Expression de recombinant cellulase Cel5A de Trichoderma reesei Dans les usines de tabac

L’objectif global de l’expérience suivante est d’exprimer transitoirement des protéines cibles dans le tabac afin de se faire une idée de la faisabilité de l’expression d’enzymes d’origine végétale dans un court laps de temps. Cette expression transitoire est obtenue en infiltrant les feuilles de tabac avec une souche d’agrobacterium tumor fain, qui contient un vecteur incorporant le gène d’intérêt comme deuxième étape Après l’incubation, les feuilles de plantes infiltrées sont récoltées et les extraits de protéines sont partiellement purifiés pour obtenir une solution enzymatique fonctionnelle. Ensuite, une analyse protéique est effectuée afin d’évaluer les effets de l’expression végétale sur l’enzyme et de vérifier son activité enzymatique.

On obtient des résultats qui montrent la taille des protéines, les effets possibles de la glycosylation et l’activité enzymatique sur la base des tests de Western blot, de zy et de dégradation du substrat. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la conversion de la biomasse végétale et peut également fournir un aperçu de l’activité des enzymes après avoir été exprimées transitoirement dans le tabac. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’infiltration sont difficiles à apprendre en raison des feuilles facilement endommagées par les vêtements de seringue et je vais effectuer les expériences dans des conditions stériles.

Transvaser les colonies individuelles d’agrobacterium toan dans un erlenmeyer contenant 10 millilitres. Bouillon d’extrait de levure avec antibiotiques. Ensuite, incubez le bouillon inoculé pendant 36 à 40 heures à 26 degrés Celsius avec 180 tr/min, en secouant ensuite, inoculez 200 microlitres de chaque culture dans 20 millilitres de bouillon d’extrait de levure avec les mêmes antibiotiques qu’auparavant et incubez dans les mêmes conditions après 36 à 40 heures.

Induisez les cultures avec deux microlitres d’acétophénone, 100 microlitres de solution de glucose à 40 % et 200 microlitres d’un tampon MES molaire à pH 5,6 et continuez à incuber pendant la nuit. Maintenant, sortez les plantes de la serre et utilisez une pointe de pipette pour entailler le côté axial AB de la troisième à la cinquième feuille à partir du haut de la plante pour faciliter l’infiltration. Remplissez ensuite une seringue de milieu d’infiltration et placez-la sur l’une des entailles précédemment faites.

Placez la seringue avec un doigt sur le côté de l’aisselle de la feuille et injectez le milieu avec précaution dans la zone de la feuille intraveineuse. Pour visualiser la fluorescence dans les sections de feuilles exprimant la cellule TR 5h00, les cerisiers brillent les plantes avec une source lumineuse portable émettant de la lumière verte. Lorsqu’elle est vue à travers un filtre rouge, la fluorescence de la cellule TR 5:00 AM cherry sera clairement visible.

Pour extraire les protéines exprimées, sélectionnez des feuilles de tabac qui ont été infiltrées avec des AUM contenant P track ERTR cell five A et coupez-les en morceaux d’un gramme. Ensuite, placez-les dans un mortier de pré-refroidissement et ajoutez une quantité appropriée d’azote liquide aux échantillons. Broyez les feuilles en poudre à l’aide d’un pilon.

Répétez le processus avec des feuilles de tabac non infiltrées pour obtenir des échantillons de contrôle. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS contenant un millimolaire de fluorure de phénylméthylsuène à la matière foliaire moulue et mélangez jusqu’à ce que la majorité de la matière foliaire soit en suspension. Centrifugez l’extrait à 15 000 GS pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez la pastille, partiellement purifiée TR cellule cinq A en incubant la protéine contenant du S natin à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes et laissez-la reposer à température ambiante pendant encore 10 minutes. Ensuite, centrifugez un SNAT à 15 000 GS pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez la pastille et utilisez la protéine contenant du snat pour tous.

Autres dosages. Effectuez également le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées afin d’obtenir des échantillons de contrôle. Dans cette procédure, mélangez de l’éthylcellulose et de l’eau pour obtenir une solution à 1,5 % et incubez en remuant jusqu’à ce qu’elle soit dissoute.

Pour faire du gel de page A-C-M-C-C-S-D-S substituez un millilitre de CMC à un millilitre d’eau dans une solution de mélange de gel de page SDS de 10 millilitres et versez le gel normalement ensuite, dénaturez les échantillons en les faisant bouillir en présence de SDS. Effectuez l’électrophorèse à 200 volts pendant 50 minutes jusqu’à ce que le front du colorant atteigne le fond du gel. Effectuez maintenant en gel le repliement des protéines sur le point 15 % C-M-C-S-D-S page gel.

Utilisation de 1,5 % de bêta-cyclodextrine dans un tampon de citrate de phosphate de 20 millimolaires à pH 6,5. Incuber le gel dans cette solution à température ambiante en secouant doucement pendant 15 minutes. Jetez la solution de bêta-cyclodextrine et lavez brièvement le gel avec de l’eau incubée à température ambiante dans un tampon d’acétate de sodium de 50 millimolaires à pH 4,8 pendant encore 15 minutes.

