Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes Plasmodium berghei ANKA-souris infectées

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les leucocytes inflammatoires adhérents des vaisseaux sanguins du cerveau de souris infectées par Plasmodium Burge Eye et Anca afin d’induire un paludisme cérébral expérimental. Les souris sont infectées par des globules rouges parasités par injection. Une fois que les souris commencent à montrer des signes de maladie, les cellules circulantes des souris infectées par le paludisme sont éliminées par perfusion intrabuccale.

Les cerveaux sont ensuite prélevés et le tissu est digéré avec des enzymes pour permettre l’isolement des leucocytes inflammatoires. Une cytométrie en flux multicolore est ensuite réalisée pour l’immunophénotype. L’analyse des données résultantes révèle le pourcentage et le nombre absolu de leucocytes migrant vers le cerveau de souris infectées par le paludisme.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse du paludisme, telles que le type de cellules inflammatoires qui migrent vers le site de séquestration du parasite dans le cerveau d’animaux infectés dans différentes conditions expérimentales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Les étapes de perfusion sont difficiles à apprendre car elles nécessitent à la fois de la rapidité et du soin pour ne pas endommager les vaisseaux sanguins importants. Leanna Mcic, technicienne animale, Mme Victoria, Rick, étudiant au doctorat, et le Dr Lisa Aez, postdoctorante de mon laboratoire, démontreront certaines parties de cette procédure.

Commencez ce protocole en infectant les souris avec p berge eye anca defrost, une aliquote cryoconservée de cellules rouges parasitées ou pbcs en lui permettant de revenir à température ambiante. Retirez une souris donneuse de huit à 12 semaines de sa cage et placez-la sur un poste de travail. Saisissez la peau du cou entre l’index et le pouce.

Retournez la souris et injectez 100 à 200 microlitres de plasmodium berge oculaire dans la cavité péritonéale. Régulièrement, deux souris donneuses reçoivent des injections de PBC. Après l’injection, placez les souris dans leur cage quatre à cinq jours après l’infection.

Retirez une souris donneuse de sa cage et placez-la sur un poste de travail. Placez une goutte de sang de la veine de la queue de la souris près de l’extrémité d’une lame de microscope à extrémité givrée. Placez une deuxième diapositive à un angle de 45 degrés et reculez-la dans la goutte de sang.

Une fois que le sang se répand le long du bord, poussez uniformément la lame d’écartement sur la lame du microscope pour faire couler le sang. Laissez le frottis sécher à l’air libre pour fixer les frottis sanguins. Immergez les lames dans du méthanol à 100 % pendant 30 secondes.

Ensuite, colorez les lames dans GIM ZA fraîchement préparé pendant 10 minutes après la coloration avec gim za, rincez la lame à l’eau courante pendant 30 secondes. Laissez la lame sécher à l’air, puis examinez-la au microscope à l’aide de la lentille à immersion dans l’huile 100x. Énumérez le PRBC à moins d’un millier d’érythrocytes et calculez le pourcentage para si la souris donneuse a atteint les niveaux requis de 2,5 à 5 %Parsit Prélevez le sang de la souris donneuse par ponction cardiaque sous anesthésie ou saignement rétroorbitaire à l’aide d’un tube capillaire à micro-hématocrite hépariné.

Dissoudre le sang dans le milieu RPMI à une concentration finale de un fois 10 à six PRBC par 0,2 millilitre par souris. Considérez qu’un hématocrite de souris normal est d’environ six fois 10 à 9 globules rouges par millilitre. En fait, des souris expérimentales C 57 noires de huit à 12 semaines en injectant une fois 10 au sixième PRBC dans 0,2 millilitres intrapéritonéale comme auparavant.

Pour surveiller les niveaux de para des souris infectées, préparez un frottis sanguin comme précédemment. Para doit être déterminé tous les deux à trois jours à partir du deuxième jour ou du troisième jour après l’infection à partir du cinquième jour. Après l’infection.

Les souris sont surveillées quotidiennement pour détecter des signes de paludisme grave une fois que les niveaux de para sont supérieurs à 5 % et les souris présentent des symptômes neurologiques environ six jours après l’infection. Les souris infectées sont euthanasiées par inhalation de CO2 et immédiatement perfusées avec du PBS, comme décrit dans le document d’accompagnement. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la perfusion intracardiaque.

Une série de conseils de dépannage est décrite ici : avec la souris épinglée sur une planche de dissection en polystyrène. Dans un plateau de dissection. Essuyez la face ventrale avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez de grands ciseaux et des pinces pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane afin d’exposer la cavité thoracique, pliez et épinglez la peau sur les côtés.

Tenez le sternum avec une pince fine et coupez le diaphragme et le long des deux côtés du sternum, en sectionnant les côtes. Veillez à ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins. Épinglez la cage thoracique près du sternum sans serrer à côté de la tête.

