Name: Expression de recombinant cellulase Cel5A de Trichoderma reesei Dans les usines de tabac (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Découvrez l'expression transitoire de cellulase TrCel5A dans des plantes de tabac pour la biotechnologie végétale. Cette méthode permet de produire rapidement des enzymes fongiques et d'évaluer leur activité enzymatique in vivo.

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Ce travail a été soutenu par le BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; et le pôle d&#39;excellence &quot;carburants sur mesure à partir de la biomasse&quot;, qui est financé par l&#39;Initiative d&#39;excellence par les gouvernements fédéral et de l&#39;Etat allemand pour promouvoir la science et de la recherche dans les universités allemandes.

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes <ol><li> Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d&#39;humidité relative de l&#39;air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle lumière / obscurité (par exemple Philips IP65 400 lampes de W; 180 pmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) et de l&#39;eau tous les jours. </li></ol> 2. Expression transitoire de TrCel5A et TrCel5A-mCherry protéines <ol><li> Dans des conditions stériles, prélever des colonies simples d&#39;Agrobacterium Agarobacterium (de GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) contenant soit pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry et transfert dans un erlenmeyer contenant 10 ml d&#39;extrait de levurebouillon (YEB, préparé selon les spécifications du fabricant) à moyen et à la kanamycine (50 mg / ml), de rifampicine (50 mg / ml) et de la carbénicilline (100 mg / ml) pour la sélection. Incuber pendant 36-40 heures à 26 ° C et 180 rpm. Remarque: La conception de constructions appropriées pour l&#39;expression de la protéine est en dehors du champ d&#39;application de cet article, mais à titre indicatif, les méthodes de Maclean et al 13 et Munro et Pellham 14 peut être suivie pour la conception de construction.. </li><li> Prendre 200 pi de chaque culture pour inoculer 20 ml de YEB avec les concentrations en antibiotiques mentionnés ci-dessus et incuber dans les mêmes conditions que précédemment. </li><li> Après 36 à 40 h, les cultures preinduce en ajoutant 2 ul acetosyringon (200 pM concentration finale), 100 ul de 40% (p / v) de solution de glucose et de 200 pi de tampon de 1 M de MES pH 5,6. Incuber pendant la nuit. </li><li> Préparer 100 ml d&#39;un tampon d&#39;infiltration 2x (sels basaux 100 g / L de saccharose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige et Skoog, Ajuster le pH à 5,6 avec de l&#39;hydroxyde de potassium). </li><li> Mesurer la DO 600 des cultures avec des dilutions 1:05 jusqu&#39;à atteindre une DO 600 de 5-6. Calculer le volume de culture nécessaire pour 30 ml de milieu d&#39;infiltration à DO 600. Ajouter 15 ml de tampon d&#39;infiltration 2x, puis ajouter H 2 O déminéralisée pour rendre le tampon jusqu&#39;à 30 ml. </li><li> Prendre des plantes de serre et utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxial de la 3 e à 5 e feuille du haut pour faciliter l&#39;infiltration. </li><li> Utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxiale des feuilles pour faciliter l&#39;infiltration. </li><li> Remplir une seringue avec du milieu de l&#39;infiltration et de le mettre (sans aiguille) sur l&#39;une des entailles faites précédemment. Supporte seringue avec un doigt sur le côté ventral de la feuille. Appuyez sur le support avec soin dans le tissu des zones de la feuille interveinales. Note: Après infiltration, de cultiver les plantes dans une serre, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. En outre, maintenir une proportion égale de untreated, plantes non-expression transitoire (NTEPs) que les contrôles, dans les mêmes conditions que les plantes infiltrés. </li></ol> 3. Évaluation de TrCel5A-mCherry expression dans les feuilles des plantes <ol><li> Après 4-6 jours, prendre des plantes infiltrées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry de l&#39;effet de serre et les placer dans une pièce sombre pour l&#39;analyse de fluorescence. </li><li> Pour visualiser la fluorescence dans des sections de feuilles exprimant TrCel5A-mCherry, plantes d&#39;éclairage utilisant une source de lumière portable émettant de la lumière verte à 515 nm avec un filtre rouge (620-750 nm). Remarque: Dans une caractérisation approfondie de l&#39;expression des protéines dans les feuilles des plantes peut être réalisé en feuilles minces sectionnement avec un vibratome et examen à la lumière et microscopie de fluorescence. Pour cette suivez les étapes ci-dessous: <ol><li> Couper de petites sections d&#39;environ 5 x 5 mm de taille d&#39;une feuille infiltré et les incorporer dans 4% d&#39;agarose dissous dans 50 mM de tampon phosphate (pH 5,7). </li><li> Cutsection de 80 à 90 um de taille à partir de feuilles en utilisant un vibratome embarqués. Placez-les sur une lame de microscope, couvrir avec un tampon ou une lamelle et examiner les en utilisant un microscope à un grossissement de 10X avec un détecteur de fluorescence, en utilisant la même longueur d&#39;onde et de filtrage ci-dessus. