Name: Une nouvelle plate-forme détirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: Découvrez une plateforme d'étirement anisotrope pour étudier les réponses cellulaires à la déformation mécanique biaxiale et quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques.

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DT a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de Le Fonds de recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) et un MITACS Elevate bourse stratégique. CMC a été soutenue par une bourse postdoctorale du Fonds le de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et Ernest et Margaret Ford cardiologie doté bourse de recherche de l&#39;Université de l&#39;Institut de cardiologie d&#39;Ottawa. EOB a été soutenu par des subventions d&#39;exploitation MOP80204 de l&#39;Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) et T6335 de la Fondation des maladies de l&#39;Ontario. Les IRSC et Medtronic fournissent collectivement EOB avec une chaire de recherche évaluées par les pairs (URC # 57093). AEP est financé par les sciences naturelles et en génie (CRSNG) subvention à la découverte, un supplément CRSNG Discovery Accelerator et reconnaît avec gratitude le soutien des chaires de recherche du Canada (CRC) et une bourse de nouveau chercheur de la province de l&#39;Ontario.

1. Déformation mécanique des cellules individuelles <ol><li> Fabrication d&#39;un substrat de PDMS avec des perles fluorescentes incorporées Avant la fabrication du substrat, les microsphères fluorescentes dans une solution d&#39;eau sont remis en suspension dans de l&#39;isopropanol pour améliorer bourrelet mélange dans les PDMS à cause de son caractère hydrophobe. <ol><li> Introduire à la pipette 500 ul de microsphères fluorescentes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et centrifuger à 16 200 xg pendant 10 min. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 500 ul d&#39;isopropanol suivi à 5 min de vortex. Mettez le flacon de côté toute la nuit dans l&#39;obscurité afin de permettre les grosses particules de granulats dans les sédiments. </li><li> Le lendemain matin, retirez délicatement le surnageant dans un flacon à centrifuger propre. Cette solution de talon peut être utilisé pour fabriquer plus de 5 substrats. NOTE: La solution de perle va continuer à sédimenter pour les 3 prochains jours. Soyez prudent pour éviter la remise en suspension du culot. </li><li> Verser 0,5 g de l&#39;agent de durcissement prévueavec le kit PDMS dans un flacon à centrifuger de 1,5 ml en utilisant une balance scientifique. Par étapes successives, ajouter un total de 90 ul de billes (15 en six ajouts ul), vortex pendant 1 minute entre chaque addition. Mettre de côté. </li><li> Peser 10 g de PDMS et mélanger pendant au moins 12 min avec 0,5 g de l&#39;agent de durcissement supplémenté avec des billes fluorescentes. </li><li> Fabriquer un SU-8 2050 moule en forme de croix en utilisant des techniques classiques de photolithographie en suivant les instructions du fabricant. Le moule utilisé a une hauteur de 320 pm et une surface de 13,4 cm 2 (figure 3). Le moule peut contenir 428 pi ou 440 mg de PDMS. </li><li> Verser 400 mg de perles avec le PDMS dans le moule en forme de croix à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert et de durcir pendant 2 heures à 80 ° C. Après durcissement, se décoller du substrat à partir du moule (figure 5A). Le substrat peut être conservé dans une boîte de Pétri à température ambiante pendant 2 semaines, sans présenter de changements importants dans les propriétés mécaniques. </li&gt; <li> Verser gouttelettes de PDMS (durcisseur: PDMS avec un ratio de 1:20) dans une boîte de Pétri avec une taille finale d&#39;environ 4 mm de diamètre et de guérir les à l&#39;envers pendant 2 heures à 80 ° C (figure 5B). Ces caractéristiques d&#39;ancrage peuvent être conservés dans une boîte de Pétri pendant des semaines. NOTE: maintenir la coupelle à l&#39;envers pour empêcher les gouttes de s&#39;aplatir au cours du processus de durcissement. </li><li> Traitement de l&#39;air-plasma (30 sec à 30 W), le substrat et 8 caractéristiques d&#39;ancrage. Lier les caractéristiques de chaque extrémité du