Une nouvelle plate-forme d'étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la nouveauté d’une plate-forme d’étirement isotrope qui peut être utilisée pour étudier les réponses d’une cellule unique à une déformation mécanique complexe et pour quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques. Pour ce faire, il faut d’abord fabriquer la membrane flexible et monter cette membrane sur un ensemble de pinces. La deuxième étape consiste à cultiver deux cellules C 12 sur la membrane pendant la nuit, et le lendemain, à monter les pinces sur la plate-forme d’étirement.

Ensuite, dans une deuxième série d’expériences, les tissus de l’aorte thoracique sont rejetés d’un modèle de souris et nettoyés de tout tissu conjonctif. Ensuite, le tissu aortique est monté sur la plate-forme d’étirement à l’aide d’un autre ensemble de pinces. En fin de compte, la plate-forme d’étirement est utilisée pour induire une déformation dans les cellules le long de deux directions orthogonales qui peuvent être quantifiées à l’aide d’un microscope inversé.

Ou bien, un capteur de force est intégré au dispositif d’étirement pour mesurer la rigidité des tissus. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes, telles que l’étirement cellulaire uni réel ou biaxial, est qu’elle nous permet de contrôler indépendamment la déformation dans deux directions orthogonales dans une membrane transparente sur laquelle les cellules sont fixées, et donc de permettre l’imagerie de cellules vivantes. La microscopie est également une conception soignée d’un ensemble différent de pinces.

Avec l’intégration d’un utilisateur à quatre cordes sur la plateforme, nous permet d’effectuer des tests de 10 cellules sur des tissus biologiques pour la quantification de leurs propriétés mécaniques. Cette vidéo présente la plate-forme d’étirement biaxial, un appareil sur mesure qui peut être utilisé pour étudier l’effet de la déformation du substrat au niveau cellulaire et effectuer des essais de traction sur des tissus biologiques. La conception et les caractéristiques de la plate-forme d’étirement biaxiale sont détaillées dans le manuscrit ci-joint pour étudier l’effet de la déformation mécanique des cellules uniques, un substrat flexible et transparent sur lequel les cellules peuvent adhérer doit d’abord être fabriqué.

Pour commencer cette procédure, pipetez 500 microlitres d’une solution de microsphère fluorescente dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et centrifugez à 16, 200 G Pendant 10 minutes, jetez le supernat et ajoutez 500 microlitres d’isopropanol, suivi de cinq minutes de vortex. Mettez le flacon de côté toute la nuit dans l’obscurité afin de permettre à tous les gros agrégats de particules de sédimenter le lendemain matin, transférez soigneusement le SNAT dans un flacon de micro-centrifugeuse propre. Cette solution de billes peut être utilisée pour fabriquer plus de cinq substrats, car la solution de billes continuera à sédimenter pendant les trois prochains jours.

Il est important d’éviter que Resus ne suspende la pastille. Versez 0,5 gramme de l’agent de durcissement fourni avec le kit PDMS dans un flacon de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajoutez 15 microlitres de billes fluorescentes et vortex pendant une minute.

Répétez cette opération cinq fois de plus pour ajouter un total de 90 microlitres de perles Mettez de côté. Pesez 10 grammes de PDMS, ajoutez 0,5 gramme d’agent de durcissement, complété par des billes fluorescentes et mélangez pendant au moins 12 minutes. Ensuite, utilisez la pipette de transfert pour transférer quatre milligrammes de PDMS avec des billes dans un moule en forme de croix SUH 2050 préalablement fabriqué à l’aide de techniques de photolithographie standard.

Le moule a une hauteur de 320 micromètres et une superficie de 13,4 centimètres carrés et peut contenir 428 microlitres ou 440 milligrammes de PDMS durcir le PDMS pendant deux heures à 80 degrés Celsius. Après durcissement, décollez le substrat du moule, le substrat peut être conservé dans une boîte de Pétri à température ambiante pendant deux semaines sans montrer de modifications significatives et ses propriétés mécaniques. Versez des gouttelettes de PDMS dans une boîte de Pétri d’une taille finale d’environ quatre millimètres de diamètre, faites-les durcir à l’envers pendant deux heures à 80 degrés Celsius, la boîte doit être maintenue à l’envers pour éviter que les gouttes ne s’aplatissent pendant le processus de durcissement.

Ces caractéristiques d’ancrage peuvent être conservées dans une boîte de Pétri pendant des semaines. Le traitement au plasma d’air du substrat et huit caractéristiques d’ancrage, lient les caractéristiques à chaque extrémité du substrat à une distance de quatre millimètres de l’empreinte de forme carrée présente sur le substrat pour monter la membrane sur les pinces. Enroulez chaque extrémité du substrat autour de la partie cylindrique de la rainure des pinces et fixez-la en place avec les deux vis de réglage par le haut.

