Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l'expression des Plasmodium rhoptries Protéines

L’objectif global de l’expérience suivante est de traduire les protéines du plasmodium à l’aide de systèmes d’expression acellulaire basés sur hela et de purifier les protéines à partir de micro-volumes de produit traduit. Ceci est réalisé en clonant des gènes de plasmodium pour préparer des plasmides recombinants pour une traduction in vitro en deux étapes et une étape, l’expression acellulaire des protéines recombinantes de l’arbre RT du paludisme. Pour traduire les protéines recombinantes, le plasmide préparé est incubé avec un mélange de transcription.

Lors de l’utilisation du système d’expression en deux étapes, qui transcrit l’ARNm, l’ARNm résultant est ensuite ajouté au mélange de traduction pour la traduction des protéines. Lors de l’utilisation du système d’expression en une étape, le plasmide recombinant est incubé avec du lysat de cellule hela pour la transcription et la traduction des protéines recombinantes. Les protéines recombinantes sont ensuite purifiées à partir de microvolumes de produit de traduction.

Les résultats montrent une expression et une purification réussies basées sur l’analyse par western blot. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres, telles que le système d’expression du germe de blé et le système de lysat de réticulocyte de lapin, est que ce système peut exprimer des protéines en trois heures. Aucune optimisation du codage n’est requise.

Il est abordable et facile à utiliser. Plusieurs antigènes peuvent être criblés sur des microréseaux, ce qui permet de détecter des antigènes à des fins de traitement et de diagnostic. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il s’agit d’une expression acellulaire, qui exprime des protéines en microvolumes, ce qui rend la purification des protéines extrêmement difficile.

Nous avons d’abord eu l’idée d’utiliser ce système car nous ne pouvions pas exploser les protéines d’expression en utilisant e coli et nous trouvions les autres systèmes d’expression trop coûteux et chronophages. Nous avons décidé d’explorer le système d’expression acellulaire basé sur hela comme système alternatif. Préparez 20 microlitres de mélange de transcription contenant de l’ADN de vecteur plasmidique recombinant comme décrit dans le protocole textuel pour l’expression de protéines humaines in vitro en deux étapes.

À l’aide de modèles d’ADN. Mélangez les composants dans un micro-tube à centrifuger et incubez pendant 75 minutes à 30 degrés Celsius dans un bain-marie. Ensuite, prenez deux microlitres du mélange de transcription et ajoutez-les à 23 microlitres de mélange de traduction contenant du lysat de cellules Hela.

Incuber le mélange obtenu à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Stockez les produits traduits à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparez 25 microlitres du mélange de transcription et de traduction contenant le vecteur plasmidique recombinant, l’ADN et un lysat comme décrit dans le protocole de texte pour une étape d’expression de protéine de traduction in vitro humaine couplée pour les matrices d’ADN.

Incuber ce mélange réactionnel pendant 90 minutes à six heures à 30 degrés Celsius et stocker les produits de traduction à moins 20 degrés Celsius. Pour purifier les protéines recombinantes exprimées, ajoutez 75 microlitres d’un tampon de purification X à 25 microlitres de produit de traduction pour obtenir 100 microlitres de mélange de purification. Lavez la résine de nickel deux fois en ajoutant 300 microlitres d’eau distillée et 300 microlitres de tampon de liaison.

Remettez la résine en suspension et centrifugez à 14 000 G pendant une minute pour éliminer l’excès d’éthanol. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution de purification préparée à 100 microlitres de résine chélatrice au nickel et incubez le mélange à la fin. Terminez le shaker pendant 60 minutes à température ambiante.

Centrifugez le mélange à 14 000 G pendant une minute et recueillez le supernat dans un tube frais étiqueté comme étant en flux continu. Lavez la résine avec 100 microlitres d’un tampon de lavage, puis centrifugez-la à 14 000 GS pendant une minute et récupérez le super nommé dans un tube frais étiqueté wash. Répétez cette étape deux fois après le lavage.

