablement rasée, est correctement positionné. </li><li> L&#39;abdomen est préparée avec une solution de Betadine. </li><li> L&#39;abdomen et du site opératoire sont drapées d&#39;une manière stérile. </li></ol> IV. Laparotomie <ol><li> Une petite incision est faite dans la peau </li><li> La musculature paroi abdominale est saisi et soulevé </li><li> La cavité abdominale est entré et une seule lame des ciseaux est utilisé pour pousser le contenu intra-abdominal suite </li><li> L&#39;incision est prolongée à 2-3 cm </li></ol> Exposition V. du cæcum <ol><li> Le caecum avec sa pochette finissant aveugle est identifié et extériorisé </li><li> Le cæcum est isolé du reste de la souris en utilisant une pré-coupés, gaze stérile </li><li> Saline chaude est utilisée pour conserver l&#39;humidité du caecum </li></ol> VI. L&#39;injection de cellules dans le mur caecum <ol><li> Un G 27 ou une aiguille fine est utilisée pour injecter un volume de 50 ul de cellules dans le mur caecal </li><li> L&#39;aiguille est retirée </li><li> Le site d&#39;injection est inspecté pour s&#39;assurer qu&#39;aucun des fuites </li><li> Le caecum est retourné à la cavité abdominale </li></ol> VII. La transplantation de la tumeur sur le caecum Remarque: En plus de l&#39;injection de cellules dans le mur caecal, une approche alternative consiste à transplanter des tumeurs sur le cæcum <ol><li> Un chiffre de 8 points est placé sur le caecum en utilisant 6-0 ou 7-0 de suture de taille </li><li> Le mur du cæcum est légèrement endommagé </li><li> Ensuite, la pièce tumeur est positionné </li><li> Le point est lié bas </li><li> Le caecum est retourné à la cavité abdominale </li></ol> VIII. Fermeture de la paroi abdominale de souris et de récupération <ol><li> Le mur de la souris abdominale est refermée en utilisant trois points de suture interrompue en utilisant 3-0 ou 4-0 de suture de taille </li><li> Alternativement, on peut utiliser un simple point courir </li><li> Post-opératoire des analgésiques et un bolus de liquide peut être donnée à ce stade </li><li> La souris est autorisé à remettre de l&#39;anesthésie. </li></ol> Remarque: avec des anesthésiques inhalés cela prend généralement 30 secondes IX. Résultats - tumeur primitive et métastase hépatique <img src="/files/ftp_upload/old/484_2008_2_11_8/A.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/old/484_2008_2_11_9/B.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/old/484_2008_2_11_10/C.png" alt="" /> Tumeur primitive - montré in situ (A) et avec des preuves de la néovascularisation (B); sur la coloration H &amp; E, les tumeurs sont localement invasives (C) <img src="/files/ftp_upload/old/484_2008_2_11_11/D.png" alt="" /> Métastases hépatiques - montré ex vivo (D)

<ol><li>Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+colorectal+cancer+and+liver+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Surg%22%5BJournal%5D)">Mouse models of colorectal cancer and liver metastases.</a> Dig Surg. 22, 16-25 (2005).</li>
<li>Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+colorectal+cancer+and+its+metastases+in+rodent+models%3A+comparative+aspects+with+those+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans.</a> Comp Med. 50, 16-26 (2000).</li>
<li>Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+ectopic+organ+environments+differentially+influence+the+sensitivity+of+murine+colon+carcinoma+cells+to+doxorubicin+and+5-fluorouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil.</a> Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).</li>
<li>Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-rectal+injection+of+tumor+cells%3A+a+novel+animal+model+of+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer.</a> Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).</li>
</ol>

Bien que des modèles de souris de tumeurs sous-cutanées sont faciles à établir et à surveiller, il est clair que ce modèle ne peut pas répliquer le site original anatomique du cancer colorectal. En raison de la différence dans le micro, les cellules du cancer colorectal poussant sous la peau a été démontré que le changement de leur phénotype et échouent presque toujours au progrès et à métastaser 1,2. En fait, la réponse tumorale au traitement peut varier considérablement selon que les cellules cancéreuses sont implantées dans un...