Vissez les quatre pinces sur le support de pince. Versez ensuite le PDMS à l’interface entre le substrat et la partie rainurée des pinces. Répartissez le PDMS non polymérisé autour de la pièce cylindrique rainurée à l’aide d’une clé hexagonale de 1,5 millimètre.

Versez le PDMS dans les rainures jusqu’à ce qu’il soit complètement rempli par capillarité et durcissez l’ensemble à 80 degrés Celsius pendant deux heures avant d’ensemencer les cellules sur la membrane. Plasma d’air. Traitez l’ensemble pour stériliser et fonctionnaliser le substrat afin de permettre l’enrobage de collagène.

Fonctionnaliser la zone du substrat où les cellules seront ensemencées avec un millilitre d’acide acétique 0,02 molaire complété par 16 microgrammes par millilitre de collagène de queue de rat à température ambiante pendant une heure. La densité finale de collagène souhaitée est de cinq microgrammes par centimètre carré Après une heure, rincez le substrat trois fois avec un tampon phosphate et laissez-le sécher à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Ajouter 40 microlitres de milieu de culture, complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline.

Streptomycine contenant 2000 cellules dans la partie centrale du substrat pour couvrir une zone d’un centimètre carré. Dans cet exemple, la densité cellulaire est de 20 cellules par centimètre carré. Cependant, la densité cellulaire peut être modifiée en fonction des exigences expérimentales.

Placez l’ensemble dans un incubateur de culture cellulaire standard avec le substrat vers le haut avec la goutte de milieu de culture contenant des cellules dessus. L’ensemble doit être conservé avec le substrat vers le haut pendant au moins trois heures pour permettre aux cellules de s’y fixer fermement afin d’éviter l’évaporation. 30 microlitres de milieu de culture chaud sont ajoutés dans la goutte sur le substrat.

Toutes les 45 minutes après trois heures, retournez l’ensemble dans une boîte de Pétri remplie de milieu de culture frais pour immerger le substrat et incuber pendant la nuit pour permettre aux cellules de proliférer le lendemain. Montez la configuration sur un microscope à contraste de phase inversé ou un microscope fluorescent. Montez l’ensemble de substrat de la pince sur la plate-forme d’étirement biaxiale, et les moteurs remplissent la boîte de Pétri à l’intérieur du réchauffeur de la boîte de Pétri avec une solution saline tamponnée HEPS fraîchement préparée.

Cette solution physiologique est utilisée pour maintenir les cellules sur la platine du microscope en imitant l’environnement sanguin normal des tissus. La même plate-forme d’étirement biaxiale peut également être utilisée pour quantifier la rigidité de petits échantillons de tissus. Des aortes de souris isolées seront utilisées dans cette démonstration.

Retirez le diaphragme, la cage thoracique et les lobes pulmonaires de la souris euthanasiée afin de minimiser le risque d’endommager les tissus. Gardez le cœur attaché à l’aorte et évitez de toucher le vaisseau directement, mais manipulé. Utiliser le cœur.

Retirez le cœur, la racine aortique et l’aorte thoracique en coupant doucement entre le vaisseau et la colonne vertébrale pour garder la structure interne du tissu intacte. Attention à ne pas induire d’allongement du vaisseau lors de l’incision. Immergez immédiatement et conservez le cœur et l’aorte dans la solution de Krebs, qui est préparée quotidiennement et maintenue à 37 degrés Celsius pendant les expériences.

Coupez et lavez soigneusement l’aorte dans la solution de Krebs pour éliminer tous les caillots sanguins en travaillant sous un microscope chirurgical de dissection. Retirez le tissu conjonctif à l’aide de micro-ciseaux et d’une pince à épiler. Il est important de conserver toute la longueur du vaisseau et d’utiliser la racine aortique pour déterminer l’orientation du vaisseau.

Les dimensions du navire déchargé sont nécessaires pour déterminer la rigidité du navire. Découpez un anneau aortique d’environ deux millimètres de long et mesurez avec précision sa longueur à l’aide d’un réglage de microscope calibré. Mettez ce segment de côté dans la solution de Kreb.

Ensuite, coupez deux petits anneaux aortiques dans les sections de l’aorte laissées après le retrait du segment de deux millimètres. Un anneau de la section de l’aorte avant le segment de deux millimètres, et un autre anneau de la section de l’aorte. Après le segment de deux millimètres, placez les deux anneaux aortiques sur une lame de verre de microscope avec la lumière vers le haut et mesurez l’épaisseur de la paroi à l’aide d’un réglage de microscope calibré.