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A extraction à partir de feuilles de tabac <ol><li> Couper des morceaux de feuilles de tabac pour un poids approximatif de 1 g de plantes infectées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A et placer dans un mortier préalablement refroidi à l&#39;azote liquide. Ajouter une quantité appropriée de l&#39;azote liquide pour les échantillons. Grind laisse à poudre à l&#39;aide d&#39;un pilon préalablement refroidi. </li><li> Ajouter 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM à la matière de la feuille de sol et mélanger jusqu&#39;à ce que la majorité de la matière de la feuille se trouve en suspension. Extrait du Centrifuger à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et à prendre surnageant contenant des protéines. </li><li> Centrifuge l&#39;extrait à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et de prendre surnageant contenant des protéines en faisant attention de ne pas perturber le culot. Éliminer le culot. </li><li> Purifier partiellement TrCel5A par incubation du surnageant contenant des protéines à 55 ° C pendant 10 min. Laisser reposer à température ambiante pendant encore 10 min, puis centrifuger à 15 000 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées d&#39;obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li><li> Répéter le procédé de purification partielle pour les plantes non infiltrées d&#39;obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> 5. SDS-PAGE, transfert de Western, et Azo-CMC Zymographie de TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Achat ou préparer 12% (p / v) des gels de SDS-PAGE que par des méthodes établies 15. </li><li> Dissoudre la CMC dans l&#39;eau pour obtenir un (m / v) solution à 1,5%. Pour faire des gels de CMC-SDS-PAGE, substituer 1 ml de 1,5% de CMC à 1 ml d&#39;eau dans une solution de 10 ml de gel de SDS-PAGE mélange, résultant en un 0,1% (p / v) de CMC + 12% (p / v ) gel SDS-PAGE mélange. Verser gel normalement. Remarque: S&#39;assurer que la CMC dans la solution initiale est complètement dissous par une combinaison d&#39;agitation et chauffage à 40 ° C (répéter directement avant la préparation de la solution de gel). </li><li> Dénaturer les échantillons par ébullition en présence de SDS, selon des méthodes établies 12. Comme témoin positif, en utilisant une dilution 1:500 d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei, tel que T. reesei ATCC 26921. Comme témoin négatif utiliser une solution de protéines de même préparé à partir de feuilles non infiltrées (NTEPs). </li><li> Effectuer le électrophorèse selon les protocoles normaux 15,par exemple, l&#39;utilisation de 200 V pendant environ 50 min avec la électrophorèse interrompu une fois que le front de colorant atteint le bas du gel. </li><li> Une tache gel de SDS-PAGE en utilisant 0,1% (p / v) de bleu brillant de Coomassie et destain en utilisant un mélange méthanol / acide acétique glacial. Remarque: coloration rapide et décoloration peuvent être effectuées en chauffant légèrement la coloration et décoloration des solutions, c&#39;est à dire en utilisant un micro-ondes pendant environ 15 secondes pour se réchauffer (mais pas bouillir) d&#39;abord la coloration et les solutions de décoloration, de changer la solution de décoloration après 10 min , ou lorsqu&#39;il est refroidi, et répéter avec la nouvelle solution de décoloration. </li><li> Effectuer un Western blot d&#39;une gel SDS-PAGE en utilisant des protocoles établis 16,17. Utiliser les anticorps suivants: un anticorps polyclonal de lapin contre un anticorps anti-lapin de région Fc His-tag (primaire) et une chèvre polyclonal qui a été conjugué à une phosphatase alcaline (secondaire). Remarque: Anticorps secondaires doivent être choisis pour permettre la visualisation en utilisant nitrobleu tétrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-indolyphosphate sel de p-toluidine (NBT / BCIP), comme