3.15: Évaluation de la chimiotaxie chez Caenorhabditis elegans

Le mouvement d’une cellule ou d’un organisme en réponse à un stimulus chimique est un comportement appelé chimiotaxie. Dans cette vidéo, nous allons apprendre à effectuer un test de chimiotaxie à l’aide du nématode C. elegans. Nous discuterons également de la façon dont les tests de chimiotaxie chez C. elegans sont appliqués à l’étude de l’apprentissage et de la mémoire, de l’adaptation olfactive et de la maladie d’Alzheimer.

Discutons d’abord de deux types différents de chimiotaxie. Le mouvement vers un stimulus chimique est appelé chimiotaxie positive. En revanche, le mouvement d’éloignement d’un stimulus chimique est appelé chimiotaxie négative, permettant aux organismes de s’éloigner des produits chimiques nocifs.

La chimiotaxie peut se produire au niveau de l’organisme, lorsque les organismes se déplacent vers une source de nourriture. La chimiotaxie a également lieu au niveau cellulaire, au sein des organismes. Par exemple, les cellules immunitaires migrent vers des agents pathogènes ou des sites d’inflammation. Dans un autre exemple, les spermatozoïdes se déplacent vers l’ovule en réponse à un attractif chimiochimique libéré par l’ovule. La chimiotaxie est également un processus important au cours du développement, dans lequel les cellules migrent en réponse à un stimulus chimique, formant des tissus et des organes dans l’organisme en développement.

Pour C. elegans sauvage, vivant dans le sol, la chimiotaxie est importante pour la détection et le déplacement vers les bactéries, leur principale source de nourriture. En revanche, C. elegans est repoussé par les métaux lourds, les substances à faible pH et les détergents, qui sont toxiques pour l’organisme.

Les tests de chimiotaxie commencent généralement par la préparation de plaques de chimiotaxie. À l’aide d’une règle et d’un marqueur, divisez une assiette de 5 cm avec du milieu de croissance des nématodes en quatre quadrants égaux. Ensuite, dessinez un cercle d’un rayon de 0,5 cm autour du centre du quadrant. Ce sera le point de départ des vers. Marquez et étiquetez un point dans chaque quadrant, de sorte que chaque point soit équidistant du centre et les uns des autres.

Lors de la préparation des vers pour le test, il est essentiel d’utiliser des vers jeunes adultes synchronisés avec l’âge afin que les différences de chimiotaxie ne soient pas un artefact du stade de développement. Une fois les vers synchronisés, prélevez-les en pipetant d’abord 2 ml de tampon basal S sur une plaque contenant de jeunes adultes. Faites tourner et inclinez le plat pour laver les vers de l’assiette.

Ensuite, pipetez la solution ver/S-basale dans un tube de microcentrifugation. Lavez les vers en centrifugeant brièvement la solution ver/S-basale, en retirant le surnageant et en ajoutant un autre millilitre de solution S-basale à la pastille de vers. Retournez le tube et répétez le lavage deux fois de plus. Après le lavage, retirez tout sauf environ 100 μl de la solution S-basale. Ensuite, ajoutez 2 μl du mélange ver/S-basal dans une plaque NGM. À l’aide d’un microscope, comptez le nombre de vers présents. Idéalement, il y aura entre 50 et 250 vers pour 2 μl de S-basal.

Maintenant que les plaques de chimiotaxie et les vers sont prêts, nous pouvons commencer le test de chimiotaxie. Tout d’abord, mélangez des volumes égaux de votre solution de test avec de l’azoture de sodium 0,5 M, un anesthésique qui paralysera les vers une fois qu’ils atteindront leur destination. Faites de même avec votre solution de contrôle. Ensuite, pipetez 2 μl de mélange vers/S-basal au centre de votre plaque de chimiotaxie. Ensuite, pipeter 2 μl de la solution de test ou de contrôle et placer sur des points correctement étiquetés sur la plaque de chimiotaxie. Une fois que les solutions de test et de contrôle ont été absorbées, remettez le couvercle en place, retournez la plaque et réglez une minuterie sur 1 heure.

