High Yield purification de Plasmodium falciparum Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

L’objectif global de cette procédure est de générer des maites de plasmodium falciparum purs à haut rendement pour la quantification de leur opsonisation par les anticorps humains. Ceci est accompli en inhibant d’abord la rupture du Sschon avec le E 64 pour générer des structures de maite fermées par une membrane. Dans la deuxième étape, les maïtes libres sont récoltés puis colorés avec du bromure AUM pour la quantification, dans la dernière étape, les maïtes sont incubés avec divers échantillons de plasma humain et du THP une cellule monocytaire humaine.

En fin de compte, l’opsonisation des maites par les différents échantillons de plasma humain peut être différenciée par cytométrie en flux. Les avantages de cette technique par rapport aux tests existants d’immunité fonctionnelle contre le paludisme sont que des mes intacts sont utilisés et que les réponses à la phagocytose sont robustes et quantifiables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie du paludisme, telles que l’importance des anticorps oxydants et de la phagocytose pour l’immunité contre le paludisme chez les personnes vaccinées ou exposées naturellement ?

La visualisation de cette technique est essentielle car le timing de E 64 est essentiel pour assurer la formation du mézo. Et parce que la préparation et le dénombrement des mézos sont techniquement exigeants : après la séparation magnétique de P falciparum à un stade avancé, les trophozoïtes évaluent la maturation du parasite en fixant une fine couche de parasites dans du méthanol à 100 % pendant 10 secondes et en les colorant à Gizeh pendant trois minutes. Examinez la lame de coloration au microscope pour vous assurer que les parasites remplissent presque les globules rouges et semblent être au début du stade zen.

Si les parasites n’ont pas atteint le stade de maturation approprié, continuez à les incuber jusqu’à ce qu’ils se développent convenablement. Une fois qu’ils sont suffisamment mûrs, traitez le schon isolé avec 10 micromolaires E 64 et incubez-les pendant six à 10 heures supplémentaires. Après l’incubation avec E 64, préparez un frottis des parasites traités.

Fixez la lame dans du méthanol à 100 % et colorez-la avec du Gizeh pour confirmer qu’au moins 50 % des parasites ont formé une membrane. Les maïtes enfermés pelletent le reste du schon traité E 64 pendant huit minutes à 1900 G à température ambiante. Lavez ensuite les parasites dans 50 millilitres à température ambiante.

Laver le médium pour enlever tout sérum humain restant. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille de parasite dans deux millilitres de produit de lavage, puis filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre à seringue de 1,2 micromètre, en recueillant les maïtes et les cristaux d’hémon dans un tube de 10 millilitres. Ensuite, fixez une petite colonne magnétique à un aimant et équilibrez-la avec 500 microlitres de THP un média.

Passez le filtrat trois fois sur la colonne magnétique, en recueillant les maïtes dans le flux à chaque fois. Rincez ensuite la colonne avec deux millilitres de température ambiante. THP un média pour collecter les maites restantes.

L’élimination de l’hémine est une étape critique pour la purification des maites. Si les maites ne sont pas séparés de l’hémine, des amas d’hémine maite se formeront, ce qui entraînera un comptage imprécis des maites par cytométrie en flux. THP une cellules con phagocyse hem hemin, de sorte que les amas d’hemine meite peuvent également être ceto.

Ainsi, si l’hémine n’est pas éliminée, le potentiel d’opsonisation du plasma testé sera également surestimé. Colorez les maïtes collectés à 10 microgrammes par millilitre de bromure de rahy à température ambiante à l’abri de la lumière. Après 30 minutes, essorez les maites, jetez le surnageant dans un conteneur à déchets approprié et lavez la pastille de maite dans quatre millilitres de maite mites à un média.

Ensuite, suspendez les cellules dans 15 millilitres de TP, un milieu à l’abri de la lumière. Quantifier les maïtes par cytométrie en flux. Comptez les maïtes à une sur 100, une sur 50 et une sur 25 dilutions.

