Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

Dans cette méthode, la force est directement appliquée au noyau. Cela découple l’effet de transmission de force de la membrane plasmique cellulaire et du cytosquelette, révélant les mécanismes moléculaires de la mécanodétection nucléaire. La force est appliquée dans les cellules vivantes de manière non invasive.

Par rapport aux pinces optiques, le champ magnétique et la force magnétique n’affectent pas les fonctions de la cellule et ont un débit plus élevé. Commencez à cultiver les cellules avec des microbilles magnétiques en pesant 0,2 gramme de microbilles de fer carbonyle ayant sept micromètres de diamètre moyen. Suspendre les microbilles dans un milieu de culture RPMI 1640 d’un millilitre à l’aide d’une pipette.

Ensuite, apportez la boîte de Petri avec des cellules B2B à l’armoire de biosécurité et ajoutez rapidement 200 microlitres du milieu contenant des microbilles dans la boîte de Pétri. Mettez la boîte de Petri dans un incubateur jusqu’à ce que les microbilles soient internalisées par les cellules. Ouvrez le microscope inversé et, à l’aide de l’imagerie confocale par fluorescence, déterminez le moment optimal pour l’internalisation des lignées cellulaires toutes les six heures en visualisant la limite microbille, nucléaire et cellulaire.

Les microbilles internalisées seront présentes à l’intérieur des limites cellulaires. Pour les applications à petite force et l’imagerie de cellules sous tension, ouvrez l’application logicielle Elements. Pour définir la recherche magnétique de configuration, cliquez sur le bouton un sur deux pour définir la vitesse de numérisation sur une image toutes les deux secondes.

Définissez la taille du sténopé sur 1,2 unité Airy. Vérifiez uniquement le canal FITC et réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro, intensité laser sur 10. Pour définir le noyau YAP magnétique de configuration, définissez la vitesse de numérisation sur une image toutes les quatre secondes en cliquant sur le bouton un sur quatre.

Cliquez ensuite sur le bouton de l’unité 1.2 Airy pour définir la taille du sténopé sur 1.2 Airy unit et vérifiez le canal FITC. Réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro, intensité laser sur 10. Pour l’imagerie de la limite du noyau et de l’intensité de la coloration nucléaire, vérifiez le canal cyanine 5.

Ne cliquez pas sur le bouton de l’unité 1.2 Airy et réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro et intensité laser sur 10. La taille du sténopé sera optimisée pour l’imagerie protéique tridimensionnelle associée à YES. Ensuite, activez le DIA via Elements.

Ouvrez la vue de rotation, utilisez un fond clair et ajustez la mise au point de l’objet pour obtenir une image nette des cellules. Utilisez un objectif 10X pour trouver plusieurs cellules individuelles appropriées dans trois conditions, comme une cellule avec une seule microbille à l’intérieur, avec plusieurs microbilles à l’intérieur et sans microbille à l’intérieur. Ensuite, passez à l’objectif 40X et nommez cette position avec le numéro de position approprié.

Ouvrez Eléments, cliquez sur Recherche magnétique, supprimez le verrouillage, puis scannez les onglets, puis sélectionnez les boutons supérieur et inférieur pour ajuster la position Z du plan focal afin de définir les limites inférieure et supérieure de la pile Z des cellules sélectionnées. Arrêtez l’analyse en cliquant à nouveau sur Analyser. Passez à la configuration du noyau YAP magnétique et définissez le nom de fichier sur before_small_force.nd2.

Cliquez sur le bouton d’exécution avec la pile Z enregistrée. Passez au bon chemin lumineux et activez DIA. Ouvrez la vue spin et cliquez sur le bouton d’enregistrement.

Déplacez l’aimant à 46 millimètres au-dessus du fond de la boîte de Petri en faisant tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant. Enregistrez et regardez la vidéo pour confirmer le déplacement des microbilles induit par la force magnétique. Répétez la procédure d’analyse en définissant le nom de fichier comme after_small_force.nd2.

Ensuite, passez à la bonne trajectoire de lumière, activez DIA et ouvrez la vue de rotation avant de cliquer sur le bouton d’enregistrement. Faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant jusqu’à 120 millimètres au-dessus du fond de la boîte de Petri et enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en fond clair. Répétez les étapes d’analyse en définissant le nom de fichier sur before_large_force.nd2.

Les microbilles ne peuvent pas émettre de fluorescence sous excitation laser dans le canal FITC ou cyanine 5. Ainsi, les microbilles internalisées ont été identifiées par le creux foncé situé dans l’imagerie confocale de fluorescence de la protéine et du noyau associés à YES. La circularité nucléaire n’a montré aucune différence significative entre les cellules témoins et les cellules avec internalisation des microbilles.

Le rapport noyau de cellules protéiques associées à la YES au cytoplasme des cellules témoins co-cultivées avec des microbilles mais sans internalisation et des cellules avec internalisation des microbilles n’a pas non plus montré de différence significative. La déformation du noyau et la dépolymérisation de l’actine ont été causées par la force de compression appliquée par les microbilles dans les cellules contenant le cytosquelette. Courbe d’étalonnage de l’analyse d’imagerie quantitative fournie par la relation quantitative de déplacement de force AFM.

Sur la base de cette relation, la force appliquée aux perles a été estimée. La déformation du noyau et la translocation protéique associée à YES ont été observées lors de l’application ou de la libération de la force magnétique. Les changements d’intensité de la protéine associée à YES dans le canal vert et aucun changement dans la coloration du noyau dans le canal rouge ont confirmé que la déformation nucléaire induite par la force magnétique déclenchée par la translocation de protéines associées à YES.

La quantification de la variation nette du rapport noyau de protéines associées à la YES au cytoplasme au sein de deux groupes a confirmé que la force magnétique appliquée aux microbilles dans le cytoplasme induisait la translocation de protéines associées à YES et modifiait le rapport noyau protéique associé à YES. Avant d’appliquer la force et l’imagerie, assurez-vous que les cellules ont internalisé les microbilles magnétiques et que les billes sont à l’intérieur des limites cellulaires.