décrit 18. </li><li> Effectuer protéine dans le gel de repliement sur le 0,15% (p / v) de gel de CMC SDS-PAGE par incubation du gel dans 1,5% (p / v) β-cyclodextrine, le phosphate-citrate buffer 20 mM, pH 6,5, à température ambiante, avec agitation douce pendant 15 min 19. </li><li> Jeter la solution de β-cyclodextrine et laver rapidement le gel avec H 2 O. Incuber à température ambiante dans 50 mM de tampon d&#39;acétate de sodium (pH 4,8) pendant encore 15 min. Effectuer zymographie en utilisant la CMC à 0,15% CMC gel SDS-PAGE repliée en faisant incuber le gel dans 30 mM de tampon acétate de sodium pH 4,8 pendant 20 min à 50 ° C. </li><li> Effectuer zymographie en utilisant la CMC repliée 0,15% (p / v) de CMC gel SDS-PAGE, le gel par incubation dans 30 mM de tampon acétate de sodium (pH 4,8) pendant 20 min à 50 ° C. </li><li> Colorer le gel pendant 10 min en utilisant un 0,1% p / v de solution de rouge Congo et destain pendant 30 min ou jusqu&#39;à ce que les bandes claires sont observées en utilisant 1 M de NaCl. Laver le gel avec 0,3% (v / v) d&#39;acide acétique pour une imagerie plus claire. </li></ol> 6. 4 MUC Dosage de l&#39;activité de TrCel5A <ol><li> Préparer une solution stock de 10 mM 4 MUC dans 50% (v / v) méthanol, et de le stocker dans l&#39;obscurité à la température ambiante </li><li> Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de travail 4-MUC 2x, composé de 1 mM de 4-MUC et 60 mM d&#39;acétate de sodium, pH 4,8. </li><li> Effectuer ce test sur ​​des échantillons contenant 100 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible), 100 ul d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. 1:1000 reesei, et pur H 2 O, respectivement. Tester chaque échantillon en triple exemplaire. </li><li> Ajouter 100 ul de la solution de travail 4-MUC dans des puits séparés d&#39;une plaque de 96 puits, puis ajouter 100 ul de chaque échantillon. </li><li> Déterminer 0 min timepoint de 4-MU fluorescence à travers la spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 360 ​​nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li><li> Incuber les plaques à 20min à 50 ° C, recouvertes avec des couvercles d&#39;adhésif pour empêcher l&#39;évaporation. Arrêter la réaction par le gel (ou en combinant 100 pi 0,15 M de glycine, pH 10,0, et 100 ul d&#39;échantillon dans une plaque séparée). </li><li> Déterminer le point de terminaison de 4-MU fluorescence par spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 360 ​​nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. Soustraire 0 min de point de terminaison (20 min) timepoint pour obtenir le changement de valeurs de fluorescence. </li></ol> 7. Azo-carboxyméthyl cellulose Dosage de l&#39;activité de TrCel5A <ol><li> Préparer un stock de 1,5% (p / v) Azo-CMC qui est stocké à la température ambiante, et une solution de précipitation contenant de l&#39;acétate 18 mM de zinc, 0,5 M d&#39;acétate de sodium, pH 5 et 80% d&#39;éthanol (v / v), entreposer à manger température. </li><li> Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de CMC Azo-2x travail, composé de 1% (p / v) Azo-CMC (dans H 2 O) et de 60 mM d&#39;acétate de sodium, pH 4,8. </li><li> Moissonneuse 50 ul d&#39;échantillon et 50 ul de travailsolution durable en tubes de 1,5 ml. </li><li> Les échantillons d&#39;essai contenant 50 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimé de manière transitoire); 100 pl d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei dilué 1:1000; et pur H 2 O. Échantillons et des normes en triple. </li><li> Incuber les échantillons pendant 20 min à 50 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 250 ul de solution de précipitation. Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 10 secondes pour assurer des solutions ont été complètement combinés. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min, puis à nouveau vortex. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min. Prélever 200 ul de chaque échantillon surnageant à une plaque de 96 puits, en prenant soin de ne pas perturber le culot. </li><li> Dosage par spectroscopie d&#39;absorbance à une longueur d&#39;onde de 590 nm. </li></ol> 8. PAHBAH Dosage de TrCel5A <ol><li> Utilisez un poinçon à découper un cercle (~ de 5,5 mm de diamètre) de papier filtre. Ajouter 100 ul de 60 mM NaAc, pH 4,8, et 100 pi d&#39;échantillons, soit contenant des protéines de feuille (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible) ou un T. commerciale mélange de cellulases reesei, dilué 1:1000, et incuber avec des cercles de papier filtre pendant 20 heures à 50 ° C avec 300 tours