<table><tbody><tr><td>Milieux de culture cellulaire et composants</td><td></td><td></td><td>varient selon la lignée cellulaire utilisée</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>BioWhittaker</td><td>17-512F</td><td>également vendue par plusieurs autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation de 15 mL, en polypropylène</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 6 puits avec couvercle</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à iris, droites, à extrémités striées</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>il est préférable d'avoir une paire de ces instruments</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection à iris, droits, effilés</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille (ordinaire)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14109</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille (Castroviejo)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14137</td><td></td></tr><tr><td>Cidex Plus</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>7364</td><td>les instruments doivent être stérilisés périodiquement en autoclave, mais peuvent également l'être par trempage dans du Cidex</td></tr><tr><td>Fil de suture 6-0 ou 7-0</td><td></td><td></td><td>pour le caecum ; gracieuseté du Département de chirurgie, UCSF</td></tr><tr><td>Fil de suture 3-0 ou 4-0</td><td></td><td></td><td>pour la paroi abdominale ; gracieuseté du Département de chirurgie, UCSF</td></tr><tr><td>Machine à anesthésie / Isoflurane</td><td>J.A. Baulch and Associates</td><td>3206</td><td>également vendue par plusieurs autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Plaque chauffante jetable, 6&quot; x 6&quot;</td><td>Prism Technologies</td><td>20419</td><td></td></tr><tr><td>Ruban orange, 13 mm x 13 m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15901F</td><td>pour immobiliser la souris anesthésiée</td></tr><tr><td>Tondeuse Pro-Cord/Cordless Trimmer</td><td>Oster Professional Products</td><td>78997-010</td><td>pour raser le pelage de la souris</td></tr><tr><td>Bétadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>peut également être achetée dans n'importe quel magasin de fournitures médicales</td></tr><tr><td>Compresse 2 x 2, 3 plis</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>7635</td><td>peut également être achetée dans n'importe quel magasin de fournitures médicales</td></tr><tr><td>Champ stérile, barrière, 16&quot; x 29&quot;</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>0905</td><td>peut également être acheté dans n'importe quel magasin de fournitures médicales</td></tr><tr><td>Applicateurs à embout coton, 6&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-960-3Q</td><td>peuvent également être achetés dans n'importe quel magasin de fournitures médicales</td></tr><tr><td>Seringue de 10 cc, embout Luer lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 cc, tuberculine, embout lisse</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 27 1/2 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Le modèle de tumeur sous-cutanée traditionnelle est de moins de idéales pour étudier le cancer colorectal. Des modèles de souris orthotopique de cancer colorectal, qui disposent de plus en plus les cellules cancéreuses à leur emplacement naturel, de reproduire la maladie humaine avec une grande fidélité. Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle. Les deux techniques sont similaires et nécessitent une anesthésie de la souris et la laparotomie pour l&#39;exposition du caecum. Une technique consiste à injection d&#39;une suspension de cellules du cancer colorectal dans le mur caecal. Les cellules cancéreuses sont d&#39;abord mises en culture, récoltés quand subconfluentes et préparée comme une suspension cellulaire unique. Un petit volume de cellules est injecté lentement pour éviter les fuites. L&#39;autre technique consiste à la greffe d&#39;un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié et la tumeur est enlevée en utilisant une technique stérile. La pièce est divisée tumorale en petits morceaux pour la transplantation d&#39;une autre souris. Avant la transplantation, le mur du cæcum est légèrement endommagé afin de faciliter l&#39;infiltration des cellules tumorales. Le temps de développer des tumeurs primaires et des métastases hépatiques varie en fonction de la technique, la lignée cellulaire, et des espèces de souris utilisée. Ce modèle de souris orthotopique est utile pour étudier l&#39;évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle: l&#39;injection d&#39;une suspension de cellules cancéreuses dans le mur caecal ou la transplantation d&#39;un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Ce modèle est utile pour étudier l&#39;évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Le modèle traditionnel de tumeur sous-cutanée est loin d'être idéal pour l'étude du cancer colorectal. Les modèles murins orthotopiques du cancer colorectal, qui présentent...

