Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l'occupation des Plasmodium falciparum

L’objectif général de cette procédure est d’étudier le rôle des microARN érythrocytaires dans la régulation génique post-transcriptionnelle des transcrits de plasmodium falciparum. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du paludisme, telles que la façon dont les événements d’épissage de l’ARN avec de petits ARN de l’hôte ou du parasite peuvent affecter le potentiel de traduction des ARNm de fusion. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de capturer des ARN totaux et petits ensemble dans un seul pool, démontrant la présence de petits ARN et d’ARN de fusion dans une cellule.

De plus, cette procédure utilise le profilage des polysomes pour montrer comment ces petits ARN affectent la traduction de leurs produits d’ARNm de fusion. Pour commencer, mettez en place la transfection par centif 300 microlitres de globules rouges dans un milieu de paludisme complet à 800 fois G pendant cinq minutes. Lavez les érythrocytes deux fois avec un milieu RPMI, remettez en suspension les cellules dans un mélange complet de cyto à 50 % d’hématocrite.

Ensuite, transférez les cellules dans un vétérinaire d’électroporation et ajoutez 10 microgrammes de micro ARN conjugué à la biotine DYS ou d’un micro ARN de contrôle négatif non conjugué. Pour électroporer les cellules, placez le vete dans un électroporat et délivrez une seule impulsion. Ensuite, mettez les cellules en plaques et infectez-les avec du plasmodium falciparum après quatre heures, comme décrit dans le protocole textuel.

Ajoutez ensuite 50 microlitres d’avid et de billes emballées et dépouillées à 10 microgrammes d’ARN parasite dans un tube microcentrique, et incubez le tube en rotation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifugez la bande de davan et les billes à 800 fois G pendant 30 secondes, puis lavez la pastille avec 500 microlitres de tampon RNP contenant une dilution de un à 1000 d’inhibiteur d’ARN. Ensuite, l’ARN des billes de Resus, en les suspendant dans 200 microlitres d’ARN.

Capturer le tampon d’élution contenant l’excès de biotine. Incuber les billes pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec rotation. Ensuite, centrifugez les billes à 800 fois G pendant 30 secondes et collectez l’ARN surnageant.

Il est essentiel d’éluer avec un excès de biotine et d’utiliser la quantité minimale de streptocoque avide et de billes pour assurer une élution spécifique correcte. Cela réduit l’enrichissement en ARN de fond. Enfin, déterminez le degré d’enrichissement des transcrits de P falciparum et l’enrichissement des microARN par R-T-P-C-R quantitatif, comme décrit dans le protocole de texte pour commencer la séparation des polysomes.

Placez d’abord cinq millilitres d’une solution à 50 % de saccharose dans un tube d’ultracentrifugation. Ensuite, superposez soigneusement cinq millilitres d’une solution de saccharose à 15 % sur la solution à 50 %. Ensuite, scellez le tube dégradé avec du perfil et inclinez soigneusement le tube jusqu’à ce qu’il repose horizontalement sur la paillasse.

Assurez-vous que le tube est dans une position stable pour éviter qu’il ne roule. Maintenez le tube dans cette position pendant au moins deux heures pour permettre au gradient de se former. Entre-temps, prélever environ 100 millilitres d’une culture asynchrone de sang infecté par le plasmodium à une dose de trois à 5 %.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu de culture contenant deux millimolaires de cyclo, heide, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant sept minutes, puis lavez-les deux fois avec 80 millilitres de PBS contenant 200 micromolaires de cyclo heide resus. Suspendez la pastille dans du PBS avec du cycloheximide et placez-la sur de la glace.

Granulez les cellules et retirez le surnageant pour estimer le volume de granulés. Ensuite, lyce les cellules dans un volume final de 4,25 millilitres de lyse, tamponnent et incubent pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation. Les tentatives précédentes de profilage des polysomes et les espèces responsables du paludisme ont révélé principalement des monos, car la lyse ponente conduit à la décomposition des polysomes en zones mono.