en secouant. Pour chaque échantillon incubé avec du papier filtre, incuber également une solution double sans papier filtre comme échantillon-commandes individuelles. </li><li> Préparer un 330 mM p-hydroxy hydrazide de l&#39;acide benzoïque (PAHBAH) solution A en dissolvant PAHBAH en H 2 O avec l&#39;ajout de 5 ml de HCl concentré pour un total de 100 ml de solution, et conserver à la température ambiante. Nota: Les meilleurs résultats sont obtenus en ajoutant le HCl à un plus petit volume de PAHBAH suspension, c&#39;est à dire 30 ml, que l&#39;on agite à une température d&#39;aider la dissolution avant d&#39;effectuer le volume à 100 ml avec de l&#39;H 2 O. </li><li> Préparer PAHBAH solution B, contenant du citrate de sodium 50 mM, 10 mM de chlorure de calcium, et du NaOH 500 mM et stocker à température ambiante. </li><li> Immediately avant le dosage, préparer une solution de travail de 1,5 x 1 ml de réactif PAHBAH à 9 ml de solution tampon, stocker sur de la glace jusqu&#39;à utilisation (pour être utilisé dans les 4 heures). </li><li> Préparer les échantillons en thermostables 0,2 ou 0,5 ml tubes. Moissonneuse 5 pi de chaque solution incubée avec un papier filtre (étape 8.1), 45 ul de H 2 O et 100 ul de solution de travail PAHBAH. contrôles d&#39;échantillons (échantillons incubés sans papier filtre) doivent être exécutés dans les mêmes concentrations (5 échantillons de pi, 45 pi H 2 O, solution de travail de 100 pi de PAHBAH). Tester également des normes 5 (5 ul) contenant entre 0 et 0,2 g / L de glucose pur et H 2 O. Échantillons et des normes en triple. </li><li> Incuber les échantillons pour exactement 10 min à 100 ° C, puis refroidir à température ambiante pendant exactement 10 min. solutions de pipette dans une plaque de 96 puits et le dosage par spectroscopie à une longueur d&#39;onde de 410 nm. Soustraire échantillons-contrôles individuels (incubées sans papier filtre) à partir d&#39;échantillons d&#39;obtenir finalevaleurs. </li></ol>

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<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants 1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l&#39;utilisation de différentes localisations ...

<html> La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l&#39;établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l&#39;hémicellulose 1. systèmes d&#39;expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d&#39;enzymes à l&#39;échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l&#39;ont été pendant des milliers d&#39;années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d&#39;auto-hydrolyse 2, et la possibilité d&#39;optimiser l&#39;utilisation des taux d&#39;enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales 1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d&#39;expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d&#39;accumulation croissance et la biomasse 4. L&#39;expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps 5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l&#39;analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d&#39;expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d&#39;expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l&#39;hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose 7. La technique d&#39;expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l&#39;expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed 8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l&#39;extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L&#39;expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans&#39;asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l&#39;exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique 9. Pour analyser l&#39;activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d&#39;activité de cellulase peut être exécuté. Après l&#39;extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d&#39;incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d&#39;un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l&#39;activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité 10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l&#39;activité d&#39;endoglucanase comprend l&#39;analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) 11. En outre, l&#39;activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l&#39;utilisation d&#39;un test d&#39;analyse de sucre, tel que l&#39;hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage 12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l&#39;activité de la cellulase d&#39;intérêt exprimée.

