Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits

L’objectif global de l’expérience suivante est de convertir des cellules dérivées de parasites du cerveau humain en neurones induits. Ceci est réalisé en isolant et en cultivant des cellules dérivées de parasites à partir d’échantillons cérébraux chirurgicaux. Ensuite, après l’expansion, les cellules in vitro sont immunomarquées pour les marqueurs parasitaires, ce qui permet la caractérisation et éventuellement l’enrichissement ultérieur des cellules.

Ensuite, les cellules dérivées du parasite sont transduites avec des vecteurs rétroviraux codant pour les déterminants du destin neuronal afin de les convertir directement en neurones induits. Les résultats obtenus montrent que les neurones induits sont obtenus à partir de cellules dérivées de parasites reprogrammées par lignée sur la base d’une immunocoloration pour le marqueur neuronal bêta-trois tubuline. Le principal avantage de cette approche par rapport aux méthodes existantes telles que la reprogrammation des fibroblastes ou la différenciation des cellules souches embryonnaires en neurones est que nous ciblons les cellules endogènes au cerveau, ce qui peut finalement ouvrir la voie à la conversion directe de la lignée dans le cerveau sans avoir à transplanter les cellules.

Le protocole suivant a été élaboré conformément à l’approbation du comité d’éthique de la faculté de médecine de la LMU Munich et au consentement éclairé écrit de tous les patients, en commençant par une biopsie récente du cerveau humain. Restez sur de la glace dans HBSS et des tas dissociez le tissu en cellules uniques en le transférant dans une boîte de Pétri de 65 millimètres et à l’aide de deux scalpels stériles à usage unique, coupez-le en petits morceaux. Transférez le tissu dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez trois à six millilitres de triple et incubez pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Après la réaction de digestion, ajoutez un volume de milieu de croissance préchauffé pour faciliter l’association et utilisez une pipette jetable de cinq millilitres suivie d’une pipette de pâturage en verre pour trier doucement la suspension cellulaire. Faites tourner la solution à 157 G pendant cinq minutes. Remettre la pastille en suspension dans le milieu de culture et transférer la culture dans une fiole T 75.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 5 % d’oxygène. Remplacez la moitié du milieu tous les trois à quatre jours jusqu’à ce que les cellules aient atteint la cofluidité. Lorsque les cellules ont atteint la co-fluidité, aspirez le milieu de culture et lavez-le avec du PBS à température ambiante avant d’ajouter trois millilitres de triple.

Après une incubation de cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez doucement le ballon pour aider à soulever les cellules. Ajoutez ensuite trois volumes de milieu de croissance après avoir fait tourner la suspension et la suspension des cellules dans le milieu de croissance, passez-les dans un rapport de un à trois pour un rendement optimal dans de nouveaux flacons de culture T 75.

Les cellules ont été traversées jusqu’à cinq fois sans aucun signe de reprogrammation réduite, et le nombre de cellules endothéliales deviendra négligeable à chaque passage pour effectuer l’immuno-chimie, ensemencer environ 60 000 cellules sur la lysine poly D. Le couvercle en verre revêtu se glisse dans 500 microlitres de milieu de croissance fraîche dans 24. Bien Plaques de culture tissulaire et culture.

Les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 5 % d’oxygène. Pour l’analyse immunochimique des cellules cérébrales humaines en culture, retirez le milieu et lavez-le trois fois avec un millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de paraldéhyde à 4 % dans du PBS et incuber pendant 15 minutes.

À température ambiante. Transférez les lamelles du couvercle en verre dans une chambre de coloration humidifiée appropriée et ajoutez 80 microlitres de bloc P-B-S-B-S-A Triton X 100 pendant une heure à température ambiante avant d’ajouter des anticorps primaires dilués dans la même solution et d’incuber une heure à température ambiante ou une nuit à quatre degrés Celsius. Utilisez le PBS pour laver les cellules trois fois avant d’ajouter des anticorps secondaires et de laisser incuber pendant une heure à température ambiante.

Après avoir lavé trois fois, appliquez un produit anti-décoloration et montez les lamelles. Utilisez l’épifluorescence ou la microscopie confocale pour analyser les échantillons. Respectez les directives locales en matière de biosécurité lors de la manipulation de particules rétrovirales 24 heures avant la transduction rétrovirale des graines, soit environ 60 000 cellules sur le dessus.

Le couvercle en verre revêtu de poly de lysine se glisse dans 500 microlitres de milieu de croissance fraîche dans 24. Bien les plaques de culture tissulaire et incuber à 37 degrés Celsius. Le lendemain.

Remplacez le milieu de culture par 500 microlitres de milieu de croissance frais préchauffé et ajoutez un microlitre des surnageants concentrés respectifs contenant des particules rétrovirales. Secouez doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des particules virales dans tout le puits. Un jour plus tard, retirez le milieu contenant les particules virales des cellules et ajoutez un millilitre de préchauffage frais.

Le milieu de différenciation B 27 tel que décrit dans le protocole textuel, maintient les cellules en culture pendant quatre à huit semaines sans changer le milieu car cela peut endommager les neurones induits à mesure qu’ils mûrissent pour démontrer l’acquisition d’un phénotype neuronal. Effectuer une immuno-chimie contre les antigènes neuronaux tels que la bêta trois, la tubuline, la carte deux et le nen. Comme démontré précédemment dans cette vidéo, l’immunochimie réalisée sur des cultures établies avec succès à partir du cortex cérébral adulte humain révèle un degré considérable d’hétérogénéité entre les cultures dérivées d’échantillons de patients différents, quantifié par cytométrie en flux.

Il existe une fraction substantielle de cellules qui expriment P DG FR bêta et d’autres marqueurs parasitaires tels que CD 1 46, NG deux et CD 13 sont exprimés à des niveaux inférieurs. De même, la SMA est exprimée dans une sous-population mineure de cellules cultivées au passage zéro, il y a généralement moins de 10 % de cellules endothéliales positives pour le CD 34 et elles déclinent en dessous de la détection avec un emballage supplémentaire. De même, les astrocytes ne comprennent qu’une contamination négligeable aux passages antérieurs.

Les données immuno-phytochimiques et de cytométrie en flux sont entièrement corroborées par des données quantitatives R-T-P-C-R-A. À ce stade, les faits permettent d’enrichir davantage les cellules dérivées du parasite. Ceci est particulièrement pertinent lorsque la pureté de la culture se situe à l’extrémité inférieure du spectre, comme en témoigne le niveau d’expression bêta P-D-G-F-R.

Ainsi, nous avons utilisé un anticorps contre P-D-G-F-R bêta CD un 40 B seul ou en combinaison avec un anticorps anti CD 1 46 tout en excluant tout contaminant positif CD 34 à trier. Plus précisément, les parasites qui transduisent ces cultures avec des virus témoins ne modifient pas leur profil d’expression, ce qui indique qu’ils restent dans la lignée des parasites. De même, l’expression de SOX 2 par le rétrovirus n’entraîne pas de changements morphologiques ni n’induit l’expression de la tubuline bêta-trois.

En revanche, environ 10 % des cellules ont été transduites avec un SCL A codant pour le rétrovirus seul. Présentent une expression bêta de trois tubuline, mais n’acquièrent pas une morphologie neuronale frappante près de 50 % de tous, donc deux et un SCL un cot. Les cellules transduites présentent l’expression de la tubuline bêta-trois, et un tiers d’entre elles présentent également des processus neuronaux indiquant leur conversion en SNP après cette procédure.

D’autres techniques comme l’électrophysiologie peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la maturation et la fonctionnalité des neurones induits.