Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

L’objectif global de cette procédure est d’isoler, d’identifier et de purifier les cellules épithéliales thymiques ou la technologie. Ceci est accompli en digérant et en perturbant mécaniquement le thymus par voie enzymatique pour dissocier la technologie en une suspension unicellulaire. Ensuite, la technologie peut être analysée par cytométrie en flux ou enrichie via une stratégie de panoramique.

En fin de compte, les sous-ensembles épithéliales thymiques peuvent être purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à de nombreuses questions clés dans le domaine du développement des lymphocytes T, telles que : comment les cellules épithéliales thymiques favorisent-elles la sélection thymique ? Qu’est-ce qui cause le dysfonctionnement thymique chez les animaux vieillissants et comment pouvons-nous réaliser une reconstitution des lymphocytes T in vitro ?

Les principaux avantages de cette technique sont la récupération élevée des cellules germales émiques variables, l’enrichissement non biaisé des cellules épithéliales émiques et la grande pureté qui peut finalement être obtenue par le tri cellulaire. Pour isoler les cellules stromales thymiques, identifiez d’abord le thymus, qui se trouve juste sous les côtes et ressemble à deux minces lobes blancs recouvrant le cœur. Débranchez ensuite le tissu conjonctif entourant le thymus et utilisez une pince dentelée incurvée pour tirer et retirer doucement les lobes thymiques.

Placez les lobes dans une assiette à six puits contenant cinq millilitres de milieu et coupez la graisse et le tissu conjonctif environnants. Ensuite, transférez les lobes coupés dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de solution enzymatique fraîchement préparée et utilisez des ciseaux fins pour faire de petites incisions dans le tissu. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Après 20 minutes, pipetez doucement le tissu de haut en bas plusieurs fois avec une pipette de cinq millilitres pour dissocier la suspension en une suspension unicellulaire. Recueillir la fraction surnageante dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de tampon froid riche en albumine sur de la glace pour neutraliser les enzymes. Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de solution enzymatique au tissu restant.

Incuber l’assiette pendant 15 minutes. Après cela, agitez doucement le tissu avec une seringue de trois millilitres équipée d’une aiguille à 18 gènes pour briser tous les agrégats. Transférez ensuite le dans le tube de collecte.

Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de solution enzymatique au tissu restant. Incuber l’assiette pendant 15 minutes. Après la troisième incubation, répétez l’agitation mécanique avec une aiguille 20 5G.

Après avoir incubé le tissu pendant cinq à 10 minutes, transférez le surnageant dans le tube de collecte pour la centrifugation afin d’identifier la technologie récupérée par cytométrie en flux Conformément aux procédures standard de coloration des anticorps, analysez les échantillons sur un cytomètre en flux multiparamètre et analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse par fax approprié pour enrichir davantage la technologie par la méthode de panoramique. Tout d’abord, incubez les cellules avec l’anticorps approprié pour l’enrichissement. Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire dans une plaque de panoramique précodée, puis faites tourner la plaque et incubez à température ambiante.

Après 30 minutes, faites tourner vigoureusement la plaque, puis transférez le surnageant dans un tube conique. Rincez la plaque deux fois avec un produit frais, moyen, en regroupant les lavages dans le tube de collecte. Ensuite, après avoir fait tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de frais et transférez la suspension cellulaire sur une nouvelle plaque de cuisson, en recueillant les cellules après avoir tourbillonné et incubé comme nous venons de le démontrer pour purifier davantage la technologie enrichie dans leurs sous-ensembles de cellules thymiques.

Après le marquage avec les anticorps appropriés, triez la technologie à travers une buse de 100 micromètres par tri cellulaire activé par fluorescence, en collectant les cellules à 30 % volume par volume FBS dans le milieu. Dans cette stratégie de contrôle représentative pour l’identification de la technologie par cytométrie en flux, l’expression de l’epca, mais pas du CD 45 par la technologie peut être observée. Ainsi, la technologie peut être fermée en fonction de leur expression ep, camm et CD 45 la technologie sont composées de sous-ensembles épithéliales corticaux ou CEC et médullaires ou thymiques mtech.

Ces sous-ensembles peuvent être distingués par l’anticorps vivant 51, qui reconnaît la G glutamyl amino peptidase exprimée par ctec et la lectine UEA, qui se lie à mtech à la fois ctech et Mtech expriment le CMH de classe deux sur leurs surfaces. Bien que mtech puisse être classé en populations mtech low et mtech high, en fonction de leur niveau d’expression du CMH deux, environ huit fois plus de tech peut être récupéré en utilisant le protocole basé sur l’enzyme liase qui vient d’être démontré par rapport à un protocole avec collagénase et espace disque avec environ neuf fois 10 à cinquième, pouvant être récupéré à partir d’un seul thymus de souris pour diminuer le temps de tri et augmenter la viabilité de la cellules stromales récupérées. Le panoramique peut être utilisé, comme cela vient d’être démontré, pour épuiser les sites thymocytaires par rapport aux cellules entières du thymus préparées.

La proportion de technologies passe de moins de 0,5 % à plus de 15 % dans la population cellulaire post-enrichie. Après le panoramique, les proportions des sous-ensembles techniques ne sont pas modifiées, ce qui suggère qu’aucun des sous-ensembles n’est perdu de manière sélective pendant le déplacement. Par rapport à l’échantillon de pré-enrichissement, le taux de récupération de la technologie est d’environ 85 %Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enrichir les cellules germinales thématiques de plus de par panique, ainsi que de la façon d’identifier et de purifier davantage de gouttes épithéliales thématiques par cytométrie en flux.