Après que les vers aient eu une heure pour répondre aux stimuli chimiques sur la plaque, les données peuvent être analysées. Comptez manuellement le nombre de vers dans chaque quadrant. Si les vers sont attirés par la substance d’essai, il y aura plus de vers présents dans ces quadrants. S’ils sont neutres vis-à-vis de ce produit chimique, les vers seront présents dans chaque quadrant de manière égale.

Utilisez ces données pour calculer l’indice chimiotactique, qui est le nombre de vers dans les quadrants d’essai moins le nombre de vers dans le quadrant de contrôle, divisé par le nombre total de vers. Un indice chimiotactique proche de +1 suggère une attraction, tandis qu’un indice chimiotactique proche de -1 indique une répulsion.

Maintenant que nous avons appris à mettre en place un test de chimiotaxie, voyons comment ces expériences sont appliquées pour répondre à des questions scientifiques.

L’une des façons dont les tests de chimiotaxie chez C. elegans ont été appliqués est l’étude de l’apprentissage et de la mémoire. Par exemple, les vers peuvent être conditionnés à associer un stimulus chimique à une source de nourriture. Les vers bien nourris sont affamés pendant une heure, puis ils sont conditionnés avec de la nourriture, ainsi qu’un produit chimique tel que le butanone.

Ensuite, les vers sont maintenus sur une assiette avec de la nourriture, mais sans butanone. L’exécution d’un test de chimiotaxie déterminera ensuite si les vers ont appris à associer le butanone à la nourriture. De nombreuses variantes de cette expérience peuvent être effectuées pour déterminer d’autres informations telles que les gènes ou les neurones importants pour l’apprentissage et la mémoire.

L’adaptation olfactive est un phénomène qui se produit lorsque les neurones sensoriels diminuent leur réponse à un stimulus au fil du temps, ce qui permet à l’animal de répondre à d’autres stimuli, peut-être plus importants. Par exemple, un C. elegans de type sauvage exposé à une odeur pendant un certain temps ignorera cette odeur lors d’un test de chimiotaxie en raison de l’adaptation olfactive, plutôt que d’être attiré par celle-ci. Par conséquent, des criblages génétiques à haut débit peuvent être effectués pour révéler les régulateurs génétiques de l’adaptation olfactive, tels que egl-4. De plus, des vers transgéniques exprimant des protéines marquées par fluorescence peuvent être observés pour des changements de localisation au cours de l’adaptation olfactive.

Enfin, les tests de chimiotaxie peuvent être utilisés chez C. elegans pour étudier la maladie d’Alzheimer. Les scientifiques peuvent exprimer le peptide bêta-amyloïde humain marqué par fluorescence - une caractéristique de la maladie d’Alzheimer - dans les neurones de C. elegans. Fait intéressant, les tests de chimiotaxie ont révélé que les vers exprimant la bêta-amyloïde dans une population de neurones présentent une chimiotaxie réduite envers un attractif chimiothérapeutique par rapport au contrôle. De nombreuses variantes de cette expérience pourraient être réalisées, y compris l’expression de la bêta-amyloïde dans d’autres populations de neurones ou tissus, ou la détermination si des composés peuvent atténuer les effets de l’expression de la bêta-amyloïde, conduisant finalement à une thérapie potentielle.

Vous venez d’assister à l’introduction de JoVE à la chimiotaxie chez C. elegans. Tout d’abord, nous avons défini ce qu’est la chimiotaxie et pourquoi elle est importante dans la nature pour les organismes et les cellules. Ensuite, nous avons montré comment effectuer un test de chimiotaxie avec C. elegans. Enfin, nous avons discuté de la façon dont la chimiotaxie peut être appliquée pour comprendre l’apprentissage et la mémoire, l’adaptation olfactive et la maladie d’Alzheimer. Merci d’avoir regardé !