substrat à une distance de 4 mm à partir de la forme carrée tiret présents sur le substrat (figure 5C). </li></ol></li><li> Membrane de montage sur les pinces <ol><li> Envelopper chaque extrémité du substrat autour de la partie cylindrique cannelée des pinces et le fixer en place avec les vis de fixation 2 à partir du haut (figure 2B et les figures 5D-E). </li><li> Visser les 4 pinces sur le support de serrage et versez PDMS (rapport 1:20) en utilisant un t jetableransfert pipette à l&#39;interface entre le substrat et la partie cylindrique rainurée des pinces. Répartir les PDMS non durcis autour de la partie cylindrique cannelée en utilisant une clé Allen de 1,5 mm. </li><li> Verser PDMS (01h20) dans les rainures jusqu&#39;à ce que complètement rempli par capillarité et de guérir l&#39;ensemble à 80 ° C pendant 2 heures (figure 5F). </li></ol></li><li> Ensemencement des cellules sur la membrane <ol><li> Traitement de l&#39;air-plasma (30 sec à 30 W) toute l&#39;assemblée à stériliser et fonctionnaliser le substrat pour permettre revêtement de collagène. </li><li> Fonctionnaliser la surface du substrat où les cellules sont ensemencées avec 1 ml de 0,02 M d&#39;acide acétique additionné de 16 pg / ml de collagène de queue de rat à la température ambiante pendant 1 heure. La densité souhaitée finale en collagène est de 5 ug / cm 2. </li><li> Rincer le 3x de substrat avec un tampon phosphate et le laisser sécher à la température ambiante pendant au moins 10 min. </li><li> Ajouter 40 ul de milieu de culture supplémenté avec 10% de fœtus bovin serum et 1% de pénicilline-streptomycine contenant 2000 cellules dans la partie centrale du substrat pour couvrir une surface de 1 cm 2 (densité de cellules: 20 cellules / mm 2). La densité cellulaire peut être modifiée selon les exigences expérimentales. </li><li> Mettre l&#39;ensemble de l&#39;assemblage dans un incubateur de culture cellulaire standard avec le substrat vers le haut avec la goutte de milieu de culture contenant les cellules sur elle. NOTE: Le montage doit être conservé avec le substrat vers le haut pendant au moins 3 heures pour permettre aux cellules de se fixer fermement. Pour empêcher l&#39;évaporation, 30 ul de milieu de culture chaud est ajouté dans la goutte sur le substrat tout 45 min à 3 h. </li><li> Après 3 heures, retourner l&#39;ensemble de l&#39;assemblage d&#39;une boîte de Pétri remplie de milieu de culture frais pour immerger le substrat et incuber pendant une nuit pour permettre aux cellules de proliférer. </li><li> Le lendemain, préparer une solution de sel tamponnée par HEPES (HBSS, 20 mM de Hepes, 120 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 0,8 mM de MgSO 4, 1,8 mM de CaCl2, et 11,1 mM de dextrose). Ajuster le pH à 7,4. REMARQUE: La solution HBSS doit être préparée chaque jour et maintenu à 37 ° C au cours des expériences. Cette solution physiologique est utilisé pour maintenir les cellules sur la platine du microscope en imitant l&#39;environnement tissu / sang normal. </li><li> Monter le set-up sur le contraste de phase inversée ou microscope à fluorescence Monter le montage pince-substrat sur la plate-forme et les moteurs Baxs. Remplissez la boîte de Petri dans le plat chauffe Petri avec du tampon HEPES (figure 2D). </li></ol></li></ol> 2. Rigidité jaugeage des bateaux de petit calibre <ol><li> Préparation <ol><li> Solution physiologique de Krebs: Préparer une solution de 118,1 mM de NaCl, 11,1 mM de D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, et 2,5 mM de CaCl2. Ajuster le pH à 7,4 et oxygéner la solution avec du gaz médical de carbogène (95% O 2/5% CO 2) pendant 30 min. NOTE: La soluti Krebssur doit être préparé chaque jour et maintenu à 37 ° C au cours des expériences. Cette solution physiologique est utilisé pour maintenir les tissus vivants en imitant l&#39;environnement tissu / sang normal. </li><li> Recueillir l&#39;instrumentation pour la dissection et l&#39;évaluation mécanique des navires de l&#39;aorte: ciseaux chirurgicaux, pinces courbées, micro-ciseaux, chirurgical dissection microscope, tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène, et 10 ml de pipettes sérologiques. La procédure chirurgicale et expérience ne