Name: Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes Plasmodium berghei ANKA-souris infectées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Découvrez une méthode d'isolement des leucocytes inflammatoires adhérents des vaisseaux cérébraux de souris infectées par Plasmodium berghei ANKA. Cette technique permet leur quantification et caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolore.

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Les auteurs tiennent à remercier Mlle Liana Mackiewicz de l&#39;assistance technique. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du gouvernement l&#39;État de Victoria infrastructure opérationnelle et du gouvernement australien Santé nationale et du Conseil de recherches médicales IRIISS et de subvention de projet 1,031,212.

1. L&#39;infection des souris avec P. berghei ANKA- <ol><li> Décongeler une aliquote de cryoconservé P. berghei ANKA pRBC. </li><li> Retenir un paludisme cérébral résistant souris BALB / c donateurs (8-12 semaines d&#39;âge) en utilisant la technique de retenue à deux mains. Injecter la souris avec 100-200 ul de pRBC l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 ml d&#39;insuline (28G aiguille). Régulièrement, 1-2 souris donneuses sont injectés. </li><li> Sur les 4-5 jours post-infection (pi) retirer souris donneuse de la cage et le placer sur une station de travail ou un tampon jetable de travail. </li><li> Doucement restreindre la souris par le bout de la queue et l&#39;utilisation de petits ciseaux couper le bout de la queue (environ 1 mm). Alternativement, une ponction petite queue à l&#39;aide d&#39;une aiguille 25 G pourrait être réalisée. </li><li> Déposer une goutte de sang de veine de la queue de la souris vers la fin d&#39;une lame de microscope dépoli fin. </li><li> Placez une deuxième lame (spreader) sur un angle de 45 ° et le sauvegarder dans la goutte de sang. Une fois le sang se propage le long du bord, pousser la veille épandeur-slideeul à travers la lame du microscope pour faire le frottis sanguin. Laisser le frottis sécher à l&#39;air. </li><li> Fixer les frottis sanguins dans le méthanol à 100% pendant 30 secondes, puis tache diapositives au Giemsa fraîchement préparée pendant 10 min. </li><li> Rincer frottis de sang avec l&#39;eau courante pendant 1 min, laisser sécher à l&#39;air et à examiner glissière sous le microscope (100x immersion dans l&#39;huile,). Énumérer pRBC à moins de 1000 érythrocytes et de calculer la parasitémie pour cent. Souris donneuses devraient atteindre des niveaux de parasitémie entre 2,5-5% avant d&#39;être saigné pour l&#39;infection des animaux de laboratoire. </li><li> Recueillir le sang de la souris donneuse par saignement rétro-orbitaire en utilisant un micro-hématocrite hépariné tube capillaire. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec les exigences Walter et Eliza Hall Institute du Comité d&#39;éthique animale. En fonction des besoins des animaux locaux comité d&#39;éthique procédures autres saignements peuvent être utilisés. Dissoudre la quantité requise de sang dans le milieu RPMI à une concentration finale de 1.10 6 pRBC/0.2 ml. Considérez queun hématocrite normal de la souris est de ~ 6x10 9 cellules rouges du sang / 1 ml. </li><li> Infect C57BL expérimentale / 6 souris (8-12 semaines) par injection intrapéritonéale (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml. </li><li> Pour surveiller les niveaux de parasitémie de souris infectées suivez les étapes 1.3 à 1.8. Parasitémie doit être déterminé tous les 2-3 jours à partir du jour 2 ou 3 pi </li><li> L&#39;apparition du paludisme grave chez souris C57BL / 6 peut se manifester comme apparence voûtée, la gélinotte fourrure et une faible activité. Certaines souris peut recouvrer à ce stade, mais la progression de la perte de l&#39;auto-réflexe de redressement indique maladie irréversible et les animaux doivent être euthanasiés. </li></ol> 2. La perfusion intracardiaque de souris et d&#39;extraction du cerveau <ol><li> Assembler un système de perfusion par gravité manuel par fixation d&#39;un réservoir 500 ml d&#39;un support de colonne fixé à la partie supérieure de la colonne de support 60 cm. Raccorder des tubes en matière plastique à l&#39;extrémité inférieure du réservoir et assurer une pince de tube pour commander l&#39;écoulement tampon. Fixer le tube à une aiguille 23 G. Fill le réservoir avec du PBS (maintenue à 22 ° C), ouvrir et serrer permettre tampon afin de