Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter soit la liaison de protéines de liaison à l’ADN telles que les facteurs de transcription, soit les modifications de ses calculs. Ceci est réalisé en préparant d’abord la chromatine dans un deuxième temps. Une réaction d’immunoprécipitation de la chromatine est mise en place pour extraire les fragments d’ADN liés à la protéine d’intérêt.

Ensuite, le fragment d’ADN lié à la protéine d’intérêt est amplifié par PCR. Des résultats sont obtenus qui montrent l’enrichissement du fragment d’ADN lié à la protéine d’intérêt par rapport à une région non liée sur la base de l’analyse QPCR. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la transcription, de la chromatine et de l’épigénétique, telles que quand et où différentes protéines modifiées ou non modifiées sont présentes.

Sur l’ADN Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation des gènes des cellules T. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les lymphocytes B, les échantillons de leucémie et les lignées de cellules immortalisées. La chromatine de cette expérience sera préparée à partir de cellules CD quatre cellules T naïves de souris.

Pour commencer cette procédure, ajoutez 37 % de formaldéhyde à une concentration finale de 1 % à la suspension de cellules T CD quatre dans du DMEM et secouez doucement à température ambiante pendant 15 minutes. Cela permettra de réticuler les complexes protéiques de l’ADN. Arrêtez la réticulation en ajoutant une molaire de glycine à une concentration finale de 125 millimolaires.

Continuez à bercer pendant cinq minutes à température ambiante. Prélever les cellules par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans cinq millilitres de PBS glacé contenant des inhibiteurs de protéase centrifugez à nouveau, lavez les cellules de cette manière pour un total de trois fois après le lavage final, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de lyse cellulaire glacé contenant des inhibiteurs de protéase.

Transférez la suspension cellulaire dans un microtube à centrifuger de 1,7 millilitre et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Prélever les noyaux par centrifugation à 200 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter soigneusement le surnageant, remettre les noyaux en suspension dans 500 microlitres de lyse nucléaire.

Le tampon contenant des inhibiteurs de protéase incube sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, sonicez les cellules à l’aide d’une sonde de 1,6 millimètre et d’un niveau de sortie de quatre sonicates pendant 15 secondes. Refroidissez l’échantillon sur de la glace pendant une à deux minutes pour éviter la surchauffe et sonifiez à nouveau pendant 15 secondes.

Répétez la sonication et le refroidissement pour un total de quatre fois la centrifugeuse, la chromatine sonique à 16 000 G pendant cinq minutes. À quatre quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant transparent dans un nouveau microtube à centrifuger.

Prélever une aliquote de 20 microlitres de surnageant transparent. Ajouter un colorant de chargement d’ADN et vérifier l’ADN soniqué par électrophorèse à travers un gel agro à 2 %. La taille idéale de l’ADN soniqué pour la plupart des applications est de 200 à 500 paires de bases.

Enfin, déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. La chromatine cisaillée peut être utilisée immédiatement pour mettre en place une réaction d’immunoprécipitation de la chromatine ou stockée à moins 80 degrés Celsius pour l’immunoprécipitation de la chromatine ou la chromatine sonique diluée par puce à une concentration d’ADN de cinq à 10 microgrammes par millilitre dans un volume total de deux millilitres dans un tampon de dilution de puce avec inhibiteurs de protéase. Toutes les étapes de cette procédure doivent être effectuées entre zéro et quatre degrés Celsius.

Économisez 10 %, soit 200 microlitres dans cet exemple de la chromatine sonicée diluée comme entrée stocke sur glace de l’aliquote de l’échantillon restant 450 microlitres dans chacun des quatre tubes de microvision de 1,7 millilitre étiquetés comme contrôle d’isotype et anticorps d’intérêt. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisés, un seul contrôle d’isotype sera suffisant Pour effectuer cette analyse, ajoutez deux à cinq microgrammes d’anticorps spécifiques en fonction de la spécificité de l’anticorps utilisé ou du contrôle d’isotype dans les tubes respectifs. Secouez les tubes pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre la formation de complexes d’anticorps de chromatine le lendemain matin.