Tout d’abord, distribuez 940, 930 et 910 microlitres de PBS plus BSA dans trois tubes de fax différents et ajoutez respectivement 10, 20 et 40 microlitres de maites purifiés dans chaque tube. Ensuite, vortex à température ambiante en comptant les billes pendant 30 secondes, puis ajoutez 50 microlitres de perles dans chaque tube de fax contenant les particules diluées. Analysez les trois échantillons de maite dilués sur un cytomètre en flux équipé d’un laser de 488 nanomètres, en fixant une porte stricte pour les maites à base de bromure d’atérium et de porte de fluorescence double GFP les billes dans un canal séparé et acquérez les événements jusqu’à ce que 2000 billes aient été collectées.

Pour quantifier le nombre de maïtes à chaque dilution, faites la moyenne des trois mesures de concentration de maïte. Ensuite, suspendez les maïtes à huit fois 10 à six maïtes par millilitre dans un milieu THP pour assurer un rapport final de quatre maïtes par THP une cellule pour mesurer la phagocytose des maites. D’abord, une pastille suffisamment de cellules THP pour le test et les suspend à 6,7 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans un milieu THP.

Ensuite, à 150 microlitres de THP, une cellule par puits en triple exemplaire pour chaque condition à tester, à une plaque inférieure de 96 puits bloqués par FCS jusqu’à une concentration finale de 10 à la cinquième cellule par puits. Placez l’assiette dans l’incubateur jusqu’à ce qu’il soit temps d’ajouter les mates. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de maites isolés à huit fois 10 à la sixième millilitre de concentration par puits dans une plaque inférieure séparée de 96 puits bloqués par FCS à un puits par condition à tester.

Ajouter 10 microlitres d’échantillons de plasma dilué préparés dans chaque puits des maites en mélangeant soigneusement pour assurer une solution homogène. Ajoutez ensuite 50 microlitres de la solution de plasma maïte dans chaque puits du THP, une plaque en trois exemplaires pour chaque échantillon de plasma testé. Mélangez bien les échantillons, puis incubez les co-cultures couvertes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Après 40 minutes, faites tourner les échantillons dans une centrifugeuse pré-refroidie pour arrêter la phagocytose. Ensuite, lavez les cellules deux fois dans un tampon de télécopie glacé après le deuxième lavage. Fixez les cellules dans 90 microlitres de fixateur de fax et laissez-les sur de la glace.

Protégé de la lumière jusqu’à l’acquisition. Le stade de maturation des parasites avant le traitement au E 64 est critique pour générer des maites enfermées dans une membrane. Les parasites doivent être gros, remplir presque les globules rouges et montrer des taches de pierres précieuses tachetées.

L’ajout de E 64 à ce stade donnera des maïtes fermées dans une membrane après une incubation de six à 10 heures. Si E 64 est ajouté plus tôt au stade trophozoïtes, les parasites membranaires ne seront pas générés. Si E 64 est ajouté plus tard à schon schon, la rupture n’est pas inhibée.

Un haut niveau de synchronie parasitaire est requis. Sinon, une gamme des trois résultats décrits sera observée après que la mesure de la phagocytose du traitement E 64 par fluorescence du bromure d’aum permet une résolution supérieure de la phagocytose du parasite par rapport à la fluorescence GFP seule. L’augmentation du rapport entre les maïtes et les cellules TP se traduit par une augmentation de l’adhérence des maïtes aux cellules THP 1.

En l’absence d’anticorps spécifiques à Maite, l’augmentation du rapport entre MEITE et THP sur une cellule entraîne également une augmentation de la phagocytose entre zéro et 78 %. Ces données montrent des exemples des quatre quartiles de réponses acides des PVVIH chez quatre individus représentatifs de Papouasie-Nouvelle-Guinée. Il a été démontré que les anticorps opsonisants mesurés à l’aide de ce test s’associent à l’immunité clinique contre le paludisme lors de cette procédure.

Les points clés à retenir pour assurer le succès de la cytose PE sont d’avoir des parasites hautement synchronisés pour obtenir une méite complètement mature et intacte, et de maintenir les cultures de cellules de t HB de manière appropriée. La technique de purification de méite décrite dans cette procédure peut être adaptée à toute application nécessitant des matrices de paludisme de haute qualité, telles que la marizone, l’invasion, les dosages, la protéomique ou la sérologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la méthode E 64 pour purifier les maïtes et pour étudier les anticorps opsonisants en mesurant la phagocytose par les cellules THP one.