Effectuez ensuite CMC zy à l’aide du point replié 15 % C-M-C-S-D-S en incubant le gel dans un tampon d’acétate de sodium de 30 millimolaires pendant 20 minutes à 50 degrés Celsius. Pour visualiser où la CMC s’est dégradée, colorez le gel pendant 10 minutes à l’aide d’une solution rouge du Congo à 0,1 % et maintenez-le à l’aide d’une molaire de chlorure de sodium pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que des bandes transparentes soient observées à la fin, lavez le gel avec de l’acide acétique à 0,3 %. Pour une imagerie plus claire immédiatement avant d’effectuer le test, préparez une pipette de quatre MUC deux X de solution de travail de 100 microlitres de quatre MUC dans des puits séparés d’une plaque de 96 puits.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés, en analysant chaque échantillon en trois exemplaires en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 360 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 465 nanomètres. Déterminez le point temporel de la minute zéro de quatre mu fluorescence par spectroscopie fluorescente. Ensuite, incubez les plaques recouvertes de couvercles adhésifs à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Par la suite, arrêtez la réaction en congelant. Après cela, mesurez la fluorescence mu du point final en utilisant les mêmes paramètres que pour le point de temps de zéro minute. Soustrayez la valeur de fluorescence à zéro minute de la valeur de fluorescence à 20 minutes pour déterminer le changement de fluorescence causé par l’activité enzymatique immédiatement avant d’exécuter le test.

Préparez la solution de travail A-O-C-M-C two X. Combinez ensuite 50 microlitres de l’échantillon et 50 microlitres de la solution de travail dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez les échantillons pendant 20 minutes à 50 degrés Celsius.

Arrêtez la réaction en ajoutant 250 microlitres de solution de précipitation. Par la suite, agitez vigoureusement chaque échantillon pendant 10 secondes pour assurer un mélange complet de l’échantillon avec la solution de précipitation. Incuber ensuite les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes et les agiter à nouveau avant de les centrifuger à 1000 Gs pendant 10 minutes.

Après cela, transférez 200 microlitres de SNAT de chaque échantillon sur une plaque de 96 puits sans déranger. L’activité enzymatique des pastilles est démontrée par des niveaux plus élevés de colorant solubilisé. Mesurez cela à l’aide de la spectroscopie absorbante à une longueur d’onde de 590 nanomètres.

Dans cette étape. Placez des cercles de papier filtre dans des tubes de 1,5 ou deux millilitres. Ajoutez 100 microlitres d’acétate de sodium de 60 millimolaires et 100 microlitres d’échantillons dans les cercles de papier filtre et incubez pendant 20 heures à 50 degrés Celsius en secouant à 300 tr/min.

De plus, incuber les échantillons individuels sans papier filtre comme témoin immédiatement avant d’effectuer le test. Préparez une solution de travail 1,5 x PABA contenant un millilitre de solution PBA A et neuf millilitres de solution PABA B.Store sur de la glace jusqu’à utilisation. Ensuite, préparez les échantillons dans des tubes thermostables de 0,5 millilitre.

Les échantillons sont composés de 45 microlitres d’eau, cinq microlitres de chaque solution incubée avec du papier filtre et 100 microlitres de solution de travail PABA. Après cela, exécutez les exemples de contrôles et les cinq étalons préparés de la même manière. Ensuite, incubez les échantillons, les commandes et les étalons pendant exactement 10 minutes à 100 degrés Celsius et laissez refroidir à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires.

Pipeter 100 microlitres de la solution dans une plaque de 96 puits pour un test avec un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 410 nanomètres. Soustrayez les valeurs de contrôle de chaque échantillon des valeurs de l’échantillon de papier filtre pour déterminer la quantité de sucres réducteurs libérée. Voici une image montrant les cassettes d’expression ainsi que l’expression des protéines dans les plants de tabac.

C’est ainsi qu’une feuille de tabac infiltrée apparaît sous une lumière normale et sous une lumière verte avec un filtre rouge où l’expression de la cerise de la cellule TR 5:00 AM indiquée par la couleur rouge est clairement visible ici. La page SDS gel western lot et CMC zy qui montrent la taille et l’activité de la cellule T cinq A.Les protéines solubles totales ont été séparées et nous pouvons les visualiser avec une coloration au bleu kumasi, un Western blot contre la région de l’étiquette hist de la cellule T cinq A confirme la taille de la protéine et en outre, l’activité de la cellulase contre la CMC est démontrée par une xénogreffe colorée au rouge Congo. Ce que l’on peut voir ici, ce sont les protéines solubles totales des feuilles de tabac où la cellule TR cinq A a été exprimée transitoirement avant et après la purification par précipitation thermique où la cellule TR cinq A est la plus grande bande visible et est également visible dans le lot ouest et l’igraphe CMCs.

Nous voyons également les protéines solubles totales des plants de tabac où la cellule cinq A n’était pas également après précipitation thermique et les protéines d’un mélange de tresa cellulase disponible dans le commerce. Cette figure montre la quantification de l’activité enzymatique de la cellule TR cinq A La cellule TR cinq A a été incubée avec quatre MUC Azo CMC ou du papier filtre, et la dégradation du substrat a été mesurée par la libération du fluoro quatre quatre mu le colorant azoïque, ou en quantifiant les sucres réducteurs du changement de couleur du PBA suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme le ciblage des protéines, peuvent être utilisées pour fournir des informations supplémentaires sur la façon dont la localisation des protéines peut affecter la stabilité et l’activité de l’enzyme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une compréhension claire de la façon d’exprimer transitoirement les protéines dans le tabac ainsi que de bonnes connaissances sur la façon d’évaluer l’activité enzymatique. Conversion de la biomasse de cellulose Foro.