<table><tbody><tr><td>4-méthylumbellifèreryl &bêta ;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acétosyringon (concentré)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique - kanamycine</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique - rifampicine</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique - carbénicilline</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti chèvre AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxyméthylcellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-cyclodextrine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyméthylcellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Rouge Congo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie bleu brillant G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre - Papier buvard Rotilabo</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES tampon</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Sol, Einheitserde classic&nbsp ;</td><td>Spectromètre PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&nbsp ;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée</td><td>au phosphate ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière UV - BLAK RAY</td> Vibratome <td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression de recombinant cellulase cel5a de<em&gt; trichoderma reesei</em&gt; dans les usines de tabac

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l&#39;utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d&#39;expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d&#39;enzymes et d&#39;autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l&#39;expression transitoire d&#39;une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l&#39;activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d&#39;évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d&#39;expression constitutifs ou inductibles.

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d&#39;expression transitoire (figures 1A et 1B). L&#39;examen du profil d&#39;expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l&#39;expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D). Extraction des protéines solubles totales a été effectué sur des p...

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l&#39;intermédiaire d&#39;un système d&#39;expression transitoire. L&#39;expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l&#39;activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'exprimer de façon transitoire des protéines cibles dans le tabac afin d'évaluer la faisabilité d'une expression enzymatique à base végétale en un court laps de temps. Cette expression transitoire est réalisée en infiltrant les feuilles de tabac avec une souche d'Agrobacterium tumefaciens contenant un vecteur intégrant le gène d'intérêt, dans une deuxième étape. Après incubation, les feuilles végétales infiltrées sont récoltées et des extraits protéiques sont partiellement purifiés pour obtenir une solution enzymatique fonctionnelle. Ensuite, une analyse protéique est effectuée afin d'évaluer les effets de l'expression à base végétale sur l'enzyme et de vérifier son activité enzymatique.Des résultats sont obtenus, montrant la taille des protéines, les effets de glycosylation possibles et l'activité enzymatique basée sur des immunotransferts, des essais de zy et de dégradation de substrat. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la conversion de la biomasse végétale et peut également fournir des informations sur l'activité des enzymes après leur expression transitoire dans le tabac. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'infiltration sont difficiles à maîtriser en raison du fait que les feuilles sont facilement endommagées par la seringue, les vêtements de protection et je réaliserai les expériences dans des conditions stériles.Transférez des colonies individuelles d'agrobactérium dans un flacon Erlenmeyer contenant 10 millilitres de bouillon d'extrait de levure avec des antibiotiques. Incubez ensuite le bouillon inoculé pendant 36 à 40 heures à 26 degrés Celsius avec agitation à 180 tr/min. Ensuite, inoculez 200 microlitres de chaque culture dans 20 millilitres de bouillon d'extrait de levure contenant les mêmes antibiotiques qu'auparavant, et incubez dans les mêmes conditions pendant 36 à 40 heures.Induire les cultures avec deux microlitres d'acétophénone, 100 microlitres de solution de glucose à 40 % et 200 microlitres de tampon MES un molaire à pH 5,6, puis poursuivre l'incubation toute la nuit. Prélever maintenant les plantes de la serre et utiliser la pointe d'une pipette pour entailler le côté axial AB de la troisième à la cinquième feuille