L’épaisseur de la paroi aortique est mesurée et moyennée à l’aide de ces deux anneaux. Remplissez la boîte de Pétri sur la plate-forme d’étirement biaxiale avec la solution de Krebs et insérez le segment de l’anneau de l’aorte de deux millimètres sur les goupilles de traction. Dans ce protocole, la plateforme d’étirement biaxial a été utilisée pour étudier la réponse mécanique du noyau dans des cellules de myoblastes de souris uniques exposées à une déformation du substrat de 25 % de déformation de déplacement.

Les relations entre l’étirement standard et l’étirement uniaxial pur sont illustrées dans ces résultats représentatifs. Les perles fluorescentes sont sélectionnées manuellement sur la première image de la vidéo et suivies d’une image à l’autre jusqu’à ce que l’étirement maximal soit atteint le long des directions horizontale et verticale. Un script MATLAB calcule automatiquement les composantes du tenseur de déformation vert pour chaque image et produit une courbe d’étalonnage de la déformation en fonction de la cylindrée du moteur.

Dans ces graphiques, les lignes bleues et rouges correspondent à la composante de la tension verte le long des directions horizontale et verticale respectivement. Ces résultats illustrent les capacités de la plate-forme d’étirement biaxiale à induire une déformation du substrat le long de deux directions orthogonales. En plus des champs de déformation uni axiaux standard de l’EQU Biaxial, la plate-forme d’étirement biaxiale peut induire des champs de déformation complexes dans le substrat.

Le panneau G montre que l’étirement du même substrat de quatre millimètres le long de l’axe des x et l’étirement léger le long de l’axe des Y de 1,5 millimètre surligné en rouge, produit un champ uniaxial pur sans déformation de compression dans le substrat. Le panneau H montre que l’étirement du substrat le long de l’axe x de 3,5 millimètres produit une déformation de 25 % et une déformation compressive de 7 % lorsque les extrémités du substrat le long de l’axe vertical sont fixes, surlignées en rouge Avec la possibilité d’effectuer une imagerie par microscopie de cellules vivantes pendant l’étirement, les noyaux ont été colorés avec un colorant fluorescent de cellules vivantes qui lie l’ADN, puis étirés de 25 % le long de chaque axe d’étirement orthogonal comme Entre chaque phase du cycle d’étirement, des images de contraste et des images épifluorescentes du noyau informe et déformé ont été acquises. Les longueurs des axes nucléaires majeur et mineur le long de l’état non formé et lorsque le noyau a été étiré séquentiellement le long de ses axes majeur et mineur ont été déterminées à l’aide d’un plug-in d’image J et utilisées pour calculer le changement relatif de longueur.

Le long de chaque axe de ce graphique à barres, le X ou axe principal est représenté en bleu et le axe y ou petit axe est représenté en rouge. La capacité de déformation du noyau présente une anisotropie mécanique car il présente une capacité de déformation significativement plus élevée le long de son petit axe dans la régulation de la capacité de déformation nucléaire par rapport à son axe majeur. Il a été constaté que les filaments d’actine ou les microtubules induisaient une perte de la déformabilité anisotrope du noyau.

Ces résultats confirment que les composants du cytosquelette transmettent des forces au noyau à partir du substrat et sont également essentiels pour préserver le comportement mécanique naturel du noyau. Au cours de la déformation, la plate-forme d’étirement biaxiale a également été utilisée pour évaluer l’effet de la surexpression chronique de la protéine de choc thermique 27 ou HP 27 sur la rigidité du vaisseau HSP par rapport à l’expression. Dans un modèle murin sujet à l’athérosclérose, un POE homozygote négatif modifie la composition histologique des lésions d’athérosclérose en augmentant la teneur en cellules musculaires lisses intimales et en collagène.

Pour déterminer l’impact de ce remodelage histologique sur les propriétés mécaniques des vaisseaux, la plateforme d’étirement a été utilisée pour mesurer la rigidité aortique. Ce graphique montre une courbe de contrainte-déformation typique obtenue en étirant un vaisseau aortique alors que la rigidité est calculée à 30 % de la déformation. La rigidité est la pente de la tangente indiquée par la ligne rouge à la courbe.

Il a été constaté que la rigidité des segments aortiques de HSP 27 chez les souris exprimant était significativement augmentée de 41 % par rapport au modèle de souris témoin. Dans l’ensemble, l’évaluation mécanique combinée à l’histologie des vaisseaux et des plaques a démontré que la surexpression de HSP 27 est caractérisée par une rigidité accrue des vaisseaux et une teneur accrue en cellules musculaires lisses de collagène. Ces résultats suggèrent que HSP 27 pourrait potentiellement augmenter la stabilité des lésions athéroscléreuses et donc diminuer le risque de rupture de la plaque après son développement.

Cette technique offre une nouvelle voie aux chercheurs dans le domaine de la bio-ingénierie pour explorer la réponse cellulaire à la déformation mécanique complexe et inotrope pour des applications en biologie mécanique, mais aussi pour surveiller la mécanique des tissus biologiques dans les maladies.