nécessite pas de conditions stériles. Monter les mâchoires de la plate-forme Baxs avec la cellule de pesée à l&#39;avance. </li></ol></li><li> Isolation des tissus et Dissection Toutes les procédures expérimentales sur des animaux de laboratoire doivent être approuvés par le Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux des utilisateurs de l&#39;institution, qui est conforme à la Guide de santé pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des utilisateurs de pays. <ol><li> Pratiquer l&#39;euthanasie de la souris à l&#39;inhalation de 99% de CO 2 (7 psi)dans une chambre en plexiglas (Figure 6A). </li><li> Abdomen ouvert de la souris et couper l&#39;aorte thoracique à saigner de la souris. </li><li> Retirer le diaphragme, la cage thoracique et les lobes pulmonaires (figure 6B). REMARQUE: Pour réduire le risque d&#39;endommager le tissu, garder le cœur attaché à l&#39;aorte et éviter de toucher directement le navire, mais manipuler en utilisant le coeur. </li><li> Retirez le cœur, la racine de l&#39;aorte et l&#39;aorte thoracique en coupant délicatement entre le navire et la colonne vertébrale. NOTE: Ne pas faire tout allongement dans le navire pendant l&#39;excision de conserver la structure interne du tissu intact (figure 6C). </li><li> Immerger immédiatement et garder le coeur et l&#39;aorte dans une solution de Krebs. </li><li> Couper et laver l&#39;aorte dans une solution de Krebs pour enlever les caillots de sang attentivement. Retirer le tissu conjonctif à l&#39;aide des micro-ciseaux, pince à épiler et chirurgicale dissection microscope (Figure 6D-E). REMARQUE: Conservez toute la longueur du navire et utilisez le pétrolier ravitailleurtic racine pour déterminer l&#39;orientation de la cuve. </li></ol></li><li> Navire Dimension Détermination et montage Pour déterminer la rigidité de l&#39;enceinte, les dimensions du réservoir déchargées sont nécessaires et peuvent être déterminées avec un microscope étalonné. <ol><li> Couper un anneau aortique d&#39;environ 2 mm de longueur et de mesurer précisément la longueur avec un réglage (figures 6F-G) microscope calibré. Mettez de côté ce segment dans une solution de Krebs. </li><li> Couper un autre anneau aortique aussi faible que possible entre chacun des segments de 2 mm (figure 6F). Mettez ce petit segment sur ​​une lame de verre de microscope avec la lumière vers le haut et de mesurer l&#39;épaisseur de la paroi à l&#39;aide d&#39;un réglage du microscope calibré (figure 6H). </li><li> Remplir la boîte de Pétri sur la plate-forme Baxs avec une solution de Krebs et insérer le segment de bague d&#39;aorte de 2 mm sur les broches de traction (encart sur ​​la figure 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. PDMS substrat fabrication et de montage A). Après durcissement, le substrat est soigneusement pelées 2050 moule SU-8 et mis de côté dans une boîte de Pétri. B) caractéristiques fabriqués à partir de PDMS ancrage et aident à garantir le substrat sur ​​la pinces. C) Substrat avec ancrage caractéristiques prêts pour le montage. D) Le substrat est monté sur les 4 pinces, qui sont ensuite montés sur le support de serrage (voir encadré). E) image détaillée du substrat monté sur les 4 pinces. F ) Procédure de verser PDMS dans la rainure sous le substrat. La flèche indique le PDMS remplissage lentement la gorge par capillarité. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 6. Préparation et isolement de l&#39;aorte thoracique. A) Préparation des instruments chirurgicaux et la souris euthanasiées. B) Grâce à une incision abdominale longitudinal, la cage thoracique et lobs pulmonaires sont retirés C). L&#39;aorte est soigneusement éliminé en utilisant le cœur à manipuler le tissu. D) Le coeur et l&#39;aorte sont mis dans une solution physiologique de Krebs. L&#39;aorte est nettoyé en retirant tous les tissus conjonctifs. E) image détaillée montrant le cœur et l&#39;aorte. F) secteur aorte utilisée pour l&#39;évaluation de la rigidité avec de petits segments utilisés pour la mesure d&#39;épaisseur. GH) La longueur exacte (G) et l&#39;épaisseur (H) chacun des segments de vaisseau sont évaluées en utilisant un microscope inversé et un programme d&#39;analyse.