Bonjour, je m'appelle William Sang. Je travaille au laboratoire du Dr Edgar Engelman au sein du service d'anatomie pathologique de l'Université Stanford. Je suis également interne en chirurgie à l'Université de Californie à San Francisco.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment établir un modèle orthotopique de cancer colorectal chez la souris. Ce modèle est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et pour tester de nouveaux agents thérapeutiques contre ce cancer. Cela contraste avec le modèle tumoral sous-cutané traditionnel.Le modèle de tumeur sous-cutanée est moins que parfait, car les cellules tumorales qui se développent sous la peau présentent souvent un phénotype altéré et échouent fréquemment à progresser et à métastaser. En réalité, la réponse tumorale au traitement peut varier considérablement selon que les cellules tumorales sont implantées à un emplacement sous-cutané ou orthotopique. Deux techniques peuvent être utilisées pour établir un modèle murin orthotopique de cancer colorectal.Une technique consiste à injecter une suspension de cellules de cancer colorectal dans la paroi du SQL. L'autre technique consiste à transplanter un fragment de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Les deux techniques sont similaires et impliquent les étapes suivantes : premièrement, la préparation des cellules ou de la tumeur.Deux, préparation de la souris, laparotomie et exposition du cæcum. Trois, injection de cellules ou transplantation de tumeur, et quatre, fermeture de la paroi abdominale de la souris et période de récupération. Commençons.Pour la procédure d'aujourd'hui, nous disposons de plusieurs instruments différents. Il s'agit de pinces, de ciseaux, d'un porte-aiguille ordinaire et d'un porte-aiguille Castro Viejo. Et, chose importante pour la procédure, nous avons un morceau de gaze stérile pré-découpé.Les cellules de cancer colorectal sont cultivées in vitro et récoltées lorsqu'elles sont subconfluentes ; une suspension monocellulaire est préparée dans du chlorure de sodium tamponné au phosphate et maintenue sur glace. Un animal présentant une tumeur colorectale sous-cutanée préalablement établie est euthanasié. La tumeur sous-cutanée est retirée selon une technique stérile et divisée en fragments de deux à trois millimètres.Les fragments de tumeur sont conservés dans du sérum physiologique tamponné au phosphate sur de la glace. Dans notre laboratoire, nous utilisons un anesthésique inhalé, l'isoflurane. En alternative, on peut utiliser des anesthésiques injectables pour obtenir le même effet.La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide d'une pincée plantaire. Il ne devrait pas y avoir de réflexe de retrait en réponse à la pincée plantaire. Des antibiotiques peuvent être administrés à ce stade.La souris anesthésiée, préalablement rasée, est correctement positionnée. L'abdomen est préparé trois fois avec une solution de Bétadine, puis l'abdomen et le site chirurgical sont recouverts de champ stérile. Une petite incision est pratiquée dans la peau.La musculature de la paroi abdominale est greffée et soulevée. La cavité abdominale est ouverte et une seule lame des ciseaux est utilisée pour repousser les contenus intra-abdominaux. L'incision est étendue à deux à trois centimètres.Le caecum, avec son sac à extrémité fermée, est identifié et extériorisé. Le caecum est isolé du reste de la souris. À l'aide d'une gaze stérile préalablement découpée, du sérum physiologique tiède est utilisé pour maintenir le caecum humide.Une aiguille de calibre 27 ou plus fine est utilisée pour injecter un volume de 50 microlitres de cellules dans la paroi SQL. L'aiguille est retirée. Le site d'injection est inspecté afin de s'assurer qu'il n'y a pas de fuite ; en complément de l'injection de cellules dans la paroi SQL, une approche alternative consiste à greffer la tumeur sur le caecum.Un point en huit est placé sur le caecum à l’aide d’un fil de suture de calibre 6-0 ou 7-0. La paroi du côlon sigmoïde est légèrement endommagée. Ensuite, le fragment tumoral est correctement positionné.Le point est noué. Le sécum est replacé dans la cavité abdominale. La paroi abdominale de la souris est fermée à l’aide de trois points séparés réalisés avec un fil de calibre 3/0 ou 4/0.Alternativement, on peut utiliser un point de suture simple, administrer des analgésiques postopératoires et une bolus de liquide. À ce stade, on laisse la souris se réveiller de l'anesthésie avec des anesthésiques inhalés. La souris se réveille généralement de l'anesthésie en moins de 30 secondes.J'ai juste montré comment établir un modèle murin orthotopique de cancer colorectal. Le délai de développement des tumeurs primitives et des métastases hépatiques dépendra de la technique utilisée, de la lignée cellulaire employée et de l'espèce de souris utilisée. Ce modèle est utile pour étudier la progression naturelle du cancer colorectal et pour tester de nouvelles thérapies contre ce cancer.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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