Ajoutez 100 microlitres d’un tampon d’élution à la résine et incubez sur un agitateur d’extrémité pendant 15 minutes. Puis centrifuger à 14 000 Gs pendant une minute. Effectuez l’étape Ellucian deux fois à chaque fois.

Recueillir le surnageant dans un microtube à centrifuger frais et étiqueter comme éluat après ellucian. Lavez la résine deux fois comme avant, puis stockez-la à quatre degrés Celsius. Entreposez les lavages et les échantillons d’élution à moins 20 degrés Celsius ou moins pour effectuer le transfert occidental.

Tout d’abord, préparer des tubes séparés d’extraits de schon de P falsy parum e coli, exprimés de protéines recombinantes R, les protéines recombinantes préparées et les produits protéiques purifiés par affinité. Ensuite, ajoutez un tampon d’échantillon d’électrophorèse contenant du mercaptoéthanol dans chaque tube pour un volume final de 20 microlitres. Pour faire des échantillons de protéines solubilisées, faites bouillir les tubes pendant deux minutes.

Chargez les échantillons de protéines solubilisées sur des gels de page SDS à 10 % pour séparer les protéines après avoir analysé les gels. Transférez les protéines séparées des gels de la page SDS sur du papier nitrocellulosique par électrophorèse à 35 milliampères de courant par gel dans une chambre de transfert western semi-sèche pendant deux heures après le transfert et le blocage du papier nitrocellulosique avec 2 % de lait écrémé. Incuber le papier de nitrocellulose avec les anticorps polyclonaux énumérés dans le protocole textuel pour les contrôles négatifs.

Incubez également du papier de nitrocellulose dans un à 100 sérum de souris et de lapin normal dilué et une culture épuisée super nommée à partir de deux cellules myélomateuses SB. Après l’incubation du papier nitrocellulosique à quatre degrés Celsius, lavé quatre fois pendant la nuit avec un tampon de transfert et incubé avec des anticorps secondaires spécifiques à l’espèce, conjugué à la peroxydase de raifort, dilué un à 1000 dans du lait à 2 %. Ensuite, lavez à nouveau le papier nitrocellulosique quatre fois avec un tampon éponge.

Enfin, incubez le papier nitrocellulosique lavé avec une solution de développement de couleur, A plus B pendant 30 minutes dans l’obscurité, l’expression réussie des protéines plasmodium à l’aide de systèmes d’expression acellulaire humaine in vitro a été confirmée par l’antier de lapin spécifique de l’arbre RT, comme montré que les protéines recombinantes précédemment exprimées n’ont pas été reconnues par les antisérums contre les protéines vae de parasitose de p FALs parem et P Yoi Lee, Démonstration de la spécificité des antisérums de lapin 6 76 contre les protéines exprimées. Le sérum de lapin normal n’a pas réagi avec les protéines recombinantes. Traduit à l’aide du système d’expression acellulaire humaine en deux étapes et du système de traduction in vitro couplé en une étape.

La purification réussie de protéines traduites à partir de 25 microlitres de produits protéiques traduits est illustrée ici. Plus précisément, la purification réussie de la protéine transmembranaire de la fente de mara est démontrée. La purification réussie d’une protéine hypothétique à partir de la protéine de l’arbre RT du plasmodium codant pour des gènes est également démontrée.

Enfin, la purification réussie de répétitions d’armadillo contenant la protéine d’arbre plasmodium RT est démontrée. Le rendement en protéines après purification est de 3,5 microgrammes pour 25 microlitres après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la parasitologie pour la caractérisation des protéines chez les parasites, les interactions protéine-protéine, les études inhibitrices d’anticorps et le développement de vaccins dans le domaine de la parasitologie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment utiliser le système d’expression cellulaire sans cellule du guérisseur pour exprimer les protéines du plasmodium en trois heures. Vous aurez également une compréhension de la façon de purifier les protéines à partir de micro-volumes de produit traduit.