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<li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La plate-forme Baxs présenté ici facilite de nombreuses expériences dans l&#39;étude de mécanobiologie, des enquêtes de cellules individuelles dans les tissus entiers. En outre, la plate-forme est très flexible et configurable, permettant ainsi à de nombreuses expériences de stimulation mécanique et les essais de traction multi-axiale. La plate-forme permet en outre le maintien des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques et permet une microscopie simultanée au cours d&#39;expériences d&#39;étirement. L...

Le micro-mécanique joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération, la migration, la différenciation et qui ont un impact considérable dans le développement et l&#39;homéostase des tissus et également dans des maladies 6.1. Au fil des ans, une multitude d&#39;outils expérimentaux ont été utilisés pour stimuler mécaniquement les cellules ou les tissus et mesurer les propriétés mécaniques des tissus biologiques avec l&#39;objectif d&#39;accroître notre compréhension de mécanobiologie de base et l&#39;étude de l&#39;apparition et la progression des maladies 6-17. Cependant, il faut souvent compter plusieurs différents dispositifs expérimentaux en vue d&#39;atteindre les objectifs d&#39;une étude particulière. Cet article présente une plate-forme unique, multi-fonctionnel, étirage biaxial (Baxs) qui permet à des études qui se penchent sur le rôle que les propriétés mécaniques et les forces mécaniques jouent en biologie à la sous-cellulaire à des échelles de longueur de tissu ensemble. La plate-forme Baxs permet non seulement de la quantification des propriétés mécaniques des tissus isolés, mais aussi facilite l&#39;aptitude à appliquer des champs de contrainte simples, complexes et dynamiques pour les cellules vivantes, pour comprendre leur réponse à l&#39;étirement qui se produit in vivo. La plate-forme Baxs maintient également la capacité d&#39;effectuer la microscopie de cellules vivantes au cours des essais et les perturbations mécaniques sur des cellules et des tissus. La plate-forme Baxs est un appareil sur-mesure qui peut être utilisé pour étudier l&#39;effet de la déformation du substrat au niveau cellulaire, et effectuer des essais de traction sur des tissus biologiques (Figure 1A). Un dispositif de chauffage de l&#39;aluminium a été fabriquée pour recevoir une boîte de Petri de 10 cm standard et maintenir des solutions physiologiques à 37 ° C en utilisant un régulateur de température et chauffe kapton (Figure 1B). Cette plate-forme de Baxs peut être intégré sur un contraste de phase inversée et / ou le microscope de fluorescence et permet une imagerie simultanée (Figure 1C).En bref, la plate-forme Baxs se compose de quatre moteurs à bobine mobile linéaire dont les parties mobiles sont montées sur des mini-billes à mouvement linéaire portant des glissières orientées le long de deux axes perpendiculaires (figure 1D). Un étage de positionnement linéaire est monté à chacun des quatre moteurs pour permettre le mouvement vertical de l&#39;ensemble de serrage qui sera utilisée (Figure 1E). La position de chaque moteur est contrôlée par un codeur optique avec une résolution de 500 nm (Figure 1F). Les quatre moteurs sont commandés indépendamment avec un contrôleur de mouvement employant retour codeur optique pour exécuter des commandes de mouvement (figure 1G). Une interface de LabVIEW fournit un contrôle total sur la grandeur de déplacement, la vitesse, et l&#39;accélération de chaque moteur afin de générer une déformation complètement personnalisable, statique et dynamique, des cellules ou des échantillons de tissus. La technique utilisée pour induire une déformation dans les cellules est obtenue par simple allowing de cellules à adhérer fermement à un substrat flexible et transparent, et puis en étirant ce substrat en utilisant les quatre moteurs de la plate-forme Baxs. La plate-forme Baxs permet le montage de n&#39;importe quel ensemble de pinces pour fixer le substrat sur les moteurs à bobine mobile conçu sur mesure. A cet effet, nous avons conçu un ensemble de pinces à laquelle un substrat flexible et transparente, faite de polydiméthylsiloxane (PDMS), peut être fixé (figures 2A-C et Figure 3). Comme les pinces seront exposés à des solutions physiologiques, toutes les pièces ont été usinés à partir d&#39;acier inoxydable pour permettre la stérilisation. Ces colliers de serrage ont été soigneusement conçus pour amener le substrat le plus près possible de l&#39;objectif du microscope pour améliorer la qualité de l&#39;image tout en réduisant au minimum la contrainte sur le substrat lors de l&#39;étirage (Figure 2D). La même plate-forme de Baxs peut également être utilisée pour quantifier la rigidité de petits