à partir du sommet de la plante afin de faciliter l'infiltration. Ensuite, remplir une seringue avec le milieu d'infiltration et la placer sur l'un des entames préalablement réalisés.Supportez la seringue avec un doigt du côté de la feuille axiale et injectez soigneusement le milieu dans la zone intraveineuse de la feuille. Pour visualiser la fluorescence dans les sections foliaires exprimant TR cell 5:00 AM cherry, éclairez les plantes avec une source lumineuse portable émettant une lumière verte. Lorsqu'on les observe à travers un filtre rouge, la fluorescence provenant de TR cell 5:00 AM cherry sera clairement visible.Pour extraire les protéines exprimées, sélectionnez des feuilles de tabac ayant été infiltrées avec le milieu AUM contenant la souche P track ERTR cellule cinq A, puis découpez-les en morceaux d'un gramme. Ensuite, placez-les dans un mortier prérefroidi et ajoutez une quantité appropriée d'azote liquide aux échantillons. Réduisez les feuilles en poudre à l'aide d'un pilon.Répétez le processus avec des feuilles de tabac non infiltrées afin d'obtenir des échantillons témoins. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS contenant un millimolaire de fluorure de phénylméthylsulfonyle au tissu foliaire broyé et mélangez jusqu'à ce que la majeure partie du tissu soit en suspension. Centrifugez l'extrait à 15 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, éliminez le culot, partiellement purifié TR cellule cinq A en incubant la protéine contenant le SNAT à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis laissez reposer à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires. Ensuite, centrifugez le SNAT à 15 000 ×g pendant 10 minutes à température ambiante. Éliminez le culot et utilisez le SNAT contenant la protéine pour tout.Autres tests. Effectuez également le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées afin d'obtenir des échantillons témoins. Dans cette procédure, mélangez de l'éthylcellulose et de l'eau pour obtenir une solution à 1,5 % et incubez sous agitation jusqu'à dissolution.Pour préparer un gel A-C-M-C-S-D-S, substituez un millilitre de CMC à 1,5 % à un millilitre d'eau dans une solution de gel SDS-PAGE de 10 millilitres et versez le gel normalement. Ensuite, dénaturez les échantillons en les faisant bouillir en présence de SDS. Réalisez l'électrophorèse à 200 volts pendant 50 minutes, jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le bas du gel. Effectuez maintenant le repliement des protéines dans le gel sur un gel SDS-PAGE contenant 0,15 % de C-M-C.Utiliser une solution de bêta-cyclodextrine à 1,5 % dans un tampon phosphate-citrate 20 millimolaire à pH 6,5. Incuber le gel dans cette solution à température ambiante sous agitation douce pendant 15 minutes. Éliminer la solution de bêta-cyclodextrine et rincer brièvement le gel avec de l'eau, puis l'incuber à température ambiante dans un tampon acétate de sodium 50 millimolaire à pH 4,8 pendant 15 minutes supplémentaires.Ensuite, effectuez la CMC zy en utilisant le gel de C-M-C-S-D-S au point de repliement 15 % en incubant le gel dans un tampon d'acétate de sodium 30 millimolaire pendant 20 minutes à 50 degrés Celsius. Pour visualiser l'endroit où la CMC a été dégradée, coloriez le gel pendant 10 minutes à l'aide d'une solution de rouge Congo à 0,1 % et arrêtez la réaction à l'aide de chlorure de sodium 1 molaire pendant 30 minutes ou jusqu'à l'apparition de bandes nettes ; à la fin, lavez le gel avec de l'acide acétique à 0,3 %. Pour une imagerie plus nette juste avant d'effectuer le dosage, préparez une solution de travail quatre MUC deux X et pipetez 100 microlitres de la solution de travail quatre MUC dans des puits distincts d'une plaque de 96 puits.Ensuite, ajouter 100 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés, en effectuant chaque échantillon en triple, en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 360 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 465 nanomètres. Déterminer le point temporel à zéro minute de la fluorescence de quatre mu par spectroscopie de fluorescence. Ensuite, incuber les plaques recouvertes de couvercles adhésifs à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, arrêter la réaction en congelant. Après cela, mesurer la fluorescence finale en unités de fluorescence en utilisant les mêmes paramètres que pour le point temporel à zéro minute. Soustraire la valeur de fluorescence à zéro minute de la valeur de fluorescence à 20 minutes pour déterminer la variation de fluorescence provoquée par l'activité enzymatique juste avant d'effectuer le dosage.Préparez la solution de travail A-O-C-M-C deux X. Ensuite, mélangez 