Détection de l'expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

L'objectif général de cette procédure est de purifier et de détecter avec succès les ARNm dans la membrane péritonéale du rat. Pour commencer cette procédure, après une anesthésie par inhalation avec 4 % d'isoflurane, vaporisez la peau abdominale du rat avec de l'éthanol à 70 % et fixez-le sur la feuille de liège, sur le dos.

Ensuite, pratiquer une incision longitudinale dans la peau abdominale, les muscles et la membrane péritonéale de l'animal à l'aide de ciseaux et d'une pince. Saisir la membrane péritonéale à l’aide de la pince et effectuer des incisions horizontales sur sa partie supérieure, le long de la dernière côte située sous le diaphragme, puis sur sa partie inférieure, en région latérale, à l’aide des ciseaux chirurgicaux.

Ensuite, effectuez des incisions longitudinales latérales pour retirer la membrane péritonéale du corps à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Puis rincez-la avec du PPS dans une boîte de Pétri. Découpez et taillez un échantillon de membrane péritonéale de 20 milligrammes.

Dans cette procédure, placez un échantillon de 20 milligrammes de membrane péritonéale dans un homogénéisateur en verre. Ajoutez ensuite 700 microlitres de réactif de lyse à base de phénol-guanidine. Ensuite, homogénéisez l'échantillon de membrane péritonéale sur de la glace en appuyant lentement sur un piston tout en effectuant un mouvement de rotation.

Répétez ce processus plusieurs dizaines de fois, jusqu'à ce que l'échantillon de membrane péritonéale se soit complètement dissous dans le réactif de lyse à base de phénol et de guanidine. Pour une homogénéisation supplémentaire, transférez le lysat homogénéisé vers un système de broyage de biopolymères dans une colonne de centrifugation micro-centrifugeuse, placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifugez ensuite à 14 000 × g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, transférez le lysat homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ajoutez 140 microlitres de chloroforme au lysat homogénéisé et fermez hermétiquement le tube. Puis, mélangez le tube par retournement pendant 15 secondes.

Ensuite, incubez l'échantillon pendant deux à trois minutes à température ambiante. Puis, centrifugez-le à 12 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 300 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge, sans perturber le précipité.

Ajouter 450 µL d'éthanol à 100 %. Ensuite, mélanger l'échantillon par vortexage pendant cinq secondes. Puis, prélever jusqu'à 700 µL de l'échantillon à l'aide d'une pipette et le transférer dans une colonne de centrifugation dotée d'une membrane en silicone, placée dans un tube de collecte de 2 mL, et refermer le bouchon.

Ensuite, centrifuger à 15 000 × g pendant 15 secondes. Après la centrifugation, éliminer le flux traversant présent dans le tube de collecte. Puis ajouter 700 microlitres de tampon de lavage 1 sur la colonne de centrifugation dotée d'une membrane en silice afin de laver rigoureusement l'échantillon et refermer le bouchon.

Centrifuger à 15 000 × g pendant 15 secondes. Après la centrifugation, jeter le liquide de passage dans le tube de collecte. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage 2 sur la colonne de centrifugation à membrane de silice, afin d'éliminer toute trace de sel, puis refermer le bouchon.

Ensuite, centrifuger à 15 000 × g pendant 15 secondes. Après la centrifugation, jeter le flux traversant et le tube de collecte, puis répéter cette procédure une fois de plus. Ensuite, centrifuger à nouveau la colonne de spin à base de membrane en silice à 15 000 × g pendant une minute.

Après la centrifugation, jeter le tube de collecte et tout éluat. Placer la colonne de centrifugation à membrane de silice dans un nouveau tube de collecte de un virgule cinq millilitre. Ensuite, transférer vingt-cinq microlitres d'eau libre de RNase sur la colonne et fermer le bouchon.

Laissez l'échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Faites-le centrifuger à 15 000 ×g pendant une minute. Ensuite, transférez l'aliquot de 25 µL contenant l'ARN total dans un nouveau tube microcentrifuge et stockez-le à −80 °C avant utilisation.

Dans cette procédure, préparez une solution de mélange maître contenant deux microlitres de mélange d'acides nucléiques 10x, deux microlitres de mélange de transcriptase inverse et quatre microlitres de tampon Hispec 5x, pour un volume total de 8 microlitres par tube. Ensuite, distribuez 8 microlitres de la solution de mélange maître dans chaque tube. Mesurez la quantité d'ARN totaux à l'aide d'un spectrophotomètre.

Ensuite, ajoutez un microgramme d'ARN totaux isolés, purifiés à partir de l'échantillon de membrane péritonéale, dans chaque tube. Ajoutez ensuite de l'eau libre de RNase dans chaque tube afin d'obtenir un volume total de 20 microlitres. Mélangez ensuite soigneusement par pipetage et centrifugez pendant 15 secondes.

Ensuite, incuber l'échantillon pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, l'incuber pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Transférer l'ADNc nouvellement généré dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et le diluer 10 fois avec de l'eau sans RNase.

Dans cette procédure, préparez un mélange maître contenant 12,5 µL de mélange maître de PCR 2x, 2,5 µL de chacun des amorces de miARN à 5 µM dissous dans de l’eau sans nucléase et 1,25 µL d’amorce universelle 10x, pour chaque puits. Distribuez 22,5 µL de ce mélange maître dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite 2,5 µL d’ADNc matrice dans chaque puits.

Fermez la plaque de réaction à 96 puits avec un morceau de film. Ensuite, centrifugez-la à 1 000 × g pendant 30 secondes. Pour exécuter le programme de cyclage PCR, placez la plaque dans l'appareil de PCR en temps réel.

Dans le logiciel de PCR en temps réel, définissez les propriétés expérimentales. Ensuite, attribuez des noms aux échantillons et aux ARNm cibles dans chaque puits. Puis, dans le logiciel de PCR en temps réel, saisissez un volume de réaction de 20 µL et les conditions de cyclage suivantes conformément aux instructions.

Pré-incubation à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, 40 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, d'hybridation à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes, et d'élongation à 70 degrés Celsius pendant 30 secondes. D'après un criblage par microarray d'ARNm, les niveaux de six miARN se sont révélés significativement augmentés dans la membrane péritonéale de rats présentant une fibrose péritonéale, par comparaison avec les rats témoins et les rats contrôles, à l'aide de la QRT-PCR, selon le protocole décrit dans cet article.