échantillons de tissu, en utilisant un ensemble approprié de pinces avec des adapted supports pour les échantillons de tissu et une cellule de charge pour surveiller les forces. Plusieurs approches peuvent être utilisées pour monter un tissu pour les moteurs de plate-forme Baxs; dans ce cas, les inox minutiens insectes broches peuvent accrocher à travers l&#39;ouverture des tissus vasculaires afin d&#39;effectuer des essais de traction (figures 4A-B). En variante, pour les tissus épais sans une ouverture naturelle, des bords de tissus peuvent être soit maintenues en position avec les pinces fixées aux moteurs à bobine mobile ou collés sur les petites lames de verre avec de la colle biologique et attachés aux moteurs avec les pinces. Afin d&#39;effectuer la traction teste une cellule de charge miniature est nécessaire et peut être facilement incorporée sur les moteurs de plate-forme Baxs et sert à mesurer la force agissant sur ​​le tissu pendant un cycle d&#39;étirage (Figure 4C). Comme la plate-forme Baxs est composé de quatre moteurs, l&#39;introduction d&#39;une seconde cellule de charge permet d&#39;effectuer les essais de traction le long de deux directions orthogonales. Cette capacité permet de QUANTIFy la rigidité mécanique d&#39;un tissu unique le long de deux directions perpendiculaires au cours de la même expérience. Fait important, dans toutes les configurations, les cellules ou des échantillons de tissus d&#39;intérêt sont toujours maintenues dans un bain à température contrôlée qui est accessible à l&#39;utilisateur. Cette capacité permet l&#39;introduction d&#39;agents pharmacologiques échantillon pendant l&#39;étirage, afin d&#39;examiner la réponse temporelle de l&#39;échantillon. De plus, comme l&#39;axe optique du microscope inversé reste dégagée, toutes les formes de microscopie sont encore à la disposition de l&#39;utilisateur. Enfin, comme toutes les quatre moteurs de la plate-forme Baxs sont indépendantes, il est possible d&#39;appliquer des champs de déformation hautement configurables à l&#39;échantillon d&#39;intérêt. Dans des cellules et des tissus in vivo sont exposés au complexe et anisotrope étirement qui peut être plus appropriée imité dans cette plate-forme, par opposition à uniaxiale plate-forme d&#39;étirement 7,13,15,18,19 traditionnelle. En outre, les caractéristiques physiquesdu champ de déformation peut être modifié à la volée lors d&#39;une expérience. Ces capacités permettent à l&#39;utilisateur d&#39;examiner la réponse cellulaire et tissulaire à niveau d&#39;un grand nombre de très complexe, anisotrope, temporellement et spatialement divers champs de déformation. Cet article décrit les avantages et les limites de la plate-forme Baxs ainsi que sa conception, les principes de fonctionnement et les détails expérimentaux pour une seule cellule et expériences de tissus entiers. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la plate-forme Baxs. A) Vue du haut de la plate-forme Baxs montrant les quatre moteurs à bobine mobile. B) de l&#39;image détaillée de la boîte de chauffage Petri utilisé pour maintenir les cellules et les tissus à 37 ° C. C) La plate-forme peut être monté sur un microscope inversé à effectuer en direct imagerie cellulaire lors des expériences étirement.D) image détaillée du moteur à bobine mobile; la partie mobile de la plate-forme. E) image détaillée de la phase de positionnement linéaire permettant le déplacement vertical des systèmes de serrage. F) d&#39;image détaillée de l&#39;encodeur optique qui fournit la position en temps réel du moteur au contrôleur de mouvement G) de l&#39;image détaillée. de la commande de mouvement montrant les quatre entrées du codeur optique et des sorties de puissance pour les quatre moteurs à bobine mobile. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Système de serrage pour les expériences étirement des cellules. AB) Les photos montrant les détails des pinces servant à fixer le substrat de PDMS pour des moteurs à bobine mobile pour l&#39;étirage. C) Le substrat est enroulé autour de la partie cylindrique de la bride d&#39;ancrage avec son features assis dans la rainure en haut. Ensuite, le substrat est fixé à l&#39;aide des vis de fixation qui poussent le substrat / ancrage fonctionnalités dans la rainure supérieure. D) Illustration de la plate-forme Baxs avec les pinces maintenir le substrat en place. L&#39;encart montre une vue de détail du substrat de cellules attachées à elle repose juste au-dessus d&#39;une lamelle couvre-objet et l&#39;objectif de microscope. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Projet de loi de matériaux de la membrane et son système de serrage. Dessins indiquant les dimensions des pièces principales intégrées à la plate-forme bi-axial pour effectuer des expériences étirement des cellules. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Exsuffisamment d&#39;un système de serrage pour l&#39;évaluation de la rigidité des petits vaisseaux de gros calibre. AB) des images détaillées de l&#39;ensemble de serrage utilisé pour induire une déformation dans une aorte mm diamètre de la souris. Goupilles en acier inoxydable ont été soigneusement façonnés en triangles ouverts pour permettre au navire de coulisser sur les deux broches. C) Illustration de la plate-forme Baxs avec les pinces de fixation du récipient et une cellule de charge fixée entre le moteur et la bride fixe gauche. L&#39;encart montre une vue de dessus détaillée du navire monté sur les broches.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Le rapport base/réticulant utilisé dans ce protocole est de 20:1. Mélangez dans un capot laminaire pour empêcher la poussière de contaminer votre&nbsp ;</td></tr><tr><td>FluoSpheres microsphères fluorescentes</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Tenir à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>Bobine mobile linéaire</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>Le motro est livré en deux pièces (aimant et bobine). Il doit être monté sur un système de roulement à billes pour être fonctionnel.</td></tr><tr><td>Glissière à roulement à billes</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Glissières à roulement à billes à mouvement linéaire miniatures et petites Platines</td></tr> de <tr><td>positionnement linéaire Edmund</td><td>Optics</td><td>38-960</td><td>Entraînement central 1,25" Étages de translation linéaire carrés</td></tr><tr><td>Codeur optique</td><td>GSI microE systèmes Mercury</td><td>II 1600S - Encodeur incrémental réfléchissant de résolution 0,5um</td><td>.</td></tr><tr><td>Contrôleur de mouvement</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 avec AMP-20440</td><td>Contrôleur 4 axes avec amplificateur 4 axes</td></tr><tr><td>Capteur de charge</td><td>miniature Honeywell</td><td>31 avec</td><td>une plage de 0 à 150 g</td></tr><tr><td>Goupilles de minutiens d’insectes (0,20 mm)</td><td>Service de goupilles Austerlitz Goupilles</td><td></td> anti-insectes <td>Goupilles en acier inoxydable pliées en forme de triangle ouvert</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Photorésine négative époxy permanente. Tenir à l’abri de la chaleur et de la lumière</td></tr><tr><td>Système de traitement air-plasma</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow Oxygen Plasma System</td></tr><tr><td>Collagène à queue de rat</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Collagène I, queue de rat 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>Colorant fluorescent spécifique à l’ADN. Conserver au réfrigérateur.</td></tr><tr><td>Résistances flexibles isolées Kapton (film polyimide)</td><td>omega.ca</td> les résistances flexibles <td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V ; peuvent être fournies avec un</td></tr><tr><td>régulateur de température et de processus 24 V 1/16 DIN Autotune</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>Régulateur de température ; alimentation 24 V.</td></tr><tr><td>Milieu de culture</td><td>DMEM Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco' s Modifié 30 Eagle Medium. Garder à 4 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Conserver le bouillon congelé. Maintenir la solution de travail à 4 &#176 ;C.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>Conserver congelé.</td></tr><tr><td>Trypsine 0.05 %</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.02</td><td>Conserver congelé. Digestion des protéines d’attachement cellulaire pour la sous-culture</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>Solution saline tamponnée HEPES&nbsp ;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique de Krebs</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Solution saline tamponnée HEPES / Solution physiologique de Krebs</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Solution physiologique de Krebs</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Solution physiologique de Krebs</td></tr><tr><td>Carbogen 95 % O2/5 % CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN :02154749</td><td>Krebs solution physiologique Oxygénation</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Agent de dépolymérisation des microtubules</td></tr><tr><td>Cytochalasine-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Agent de dépolymérisation des filaments d’actine</td></tr><tr><td>Anti-&alpha ;- SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Utilisé pour colorer et quantifier la teneur en cellules musculaires lisses</td></tr><tr><td>Coloration rouge Picrosirius</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>Utilisé pour colorer et quantifier la teneur en collagène</td></tr></tbody></table>