50 microlitres de l'échantillon et 50 microlitres de la solution de travail dans un tube de 1,5 millilitre. Incubez ensuite les échantillons pendant 20 minutes à 50 degrés Celsius.Arrêter la réaction en ajoutant 250 microlitres de solution de précipitation. Ensuite, vortexer chaque échantillon vigoureusement pendant 10 secondes afin d'assurer un mélange complet de l'échantillon avec la solution de précipitation. Puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes et les vortexer à nouveau avant de les centrifuger à 1000 Gs pendant 10 minutes.Ensuite, transférez 200 microlitres du SNAT de chaque échantillon dans une plaque de 96 puits sans perturber le culot. L'activité enzymatique du culot se manifeste par des concentrations plus élevées de colorant solubilisé. Mesurez ceci par spectrophotométrie d'absorption à une longueur d'onde de 590 nanomètres.Dans cette étape, placez des cercles de papier filtre dans des tubes de 1,5 ou deux millilitres. Ajoutez 100 microlitres d'acétate de sodium 60 millimolaire et 100 microlitres des échantillons sur les cercles de papier filtre, puis incubez pendant 20 heures à 50 degrés Celsius avec agitation à 300 tr/min.En outre, incubez les échantillons individuels sans papier filtre comme témoins immédiatement avant d'effectuer le dosage. Préparez une solution travail de PABA à 1,5 x contenant un millilitre de solution A de PBA et neuf millilitres de solution B de PABA. Conservez-la sur de la glace jusqu'à utilisation. Ensuite, préparez les échantillons dans des tubes thermostables de 0,5 millilitre.Les échantillons sont composés de 45 microlitres d'eau, de cinq microlitres de chaque solution incubée avec du papier filtre et de 100 microlitres de solution working de PABA. Ensuite, exécutez les témoins de l'échantillon et cinq étalons préparés de la même manière. Puis incubez les échantillons, les témoins et les étalons exactement 10 minutes à 100 degrés Celsius et laissez refroidir à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires.Prélèvez 100 microlitres de la solution et déposez-les dans une plaque de 96 puits pour un dosage au spectrophotomètre à une longueur d'onde de 410 nanomètres. Soustrayez les valeurs des témoins individuels des échantillons des valeurs des échantillons de papier filtre afin de déterminer la quantité de sucres réducteurs libérés. Voici une image montrant les cassettes d'expression ainsi que l'expression protéique chez les plantes de tabac.Voici à quoi ressemble une feuille de tabac infiltrée sous lumière normale et sous lumière verte avec un filtre rouge, où l'expression de la cellule TR 5:00 AM cherry, indiquée par la couleur rouge, est clairement visible ici. Le gel SDS-PAGE, le western blot et le zymogramme CMC montrent la taille et l'activité de la cellule T cinq A. Les protéines solubles totales ont été séparées et nous pouvons les visualiser par coloration au bleu de Kumasi. Le western blot réalisé contre la région histidine-tag (hist tag) de la cellule T cinq A confirme la taille de la protéine, et l'activité cellulase contre le CMC est en outre démontrée par un zymogramme coloré au rouge Congo. Ce que l'on observe ici correspond aux protéines solubles totales extraites des feuilles de tabac dans lesquelles la cellule TR cinq A a été exprimée de façon transitoire, avant et après une purification par précipitation thermique, où la cellule TR cinq A constitue la bande la plus intense et est également détectable sur le western blot et le zymogramme CMC.Nous observons également les protéines solubles totales provenant de plantes de tabac où Tcell cinq A n’a pas été soumis à une précipitation thermique, ainsi que les protéines issues d’un mélange commercial de cellulase tresa. Cette figure montre la quantification de l’activité enzymatique de TR cell cinq A : TR cell cinq A a été incubé avec du MUC Azo CMC à quatre concentrations ou du papier filtre, et la dégradation du substrat a été mesurée par la libération du colorant azoïque fluoro quatre quatre mu, ou par la quantification des sucres réducteurs à partir du changement de couleur du PBA selon cette procédure. D'autres méthodes, comme le ciblage protéique, peuvent être utilisées pour obtenir des informations supplémentaires sur la manière dont la localisation de la protéine peut influencer la stabilité et l'activité enzymatique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une compréhension claire de la manière d'exprimer de façon transitoire des protéines dans le tabac, ainsi qu'une bonne connaissance des méthodes permettant d'évaluer l'activité enzymatique. Pour la conversion de la biomasse en cellulose.

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