fonctionner à travers le tube pour éliminer toutes les bulles d&#39;air. </li><li> Euthanasier P. berghei ANKA-souris infectée par inhalation de CO 2. Confirmer la mort par l&#39;absence de pédale, et les réponses des voies respiratoires orbital. </li><li> Pin souris euthanasiées par les pattes de derrière et devant dorsalement sur une planche à dissection mousse de polystyrène contenues dans un bac en plastique. Selon le Comité des animaux sous anesthésie locale exigences d&#39;éthique pourrait être administré avant le début de pefusion intracardiaque. </li><li> Essuyez la face ventrale avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Utilisez de grands ciseaux et des pinces pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane pour exposer la cavité thoracique. Pli cutané et la broche sur les côtés. </li><li> Tenez le sternum avec des pinces fines et couper le diaphragme et le long des deux côtés du sternum couper les côtes. Prenez soin de ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins. </li><li> La broche de la cage thoracique du sternum lâchement à côté de la tête. </li><li> Tenez esprit ventriculesh pince fine et soigneusement inciser oreillette droite avec des ciseaux fins. </li><li> Insérez l&#39;aiguille 23G attaché au système de perfusion par gravité dans le ventricule gauche vers l&#39;aorte ascendante tandis que le PBS est en cours d&#39;exécution. Insérez seulement 0,5 cm de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Perfuser la souris pendant 5 min ou jusqu&#39;à ce que l&#39;effluent est clair. </li><li> Détacher la souris et le poser sur son abdomen. Essuyez la tête avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Utilisation de grands ciseaux, faire une coupe juste au-dessus de la zone de la moelle épinière cervicale. </li><li> Utilisez des ciseaux fins pour faire une médiane caudale-rostrale coupe à partir de la base du crâne et la peau d&#39;écart pour exposer le crâne. </li><li> Tenant la tête, placez les lames de ciseaux petits dans chaque cavité orbitaire et faire une coupure entre les orbites. </li><li> Faites une coupe longitudinale le long de la suture sagittale et détachez soigneusement le crâne sur chaque hémisphère du cerveau vers l&#39;extérieur. </li><li> Avec une spatule, soulevez doucement le cerveau et le placer dans un tube à centrifuger de 10 ml contenant du milieu RPMI. </li></ol>3. Isolement de Brain-séquestrés leucocytes (BSL) <ol><li> Travailler dans une enceinte de sécurité, le lieu fraîchement récoltées cerveau au-dessus d&#39;un tamis cellulaire en acier inoxydable (40-60 mesh) dans une boîte de Pétri contenant 3-5 ml de milieu de culture RPMI tissus. </li><li> Coupez le tissu cérébral en petits morceaux. </li><li> Appuyez sur de petits morceaux de tissu cérébral à travers le filtre cellulaire à l&#39;aide d&#39;un piston de cristal. </li><li> Transfert homogénat de cerveau dans un tube de 10 ml et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Dissoudre le culot dans 3 ml de milieu RPMI, contenant 0,05% de collagénase D et DNAse I. 2U/ml </li><li> Tournez mélange pendant 30 min à température ambiante. Éliminer les débris cellulaires en poussant le mélange à travers un tamis de nylon 70 um cellule et / ou par incubation sur de la glace pendant 5 min. </li><li> Lay homogénat de cerveau sur un coussin de 7 ml de Percoll 30% et centrifuger à 400 xg (sans freins) pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges du sang et incuber sur de la glace pendant 5 min àlyser pRBC adhérent, qui n&#39;a pu être retirée du cerveau par perfusion intracardiaque. </li><li> Ajouter 9 ml de milieu RPMI, laver les cellules et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension BSL contenant du pellet dans 50-100 pi de milieu RPMI et transférer les cellules dans un tube Eppendorf. </li><li> Diluer une aliquote de 5-10 pi de l&#39;échantillon de cellules 1:2 dans du bleu trypan pour l&#39;identification de cellules viables. </li><li> Compter les cellules viables sous le microscope à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. A partir du jour de pi 6, lorsque P. berghei ANKA-souris infectées présentent des signes neurologiques, 20,000-100,000 BSLs peut être récupéré. </li></ol> 4. Immunophénotypage de BSL en cytométrie en flux Multicolore <ol><li> Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul de tampon de coloration (PBS, 1% sérum de veau foetal (FCS), 2 mM EDTA). </li><li> Ajouter le pl 1 sur purifiée anti-CD16/32 anticorps (Fcblock). </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min sur la glace. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de coloration contenant prédéterminés dilutions optimales de exigées anticorps fluorescents, c&#39;est à dire anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR et anti-NK1.1. </li><li> Incuber pendant 1 heure sur la glace. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS. </li><li> Transférer des cellules dans un tube de plastique de cytométrie de flux. </li><li> L&#39;aide d&#39;un cytomètre en flux, accumuler au moins 5.000-10.000 événements. Des contrôles de cellules non colorées et des échantillons de rémunération fluorochromes doivent être incluses au besoin. </li><li> Analyser les résultats en utilisant un logiciel approprié cytométrie en flux. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;isolement et l&#39;analyse de BSL est une méthode qui permet la caractérisation et la quantification des cellules inflammatoires qui migrent vers le cerveau en réponse à une lésion tissulaire ou d&#39;une infection chez des souris modèles expérimentaux. L&#39;introduction d&#39;une étape de perfusion intracardiaque pour le retrait du compartiment sanguin avant l&#39;extraction d&#39;organes et de l&#39;isolement cellulaire ultérieur est utile pour prévenir la contamination de cellules inflammatoires avec des non-i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solutions et tampons </td></tr><tr><td> Giemsa azur éosine solution de bleu de méthylène </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> Dilution 1:10 dans de l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> Milieu RPMI </td><td></td><td></td><td> Souris tonicité </td></tr><tr><td> Souris tonicité PBS </td><td></td><td></td><td> Phosphate de sodium 20 mM, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% bleu trypan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> Dilution 1:2 </td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Biochimique Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNAse) Je </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> À partir de pancréas de bovin </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> Solution à 30% dans du PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure d&#39;ammonium (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge tampon de lyse cellulaire </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> Sel disodique d&#39;EDTA </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Les anticorps et les conjugués d&#39; </td></tr><tr><td> Anti-souris CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 pl dans 50 ul de tampon de coloration (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC anti-souris CD4, clone H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-souris NK1.1, clone PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 anti-souris CD8, clone 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC anti-souris TCR-β, clone H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-souris CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-souris CCR5, clone C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement et matériel </td></tr><tr><td> Lame de microscope SuperFrost </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinces à dissection, ciseaux </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml de PBS réservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tube en caoutchouc </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aiguille 23G </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de dissociation cellulaire contenant un métal tamis </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um filtre cellulaire en nylon </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Neubauer GmbH </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de cytométrie en flux </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et analyse de brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka-souris infectées