Ici, nous utilisons un tampon de lyse qui lyse simultanément l’érythrocyte et les parasites pour préserver le motif polysomique de Plasmodium falciparum, transférons le lysat dans des micro-tubes à centrifuger, puis tournons à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans un tube d’ultracentrifugation de cinq millilitres pré-refroidi séparé, ajoutez 1,25 millilitre de solution de coussin de saccharose froid de 0,5 molaire à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 27. Superposez soigneusement 3,75 millilitres de surnageant de lysat au-dessus du coussin de saccharose.

Centrifugez l’échantillon à 366 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 146 minutes. Pendant ce temps, remettez lentement le tube d’ultracentrifugation tué de saccharose en position verticale et laissez-le reposer sur de la glace pendant au moins 15 minutes. Après avoir retiré le lysat de l’ultracentrifugeuse, prélevez soigneusement le surnageant dans un deux coniques de 15 millilitres.

Stockez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pour préserver la fraction d’ARN non liée par les ribosomes. Ensuite, remettre en suspension la pastille de ribosome dans 500 microlitres de suspension Resus, tamponner par pipetage pendant cinq minutes pour mélanger, centrifuger l’échantillon à 16 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour éliminer les matériaux insolubles, retirez soigneusement le joint de param sur le tube de gradient pour éviter de perturber le gradient, puis superposez la suspension ribosomique sur le dessus avec une seringue et une aiguille de calibre 27.

Après avoir centrifugé le tube à 200 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 180 minutes, stockez les gradients à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être chargés sur le fractionneur. Placez un tube d’ultracentrifugation vide dans le fractionneur à gradient et lavez le système avec de l’eau sans ARN pendant cinq minutes. Pendant le lavage, réglez la sensibilité du détecteur d’absorbance UV à 254 nanomètres sur 0,2.

Bien que cela puisse devoir être ajusté en fonction du signal. Ensuite, réglez le signal de base à zéro lorsque l’eau s’écoule à travers le détecteur. Après avoir lavé le collecteur, inversez le flux de fluide à travers le fractionneur pour vider les conduites, puis retirez le tube d’ultracentrifugation vide.

Faites passer une solution de saccharose à 60 % dans le FRACTIONNEUR jusqu’à ce qu’elle sorte de l’appareil à aiguille. Placez ensuite le tube incliné chargé en haut de la chambre de chargement et serrez le joint. Percez le bas du tube avec l’aiguille.

Ensuite, réinitialisez la vitesse d’écoulement du fractionneur à 12,5 par 10 et collectez les fractions de 18 secondes dans des tubes de micro-centrifugeuse. Commencer l’écoulement direct de la solution à 60 % de saccharose pour éluer les fractions avant que la première goutte de la solution à gradient n’entre dans un microtube de centrifugation. Commencer à la fois la collecte et l’enregistrement en direct de l’absorbance à 254 nanomètres de signal.

Lorsque le signal absorbant chute brusquement à l’interface de la solution de saccharose à 50 % et 60 %, arrêtez l’écoulement et l’enregistrement. Stockez les fractions de gradient à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, inversez le flux de fluide jusqu’à ce que la solution à 60 % se vide du tube de l’ultracentrifugeuse.

Retirez le tube et commencez l’analyse de la pente suivante. La transfection de globules rouges avec des microARN 4, 5, 1, suivie de la récupération des hybrides d’ARNm micro NA biotinylés, a révélé un enrichissement des transcrits de fusion PKAR. La transfection de micro-ARN simulée ou non apparentée n’a pas enrichi le transcrit PKAR.

Les données montrent les pics eluciens des sous-unités ribosomiques 40 s et 60 s, du ribosome a SD et des fractions polysomiques contenant le nombre indiqué de ribosomes. Les ribosomes étaient associés aux transcrits isolés de l’ICP résidant à l’intérieur des globules rouges. L’analyse sanguine de Northern a démontré que les ribosomes et le polysome étaient associés au 18 S et au 28 SRNA.

Parallèlement à cette procédure, d’autres méthodes telles que la digestion de la Rannase H, les tests de protection contre les ribonucléases et le transfert du nord peuvent être effectuées afin de valider davantage la présence de microARN MR. Fusions NA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des microARN dans des érythrocytes et de capturer ensuite de petits ARN avec de l’ARN total, y compris des transcrits chimériques. Vous devriez également être en mesure de récupérer des polysomes pour déterminer l’occupation ribosomique et donc le potentiel de traduction de ces transcrits de fusion.