Ajoutez 25 microlitres de billes magnétiques de protéine G à chaque mélange et bercez pendant au moins deux heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, placez les tubes fuges sur un support magnétique pendant 15 à 20 secondes pour permettre aux billes de s’accumuler du côté aimanté. Retirez délicatement la solution par aspiration sans déranger les billes.

Ajoutez un millilitre de solution de lavage à faible teneur en sel et basculez doucement pendant cinq minutes sur le mutateur. Récupérez les billes à l’aide du support magnétique et retirez la solution de lavage. Ajoutez à nouveau un millilitre de solution de lavage à faible teneur en sel et secouez doucement pendant cinq minutes.

Après avoir retiré la solution de lavage à faible teneur en sel, ajoutez un millilitre de solution de lavage à haute teneur en sel et faites basculer pendant cinq minutes. Récupérez les billes à l’aide du support magnétique et retirez la solution de lavage. Répétez le lavage avec la solution de lavage à haute teneur en sel.

Une fois retirée la solution de lavage à haute teneur en sel, ajoutez un millilitre de solution de lavage au chlorure de lithium et basculez pendant cinq minutes. Récupérez les billes à l’aide du support magnétique et retirez la solution de lavage. Répétez une fois le lavage au chlorure de lithium.

Ajoutez un millilitre de solution TE et basculez pendant cinq minutes. Récupérez les billes à l’aide du support magnétique et retirez la solution de lavage. Éluez l’ADN des billes en ajoutant 250 microlitres de roche tampon elucien pendant 15 minutes à température ambiante.

Retirez l’EIT et enregistrez ce matériau dans un nouveau tube de fuge de 1,7 millimètre. Répétez l’opération une fois de plus et combinez les deux elu, jetez les perles pour inverser les liaisons transversales. Ajoutez à l’ADN éludé cinq molaires de chlorure de sodium pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire et un microlitre d’ARN.

A ajouter 400 microlitres de tampon d’élution aux entrées enregistrées précédemment. Pour faire le volume de 500 microlitres à chaque entrée, ajoutez du chlorure de sodium à 0,3 molaire, un microlitre d’ARN, 10 microlitres d’EDTA 0,5 molaire, 20 microlitres d’une molaire, un pH HCL de 6,5 et un microlitre de protéinase K.Scellez les tubes et incuberez-les pendant la nuit à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant sec le lendemain matin, Laissez les tubes refroidir à température ambiante. Ajoutez ensuite un millilitre d’éthanol à 100 % et laissez incuber pendant deux heures jusqu’à toute la nuit à moins 80 degrés Celsius.

Pour précipiter la centrifugeuse à ADN, les tubes à 16 000 G pendant 15 minutes. Pour granuler le lavage de l’ADN, la pastille d’ADN une fois avec 70 % d’éthanol et sécher à l’air, la pastille de réactivation, la pastille d’ADN dans 100 microlitres d’eau distillée en autoclave, purifier l’ADN à l’aide d’un kayak, de colonnes de rotation rapide et d’éluer dans un volume total de 50 microlitres de tampon d’élution. Cet ADN est maintenant prêt à être utilisé pour l’amplification par PCR.

L’analyse des réserves de QPCR pour obtenir un enrichissement complet sur une région de contrôle non liée est l’aspect le plus important de ce protocole. À l’aide du logiciel QPCR, rendez-vous dans l’éditeur et marquez les puits contenant des échantillons d’entrée de différentes dilutions avec leurs valeurs de courbe standard. Étiquetez également les puits avec des échantillons de puces inconnus exactement comme la plaque PCR est disposée.

L’utilisation d’une courbe standard pour interpoler les quantités d’ADN dans les échantillons spécifiques et isotypes inconnus permet d’évaluer et d’apparier la qualité et l’efficacité de tous les ensembles d’amorces sur la gamme de concentrations trouvées dans les échantillons. Accédez à l’éditeur de sous-ensembles et marquez les sous-ensembles, y compris les puits avec des échantillons d’entrée ainsi que les échantillons de puces inconnus. Les échantillons inconnus seront quantifiés à l’aide de la courbe standard générée à partir des concentrations connues des échantillons d’entrée pour l’analyse.