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement et la caractérisation des cellules adhérentes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de P. berghei ANKA-souris infectées. L&#39;infection des souris sensibles avec les souches cela se traduit souche de parasite dans l&#39;induction de la malaria cérébrale expérimentale, un syndrome neurologique qui récapitule certains aspects importants de Plasmodium falciparum à médiation paludisme grave chez les humains 1,2. Formes matures du sang étapes paludisme exprimer des protéines parasites sur la surface de l&#39;érythrocyte infecté, ce qui leur permet de se lier à des cellules endothéliales vasculaires. Ce processus induit obstruction du flux sanguin, ce qui entraîne une hypoxie et des hémorragies 3 et stimule également le recrutement des leucocytes inflammatoires au site de la séquestration du parasite. Contrairement à d&#39;autres infections, à savoir les virus neutrotopic 4-6, les deux paludisme globules rouges parasités (pRBC) ainsi que associé Inflammleucocytes Atory reste séquestré dans les vaisseaux sanguins plutôt que de s&#39;infiltrer dans le parenchyme cérébral. Ainsi, pour éviter la contamination des leucocytes séquestrés avec des non-inflammatoires des cellules circulantes, vaste perfusion intracardiaque de souris infectées par-avant prélèvement d&#39;organes et de traitement des tissus est nécessaire dans cette procédure pour retirer le compartiment sanguin. Après la perfusion, les cerveaux sont prélevés et disséqués en petits morceaux. La structure du tissu est encore perturbée par un traitement enzymatique avec de la collagénase D et DNAse I. L&#39;homogénat de cerveau résultant est ensuite centrifugé sur un gradient Percoll qui permet de séparer le cerveau séquestrés leucocytes (BSL) de la myéline et des débris d&#39;autres tissus. Les cellules isolées sont ensuite lavées, comptées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et colorées avec des anticorps fluorescents pour une analyse ultérieure par cytométrie en flux. Cette procédure permet la caractérisation phénotypique complète des leucocytes inflammatoires de migrer vers le cerveau reréponse à divers stimuli, y compris les accidents vasculaires cérébraux ainsi que les infections virales ou parasitaires. La méthode fournit également un outil utile pour l&#39;évaluation de nouveaux traitements anti-inflammatoires dans des modèles animaux précliniques.

Les résultats de la Fig. 2 pourcentages montrent et le nombre absolu des différentes populations BSL récupérés à partir de cerveaux de souris perfusés ou unperfused contrôle infectées par la malaria et naïf. Isolé BSL ont été colorés avec du PE-anti-NK1.1 et APC-anti-TCR-β anticorps comme indiqué dans le texte du Protocole. Conformément aux conclusions précédentes 7-9, αβTCR cellules T comprend une forte proportion de la piscine BSL dans le cerveau des perfusés infectés par le paludisme chez la sou...

Une méthode pour l&#39;isolement des adhérents leucocytes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées est décrite. La méthode permet la quantification ainsi que la caractérisation phénotypique des leucocytes isolés après coloration avec des anticorps fluorescents et leur analyse ultérieure par cytométrie en flux.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les leucocytes inflammatoires adhérents des vaisseaux sanguins du cerveau de souris infectées par Plasmodium Burge Eye et Anca afin d’induire un paludisme cérébral expérimental. Les souris sont infectées par des globules rouges parasités par injection. Une fois que les souris commencent à montrer des signes de maladie, les cellules circulantes des souris infectées par le paludisme sont éliminées par perfusion intrabuccale.Les cerveaux sont ensuite prélevés et le tissu est digéré avec des enzymes pour permettre l’isolement des leucocytes inflammatoires. Une cytométrie en flux multicolore est ensuite réalisée pour l’immunophénotype. L’analyse des données résultantes révèle le pourcentage et le nombre absolu de leucocytes migrant vers le cerveau de souris infectées par le paludisme.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse du paludisme, telles que le type de cellules inflammatoires qui migrent vers le site de séquestration du parasite dans le cerveau d’animaux infectés dans différentes conditions expérimentales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Les étapes de perfusion sont difficiles à apprendre car elles nécessitent à la fois de la rapidité et du soin pour ne pas endommager les vaisseaux sanguins importants. Leanna Mcic, technicienne animale, Mme Victoria, Rick, étudiant au doctorat, et le Dr Lisa Aez, postdoctorante de mon laboratoire, démontreront certaines parties de cette procédure.Commencez ce protocole en infectant les souris avec p berge eye anca defrost, une aliquote cryoconservée de cellules