une nouvelle plate-forme d&#39;étirement pour applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Des outils qui permettent l&#39;application de forces mécaniques de cellules et de tissus ou qui peuvent quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques ont contribué considérablement à la compréhension de mécanobiologie de base. Ces techniques ont été largement utilisés pour démontrer comment l&#39;apparition et la progression de diverses maladies sont fortement influencés par des signaux mécaniques. Cet article présente une plate-forme multi-fonctionnelle étirage biaxial (Baxs) qui peuvent soit stimuler mécaniquement des cellules individuelles ou de quantifier la rigidité mécanique des tissus. La plate-forme est constituée de quatre Baxs moteurs à bobine mobile qui peuvent être contrôlés de manière indépendante. Les cellules individuelles peuvent être cultivés sur un substrat flexible qui peut être attaché aux moteurs permettant une pour exposer les cellules à des champs de contraintes complexes, dynamiques, et variant spatialement. A l&#39;inverse, par incorporation d&#39;une cellule force de charge, on peut aussi quantifier les propriétés mécaniques des tissus primaires tels qu&#39;ils sont exposés à des cycles de déformation.Dans les deux cas, un ensemble propre de pinces doit être conçu et monté sur les moteurs de plate-forme Baxs afin de maintenir fermement le substrat flexible ou le tissu d&#39;intérêt. La plate-forme Baxs peut être monté sur un microscope inversé pour effectuer simultanément la lumière transmise et / ou de l&#39;imagerie de fluorescence d&#39;examiner la réponse structurelle ou biochimique de l&#39;échantillon au cours d&#39;expériences d&#39;étirement. Cet article fournit des détails expérimentaux de la conception et de l&#39;utilisation de la plate-forme Baxs et présente les résultats pour une seule cellule et études de tissus entiers. La plate-forme Baxs été utilisé pour mesurer la déformation des noyaux dans des cellules de myoblastes de souris individuelles en réponse au substrat souche et de mesurer la rigidité d&#39;aortes de souris isolées. La plate-forme Baxs est un outil polyvalent qui peut être combiné avec différentes microscopies optiques afin de fournir de nouveaux aperçus mécanobiologique au niveau des tissus sous-cellulaire, cellulaire et tout.