Tenez les ventricules à l’aide d’une pince fine et incisez soigneusement l’oreillette droite avec des ciseaux fins. Insérez l’aiguille de calibre 23 fixée au système de perfusion par gravité dans le ventricule gauche vers l’aorte ascendante. Pendant que le PBS fonctionne, insérez seulement 0,5 centimètre de la pointe de l’aiguille perfusez la souris pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que l’effluent soit clair.

Après la perfusion interne, disséquez le cerveau et placez-le dans un tube à centrifuger de 10 millilitres contenant du RPMI. Douleur moyenne. Placez le cerveau fraîchement récolté sur une passoire en acier inoxydable de 40 à 60 mailles dans une boîte de Pétri contenant trois à cinq millilitres de milieu de culture tissulaire RPMI. Coupez le tissu cérébral en petits morceaux.

Ensuite, à l’aide d’un piston à cristal, poussez de petits morceaux de tissu cérébral à travers la crépine cellulaire. Transférez l’homogénat de cerveau dans un tube de 10 millilitres et centrifugez-le à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, jeter le surnageant et dissoudre la pastille dans trois millilitres de RPMI.

Milieu contenant de la collagénase D et de l’ADN cygne. Faites pivoter le mélange pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez tous les débris cellulaires en poussant le mélange à travers une passoire en nylon de 70 microns.

Ensuite, incubez sur glace pendant cinq minutes après l’incubation dans un tube de 10 millilitres. Superposez soigneusement l’homogénat de cerveau sur une centrifugeuse à coussin de sept millilitres à 30 % par appel à 400 fois G pendant 20 minutes à température ambiante avec la pause. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de lyse des globules rouges, tamponnez et incubez sur de la glace pendant cinq minutes.

Pour lyser les pbcs adhérents, qui ne sont pas éliminés du cerveau par perfusion intraorale. Ajouter neuf millilitres de cellules de lavage de milieu RPMI et centrifuger à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Resus suspend les leucocytes séquestrés dans le cerveau ou BSL contenant des pastilles dans 50 à 100 microlitres de milieu RPMI et transfère les cellules dans un tube de micro-centrifugeuse, compte les cellules viables au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion trian blue.

Six jours après l’infection, de 20 000 à 100 000 LRP peuvent être récupérées une fois que le nombre de cellules viables a été obtenu. Les cellules sont préparées pour l’analyse par cytométrie en flux. Les détails de cette procédure sont donnés dans le document d’accompagnement, mais sont résumés ici en premier.

Toutes les cellules isolées de chaque cerveau sont centrifugées dans un tube micro-fuge de 1,5 millilitre et sont remises en suspension dans un tampon de coloration avec des anticorps bloquant les anticorps anti-CD-16 et CD-32. Après une incubation de 10 minutes sur glace, les cellules sont lavées avec un tampon de coloration, centrifugées à nouveau et remises en suspension dans un tampon de coloration contenant des anticorps fluorescents anti CD quatre, anti CD huit, anti TCR et anti NK 1.1. Les cellules sont incubées sur de la glace pendant une heure, lavées avec un colorant, un tampon et une centrifugeuse.

Après le spin, les cellules sont remises en suspension dans le PBS et au moins 5 000 à 10 000 événements sont acquis sur un cytomètre en flux. Les données résultantes sont analysées à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux approprié. Des populations de LRB ont été récupérées à partir de cerveaux de souris témoins perfusées ou infectées par l’ONU, infectées par le paludisme et naïves, et colorées avec des anticorps pe, anti NK 1.1 et un anticorps bêta anti TCR PC.

Ces diagrammes à points représentent les pourcentages de cellules NK, de lymphocytes T, de cellules positives TCR NK 1.1 positives et de cellules double négatives. TCR NK 1.1 négatif négatif chez les souris témoins perfusées ou non, infectées par le paludisme et naïves, conformément aux résultats précédents. Les lymphocytes T alpha-bêta TCR positifs constituaient une forte proportion du pool de BSL dans le cerveau de souris infectées par le paludisme perfusées le sixième jour après l’infection.

Cette population semblait être significativement sous-représentée dans les cerveaux d’animaux non perfusés. La réduction apparente des fréquences des lymphocytes T dans les cerveaux non perfusés était associée à un pourcentage considérablement plus élevé et à un nombre total de cellules doublement négatives chez ces animaux. Un pourcentage et un nombre élevés de cellules doublement négatives dans les cerveaux non perfusés ont été détectés non seulement chez les souris infectées par le paludisme, mais aussi chez les témoins naïfs, ce qui suggère que ces cellules sont des leucocytes non inflammatoires présents dans les vaisseaux sanguins du cerveau qui sont récupérés avec des cellules inflammatoires si la perfusion intracardiaque n’est pas effectuée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer une profusion intracardio extensive de souris infectées avant l’extraction de l’organe afin d’éviter la contamination des leucocytes séquestrés par des cellules circulantes non inflammatoires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’analyser les leucocytes séquestrés dans le cerveau de souris infectées par Plasmodium virga par géométrie fluide.