rouges parasitées ou pbcs en lui permettant de revenir à température ambiante. Retirez une souris donneuse de huit à 12 semaines de sa cage et placez-la sur un poste de travail. Saisissez la peau du cou entre l’index et le pouce.Retournez la souris et injectez 100 à 200 microlitres de plasmodium berge oculaire dans la cavité péritonéale. Régulièrement, deux souris donneuses reçoivent des injections de PBC. Après l’injection, placez les souris dans leur cage quatre à cinq jours après l’infection.Retirez une souris donneuse de sa cage et placez-la sur un poste de travail. Placez une goutte de sang de la veine de la queue de la souris près de l’extrémité d’une lame de microscope à extrémité givrée. Placez une deuxième diapositive à un angle de 45 degrés et reculez-la dans la goutte de sang.Une fois que le sang se répand le long du bord, poussez uniformément la lame d’écartement sur la lame du microscope pour faire couler le sang. Laissez le frottis sécher à l’air libre pour fixer les frottis sanguins. Immergez les lames dans du méthanol à 100 % pendant 30 secondes.Ensuite, colorez les lames dans GIM ZA fraîchement préparé pendant 10 minutes après la coloration avec gim za, rincez la lame à l’eau courante pendant 30 secondes. Laissez la lame sécher à l’air, puis examinez-la au microscope à l’aide de la lentille à immersion dans l’huile 100x. Énumérez le PRBC à moins d’un millier d’érythrocytes et calculez le pourcentage para si la souris donneuse a atteint les niveaux requis de 2,5 à 5 %Parsit Prélevez le sang de la souris donneuse par ponction cardiaque sous anesthésie ou saignement rétroorbitaire à l’aide d’un tube capillaire à micro-hématocrite hépariné.Dissoudre le sang dans le milieu RPMI à une concentration finale de un fois 10 à six PRBC par 0,2 millilitre par souris. Considérez qu’un hématocrite de souris normal est d’environ six fois 10 à 9 globules rouges par millilitre. En fait, des souris expérimentales C 57 noires de huit à 12 semaines en injectant une fois 10 au sixième PRBC dans 0,2 millilitres intrapéritonéale comme auparavant.Pour surveiller les niveaux de para des souris infectées, préparez un frottis sanguin comme précédemment. Para doit être déterminé tous les deux à trois jours à partir du deuxième jour ou du troisième jour après l’infection à partir du cinquième jour. Après l’infection.Les souris sont surveillées quotidiennement pour détecter des signes de paludisme grave une fois que les niveaux de para sont supérieurs à 5 % et les souris présentent des symptômes neurologiques environ six jours après l’infection. Les souris infectées sont euthanasiées par inhalation de CO2 et immédiatement perfusées avec du PBS, comme décrit dans le document d’accompagnement. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la perfusion intracardiaque.Une série de conseils de dépannage est décrite ici : avec la souris épinglée sur une planche de dissection en polystyrène. Dans un plateau de dissection. Essuyez la face ventrale avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez de grands ciseaux et des pinces pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane afin d’exposer la cavité thoracique, pliez et épinglez la peau sur les côtés.Tenez le sternum avec une pince fine et coupez le diaphragme et le long des deux côtés du sternum, en sectionnant les côtes. Veillez à ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins. Épinglez la cage thoracique près du sternum sans serrer à côté de la tête.Tenez les ventricules à l’aide d’une pince fine et incisez soigneusement l’oreillette droite avec des ciseaux fins. Insérez l’aiguille de calibre 23 fixée au système de perfusion par gravité dans le ventricule gauche vers l’aorte ascendante. Pendant que le PBS fonctionne, insérez seulement 0,5 centimètre de la pointe de l’aiguille perfusez la souris pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que l’effluent soit clair.Après la perfusion interne, disséquez le cerveau et placez-le dans un tube à centrifuger de 10 millilitres contenant du RPMI. Douleur moyenne. Placez le cerveau fraîchement récolté sur une passoire en acier inoxydable de 40 à 60 mailles dans une boîte de Pétri contenant trois à cinq millilitres de milieu de culture tissulaire RPMI. Coupez le tissu cérébral en petits morceaux.Ensuite, à l’aide d’un piston à cristal, poussez de petits morceaux de tissu cérébral à travers la crépine cellulaire. Transférez l’homogénat de cerveau dans un tube de 10 millilitres