整个老鼠大脑与光共聚焦显微镜板微米级分辨率光学层析成像

该程序的总体目标是以微米级分辨率重建和可视化整个小鼠大脑。这是通过首先脱水，固定小鼠大脑整合四面体系列来实现的。第二步是在苄醚中清除样品。

接下来，用共聚焦光片显微镜对大脑进行成像。最后一步是使用软件将采集的图像堆栈对齐和拼接在一起。最终，可以使用多分辨率可视化工具来导航重建的图像体积。

这种技术与其他方法（如共聚焦或照片显微镜）的主要优点是，可以在短短几天内对小鼠大脑的整个体积进行成像。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如不同神经元类型在整个大脑中的分布。这个金属帽是否提供了对精细脑力自主性的洞察？

它也可以应用于小鼠胚胎或脚蝇，证明该程序将是 reini。我实验室的一名研究生。首先，通过反式心脏灌注对小鼠大脑进行标准固定，并在进行脱水和清除之前过夜进行 postfix。

然后，由于脱水溶剂 THF 强烈淬灭 XFP 荧光，使用色谱柱进行过滤以去除碱性活性氧化铝的过氧化物，避免色谱柱开裂，这将减少稳定剂对最终溶液的过氧化物去除。即使 THF 在过滤前已经稳定，稳定剂也会被氧化铝保留。请注意，不含稳定剂的 THF 可能会产生大量过氧化物，并可能具有爆炸性和危险性。

接下来，在纯水中脱水全小鼠脑整合系列 THF。然后将装有样品的小瓶放在旋转轮上，以避免光照。用铝箔包裹小瓶。

最后，使用过滤漏斗用氧化铝过滤清除溶剂。然后在 100%DBE 中清除样品，当大脑出现透明时，在 3 小时和 6 小时后更换溶液。通常在第二次 DBE 更改后一小时，通过此处看到的方法之一将其安装在倾斜的成像板上。

通过 agros 圆盘直接安装或通过 agro 扬声器进行直接安装，将样品轻轻插入其中一个尖端以使用 aros 圆盘插入。由 6%aros 凝胶制成的圆盘贴在尖端上。然后用丙烯酸胶轻轻地将样品固定在 agros 盘上，等待大约一分钟让固化开始。

使用 agros 烧杯插入，将由 3%agros 凝胶制成的烧杯放在尖端上。然后将样品轻轻地放在烧杯底部。按照其中一种方法安装标本后，使用镊子将成像板放置在标本室内。

然后用澄清溶液填充腔室。接下来，准备进行断层扫描。首先，移除狭缝以收集尽可能多的荧光，然后用低激光功率照射样品。

为防止光漂白，使用软件驱动的微定位系统沿 x、y 和 z 三个方向移动样品。对于每个方向，确定样品在相机视场内被照亮的最小和最大坐标。然后，将确定的坐标作为 pre tomography 子例程的参数插入。

还要指定要在 Z 方向的断层扫描和断层扫描前采样步骤中使用的相邻堆栈之间的距离。最后，启动预断层扫描，它将使用上一步中指定的 Z 采样参数收集每个堆栈中的图像。要开始采集，首先，使用微定位系统将样品移动到光片之外。

然后增加所有扫描系统的激光功率和定格动画，以便仅照亮视野中心的固定线。接下来，安装狭缝并使用来自透明溶液的自发荧光信号对其进行对齐。现在，您应该可以清楚地看到视野中心的狭缝线。

现在重新激活扫描系统。使用微定位系统降低激光功率并将样品移动到光片内。请注意，与狭缝一起使用的激光功率将高于不使用狭缝时使用的激光功率。

由于空间滤光片阻挡了不可忽略的光线，因此请使用控制软件调整扫描和 d 扫描系统的振幅和偏移量，直到图像看起来清晰明亮。然后为实验设置适当的 Z 步长并运行断层扫描采集软件。卷将在许多并行、部分重叠的堆栈中进行映像，并且映像将保存在分层文件夹结构中。

为了使拼接软件能够处理完整的立方体体积，请使用合成黑色图像完成采集的体积，即使用自动化软件获得与收集的图像相同类型和尺寸的图像，但强度为零。接下来，启动安装了插件、Terra、Stitcher 和 tarly 的 VA A 3D 软件并加载 Terra Stitcher 插件。选择包含成像体积的目录，并指示轴相对于参考右手坐标系的相对方向和体素大小。

现在启动拼接的第一部分。该软件将计算成对堆栈之间的相对位移，并找到所有堆栈的整体最佳放置，选择以单一分辨率或多分辨率格式保存拼接的体积。ladder 支持使用 tarly 插件进行多分辨率可视化。

在这两种情况下，如果更高分辨率的图像大于几 GB，则还要选择多堆栈保存模式并指定各个子堆栈的大小。这将实现对存储数据的高效访问。现在启动拼接的第二部分。

该软件将合并对齐的堆栈，并将其保存为单堆栈或多堆栈模式。完成后，关闭 Terra Stitcher 插件。接下来，加载 terra fly 插件。

选择具有多堆栈多分辨率卷的文件夹，并指示散兵坑大小和轴方向。卷将以最小分辨率加载。要缩放到更高分辨率，只需使用鼠标滚动即可。

或者，可以双击图像的特定点，或选择放大现有地标或直接指定感兴趣体积的坐标。要缩放回较低的分辨率，只需使用鼠标滚动即可。所描述的方案可用于以微米级分辨率重建整个小鼠大脑或切除的部分，而无需物理切片。

作为代表性结果，L 7 GFP 小鼠出生后第 10 天的整个小脑显示在该动物中。所有 Perkin 基因神经元都用 EGFP 标记。放大后，可以看到小脑皮层的典型层状结构，进一步放大可以清楚地区分每个布基尼细胞体。

因此，所描述的方案可用于筛选各种神经发育研究中的神经元空间组织。作为第二个代表性结果，在这里我们可以看到来自联合国切片的成年大腿（一只 GFPM 小鼠）的图像。在这种转基因动物中，EGFP 在随机稀疏神经元亚群中表达。

此处显示了大脑的右半部分。随着我们越来越放大，神经元过程变得清晰可辨。该结果表明，所描述的方案允许在整个成年小鼠大脑中进行微米级分辨率成像，从而为以细胞分辨率研究整个大脑解剖结构提供了可能性。

在神经退行性疾病的小鼠模型中，一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在三到四天内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住正确过滤脱水和清洁溶液，以保留 GFP 荧光。此处介绍的多分辨率可视化工具也可用于探索通过其他技术（例如断层扫描中的微光学切片）获得的非常大的数据集。

看完这个视频后，你应该对如何确定 Fixture 的 Brain 进行 Dating 、评级 和 Clear Fixed， mouse brain 有了一个很好的了解。使用共聚焦片显微镜对它们进行成像，并使用 Tely 插件通过 VR 3D 可视化重建的体积。