Cellule Stretching La plate-forme Baxs a été utilisé pour étudier la réponse mécanique du noyau dans des cellules de myoblastes de souris simples (C2C12) est exposé à une déformation de substrat de 25%. Cellules myoblastes sont trouvées dans les tissus musculaires et sont constamment exposés à un étirement et une compression mécanique in vivo. Les propriétés de la forme et mécaniques du noyau cellulaire ont montré à jouer un rôle majeur dans la régulation de l&#39;e...

Nous présentons dans cet article une nouvelle plate-forme d&#39;étirage qui peut être utilisé pour étudier les réponses des cellules individuelles à une déformation mécanique biaxial anisotrope complexe et quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques.

Une nouvelle plate-forme d&#39;étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la nouveauté d'une plateforme d'étirement anisotrope pouvant être utilisée pour étudier les réponses individuelles des cellules à des déformations mécaniques complexes et pour quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques. Ceci est réalisé en premier lieu en fabriquant la membrane souple et en fixant cette membrane sur un ensemble de pinces. La deuxième étape consiste à cultiver des cellules C deux C 12 sur la membrane pendant une nuit, puis, le jour suivant, à monter les pinces sur la plateforme d'étirement.Ensuite, dans un second ensemble d'expériences, des tissus aortiques thoraciques sont prélevés à partir d'un modèle murin et débarrassés de tous les tissus conjonctifs. Puis, le tissu aortique est fixé sur la plateforme d'étirement à l'aide d'un autre jeu de pinces. Enfin, la plateforme d'étirement est utilisée pour induire une déformation des cellules selon deux directions orthogonales, déformation qui peut être quantifiée à l'aide d'un microscope inversé.Ou, de manière alternative, un transducteur de force est intégré au dispositif d'étirement pour mesurer la rigidité du tissu. Le principal avantage de cette

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans la culture à la fois à deux dimensions et en trois dimensions paradigmes.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

La méthode présentée implique l’étirement uniaxial des hydrogels mous 3D incorporés dans le caoutchouc de silicone tout en permettant la microscopie confocale vivante. La caractérisation des souches externes et internes d’hydrogel ainsi que l’alignement des fibres sont démontrés. Le dispositif et le protocole développés peuvent évaluer la réponse des cellules à divers régimes de déformation.

Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

Cette étude présente un nouveau protocole pour appliquer directement une force mécanique sur le noyau cellulaire par le biais de microbilles magnétiques livrées dans le cytoplasme et pour effectuer simultanément l’imagerie fluorescente de cellules vivantes.

Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

Présenté ici est une méthode pour phénotyper mécaniquement des cellules individuelles en utilisant une plate-forme microfluidique basée sur l’électronique appelée détection mécano-nœud-pore (mécano-NPS). Cette plateforme maintient un débit modéré de 1 à 10 cellules/s tout en mesurant les propriétés biophysiques élastiques et visqueuses des cellules.

Mechano-node-pore Sensing: une plate-forme rapide et sans marquage pour les mesures viscoélastiques multi-paramètres à cellule unique

Nous présentons ici un appareil d’étirement équibiaxial polyvalent, à commande pneumatique et compatible avec la microscopie à haute résolution.

Dispositif d’étirement équibiaxique pour microscopie confocale à fluorescence à cellules vivantes à fort grossissement

Ici, nous présentons un dispositif novateur qui applique des formes d’onde de déformation isotropes et uniaxiales aux cellules tout en soutenant la culture sur des substrats à rigidité accordable et matrices protéiques personnalisables. Cette plateforme simple et économique permet aux chercheurs d’étudier comment les indices mécaniques régulent la fonction cellulaire, tant dans les études fondamentales que dans des contextes liés aux maladies.

Une plateforme novatrice pour l’étirement et l’imagerie cellulaire in vitro

Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Découvrez une plateforme d'étirement anisotrope pour étudier les réponses cellulaires à la déformation mécanique biaxiale et quantifier les propriétés mécaniques des tissus biologiques.

Une nouvelle plate-forme d'étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

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