et centrifugez-le à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, jeter le surnageant et dissoudre la pastille dans trois millilitres de RPMI.Milieu contenant de la collagénase D et de l’ADN cygne. Faites pivoter le mélange pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez tous les débris cellulaires en poussant le mélange à travers une passoire en nylon de 70 microns.Ensuite, incubez sur glace pendant cinq minutes après l’incubation dans un tube de 10 millilitres. Superposez soigneusement l’homogénat de cerveau sur une centrifugeuse à coussin de sept millilitres à 30 % par appel à 400 fois G pendant 20 minutes à température ambiante avec la pause. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de lyse des globules rouges, tamponnez et incubez sur de la glace pendant cinq minutes.Pour lyser les pbcs adhérents, qui ne sont pas éliminés du cerveau par perfusion intraorale. Ajouter neuf millilitres de cellules de lavage de milieu RPMI et centrifuger à 250 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Resus suspend les leucocytes séquestrés dans le cerveau ou BSL contenant des pastilles dans 50 à 100 microlitres de milieu RPMI et transfère les cellules dans un tube de micro-centrifugeuse, compte les cellules viables au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion trian blue.Six jours après l’infection, de 20 000 à 100 000 LRP peuvent être récupérées une fois que le nombre de cellules viables a été obtenu. Les cellules sont préparées pour l’analyse par cytométrie en flux. Les détails de cette procédure sont donnés dans le document d’accompagnement, mais sont résumés ici en premier.Toutes les cellules isolées de chaque cerveau sont centrifugées dans un tube micro-fuge de 1,5 millilitre et sont remises en suspension dans un tampon de coloration avec des anticorps bloquant les anticorps anti-CD-16 et CD-32. Après une incubation de 10 minutes sur glace, les cellules sont lavées avec un tampon de coloration, centrifugées à nouveau et remises en suspension dans un tampon de coloration contenant des anticorps fluorescents anti CD quatre, anti CD huit, anti TCR et anti NK 1.1. Les cellules sont incubées sur de la glace pendant une heure, lavées avec un colorant, un tampon et une centrifugeuse.Après le spin, les cellules sont remises en suspension dans le PBS et au moins 5 000 à 10 000 événements sont acquis sur un cytomètre en flux. Les données résultantes sont analysées à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux approprié. Des populations de LRB ont été récupérées à partir de cerveaux de souris témoins perfusées ou infectées par l’ONU, infectées par le paludisme et naïves, et colorées avec des anticorps pe, anti NK 1.1 et un anticorps bêta anti TCR PC.Ces diagrammes à points représentent les pourcentages de cellules NK, de lymphocytes T, de cellules positives TCR NK 1.1 positives et de cellules double négatives. TCR NK 1.1 négatif négatif chez les souris témoins perfusées ou non, infectées par le paludisme et naïves, conformément aux résultats précédents. Les lymphocytes T alpha-bêta TCR positifs constituaient une forte proportion du pool de BSL dans le cerveau de souris infectées par le paludisme perfusées le sixième jour après l’infection.Cette population semblait être significativement sous-représentée dans les cerveaux d’animaux non perfusés. La réduction apparente des fréquences des lymphocytes T dans les cerveaux non perfusés était associée à un pourcentage considérablement plus élevé et à un nombre total de cellules doublement négatives chez ces animaux. Un pourcentage et un nombre élevés de cellules doublement négatives dans les cerveaux non perfusés ont été détectés non seulement chez les souris infectées par le paludisme, mais aussi chez les témoins naïfs, ce qui suggère que ces cellules sont des leucocytes non inflammatoires présents dans les vaisseaux sanguins du cerveau qui sont récupérés avec des cellules inflammatoires si la perfusion intracardiaque n’est pas effectuée.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer une profusion intracardio extensive de souris infectées avant l’extraction de l’organe afin d’éviter la contamination des leucocytes séquestrés par des cellules circulantes non inflammatoires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’analyser les leucocytes séquestrés dans le cerveau de souris infectées par Plasmodium virga par géométrie fluide.

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