Détection de l'expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

L’objectif global de cette procédure est de purifier et de détecter avec succès les miARN dans la membrane péritonéale du rat. Pour commencer cette procédure, après une anesthésie par inhalation avec 4 % d’isoflurane. Vaporisez la peau abdominale du rat avec de l’éthanol à 70 % et montez-le sur la feuille de liège, sur son dos.

Ensuite, faites une incision longitudinale dans la peau abdominale, les muscles et la membrane péritonéale de l’animal à l’aide de ciseaux et de pinces. Prélevez la membrane péritonéale à l’aide de la pince et faites des incisions horizontales sur sa partie supérieure le long de l’os de la côte la plus basse sous le diaphragme. Et sur sa face inférieure sur la région latérale à l’aide des ciseaux chirurgicaux.

Ensuite, faites des incisions longitudinales latérales pour retirer la membrane péritonéale du corps, à l’aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, lavez-le avec du PPS dans une boîte de Pétri. Découpez et coupez 20 milligrammes d’échantillon de membrane péritonéale.

Dans cette procédure, placez un échantillon de membrane péritonéale de 20 milligrammes dans un homogénéisateur en verre. Et ajoutez 700 microlitres de réactif de lyse à base de phénol guanidine. Après cela, homogénéisez l’échantillon de membrane péritonéale sur de la glace, en appuyant lentement un pilon sur l’échantillon avec une torsion.

Répétez ce processus plusieurs dizaines de fois, jusqu’à ce que l’échantillon de membrane péritonéale soit complètement dissous dans le réactif de lyse à base de phénol guanidine. Pour une homogénéisation supplémentaire, transférez le lysat homogénéisé dans un système de déchiquetage de biopolymère dans la colonne de centrifugation de la micro-centrifugeuse dans un tube de collecte de deux millilitres. Ensuite, centrifugez-le à 14 000 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, transférez le lysat homogénéisé dans un nouveau microtube à centrifuger. Ajoutez 140 microlitres de chloroforme au lysat homogénéisé et fermez solidement le tube. Par la suite, mélangez le tube par inversion pendant 15 secondes.

Ensuite, incubez l’échantillon pendant deux à trois minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez-le à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 300 microlitres de surnageant dans un nouveau microtube de centrifugation, sans perturber le précipitant.

Et ajoutez 450 microlitres de 100 % d’éthanol. Mélangez ensuite l’échantillon en vortex pendant cinq secondes. Ensuite, pipetez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon dans une colonne de centrifugation à base de membrane de silicone, placée dans un tube de collecte de deux millilitres, et fermez le bouchon.

Ensuite, centrifugez-le à 15 000 fois G pendant 15 secondes. Après la centrifugation, jetez le flux dans le tube de collecte. Ajoutez ensuite 700 microlitres de tampon de lavage 1 à la colonne de centrifugation à membrane de silicium pour laver rigoureusement l’échantillon et fermer le bouchon.

Centrifugez-le à 15 000 fois G pendant 15 secondes. Après la centrifugation, jetez le flux dans le tube de collecte. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage 2, dans la colonne d’essorage à base de membrane de silice, pour éliminer toute trace de sel, et fermez le bouchon.

Ensuite, centrifugez-le à 15 000 fois G pendant 15 secondes. Après la centrifugation, jetez le flux et le tube de collecte et répétez cette procédure. Ensuite, centrifugez à nouveau la colonne de spin à base de membrane de silice à 15 000 fois G pendant une minute.

Après la centrifugation, jetez le tube de collecte et tout écoulement. Placez la colonne de centrifugation à base de membrane de silice dans un nouveau tube de collecte d’un point de cinq millilitres. Transférez ensuite 25 microlitres d’eau libre RNase sur la colonne et fermez le bouchon.

Laissez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugez-le à 15 000 fois G pendant une minute. Ensuite, transférez l’alouette de 25 microlitres contenant l’ARN total dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse et stockez-le à moins 80 degrés Celsius avant de l’utiliser.

Dans cette procédure, préparez une solution de mélange maître qui contient deux microlitres de mélange d’acide nucléique 10x, deux microlitres de mélange de transcriptase inverse et quatre microlitres de tampon 5x Hispec, pour un total de 8 microlitres par tube. Versez ensuite 8 microlitres de la solution de mélange principal dans chaque tube. Mesurez la quantité d’ARN totaux à l’aide d’un spectrophotomètre.

Ensuite, ajoutez un microgramme des ARN totaux isolés, purifiés à partir de l’échantillon de membrane péritonéale, dans chaque tube. Ensuite, ajoutez de l’eau libre de RNase dans chaque tube pour l’amener à un total de 20 microlitres. Ensuite, mélangez-le soigneusement par pipetage et centrifugez-le pendant 15 secondes.

Ensuite, incubez l’échantillon pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, incubez-le pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Transférez l’ADNc nouvellement généré dans un nouveau microtube à centrifuger et diluez-le 10 fois avec de l’eau sans RNase.

Dans cette procédure, préparez un mélange maître contenant 12 virgule cinq microlitres de mélange maître PCR 2x, deux virgule cinq microlitres de cinq micromolaires de chaque amorce miARN dissoute dans de l’eau exempte de nucléases, et un virgule deux cinq microlitres de 10x amorce universelle, pour chaque puits. Distribuez 22 virgule cinq microlitres de ce mélange principal dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite deux virgule cinq microlitres d’ADNc modèle dans chaque puits.

Scellez la plaque de réaction à 96 puits avec un morceau de film. Ensuite, centrifugez-le à 1 000 fois G pendant 30 secondes. Pour exécuter le programme de cyclage PCR, réglez la plaque dans l’instrument PCR en temps réel.

Dans le logiciel de PCR en temps réel, définissez les propriétés expérimentales. Ensuite, attribuez des noms aux échantillons et ciblez les miARN dans chaque puits. Ensuite, dans le logiciel de PCR en temps réel, entrez un volume de réaction de 20 microlitres et les conditions de cycle de PCR suivantes conformément aux instructions.

Pré-incubation à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Et puis 40 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, et à genoux à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes, et d’extension à 70 degrés Celsius pendant 30 secondes. Sur la base du criblage de micro-ARN, les niveaux de six miARN se sont avérés être significativement augmentés dans la membrane péritonéale de rats fibroses péritonéaux, par rapport à ceux chez les rats simulacres et les rats témoins, à l’aide de QRTCPR, conformément au protocole présenté dans ce manuscrit.