Une fois l’amplification PCR terminée, effectuez l’analyse avec ABS quant. Dérivée seconde max. Sélectionnez le sous-ensemble à analyser et appuyez sur. D’accord.

Appuyez sur calculer, ce qui générera la courbe standard en utilisant les concentrations connues des échantillons d’entrée et affichera la quantité absolue d’ADN présente dans les échantillons inconnus si la qualité de l’ADN est bonne et si les amorces se lient spécifiquement à la région ciblée, l’efficacité de la PCR devrait être proche de deux. Effectuez une analyse de la courbe de fusion avec TM appelant le même sous-ensemble si disponible. Un seul pic indique qu’un seul produit spécifique a été amplifié.

L’amplification d’ADN spécifique peut également être testée par électro le produit PCR, ainsi que l’échelle d’ADN à travers un gel AROS. Les données obtenues sont ensuite exportées sous la forme d’un fichier texte délimité par des tabulations, qui peut être ouvert dans Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie. Divisez la quantité d’ADN pour l’anticorps spécifique avec le contrôle de l’isotype pour les amorces ciblées.

Répétez cette étape pour la région de contrôle Amorces. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisés pour différentes immunoprécipitations, normalisez chacun d’entre eux avec les valeurs du même isotype de contrôle. De plus, si plusieurs paires d’amorces ciblées sont utilisées, les quantités d’ADN d’un seul ensemble de réparation d’amorces de contrôle doivent être utilisées pour la normalisation de chaque cible.

Les valeurs de sortie représentent l’enrichissement du pli de l’immunoprécipitation de l’anticorps spécifique à chaque emplacement par rapport à l’immunoprécipitation de fond de l’anticorps non spécifique Divisez l’enrichissement du pli pour les amorces ciblées par l’enrichissement du pli pour les amorces de la région de contrôle afin d’obtenir l’enrichissement par rapport à une région non liée du contrôle. Il est important de noter qu’en raison de la génération de courbes standard avec l’ADN d’entrée total pour chaque échantillon, chacune des valeurs d’immunoprécipitation interpolées à partir de l’étalon est déjà normalisée et exprimée comme la fraction de l’entrée totale par le logiciel de la machine. Le protocole d’immunoprécipitation de la chromatine démontré ici contrôle les différences, le cas échéant, dans la quantité d’ADN utilisée dans la PCR grâce à l’utilisation d’une paire d’amorces qui amplifie une région non liée du génome, servant ainsi de contrôle de charge.

Dans cet exemple, la région codante du gène de l’actine bêta de la souris a été utilisée comme région non liée à la protéine d’intérêt et le facteur de transcription et le site de liaison à la graisse sur la souris, le promoteur IL two a été utilisé comme région cible. Cet instantané d’une feuille de calcul Excel illustre l’utilisation du protocole de calcul décrit dans les données d’analyse à partir de trois répétitions expérimentales dans les cases colorées en jaune, vert et violet avec trois répétitions techniques. Chacun a été utilisé pour calculer l’enrichissement des plis.

L’enrichissement relatif d’une protéine liée à différentes régions du génome peut être comparé si le même ensemble de contrôle d’isotype et d’anticorps spécifiques est choisi. Si la spécificité de l’anticorps est bonne, un enrichissement de deux à dix fois sur la région de contrôle non liée est généralement observé. Cette figure montre les résultats d’une expérience sur puce avec des cellules T CD quatre conventionnelles et des cellules T CD quatre régulatrices isolées de souris.

Une petite fraction des lymphocytes T conventionnels a été stimulée avec de la PMA et de la mycine ionique pendant 30 minutes. Un enrichissement relatif des facteurs de transcription NFA, N fat C un et NFA C deux au promoteur IL deux, a été observé et est représenté ici comme un enrichissement par plis sur une région non liée suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que le ChIP-seq peuvent être utilisées afin de traiter l’occupation globale des facteurs de transcription ou les changements globaux des marques épigénétiques en réponse à un stimulus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une immunoprécipitation de la chromatine à l’aide d’un nombre limité de cellules, et d’analyser les données QPCI pour déterminer la bande du facteur de transcription par rapport à une région non liée de contrôle.