Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales
8 août 2014
Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.
L’objectif global de cette procédure est d’isoler, d’identifier et de purifier les cellules épithéliales thymiques ou la technologie. Ceci est accompli en digérant et en perturbant mécaniquement le thymus par voie enzymatique pour dissocier la technologie en une suspension unicellulaire. Ensuite, la technologie peut être analysée par cytométrie en flux ou enrichie via une stratégie de panoramique.
En fin de compte, les sous-ensembles épithéliales thymiques peuvent être purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à de nombreuses questions clés dans le domaine du développement des lymphocytes T, telles que : comment les cellules épithéliales thymiques favorisent-elles la sélection thymique ? Qu’est-ce qui cause le dysfonctionnement thymique chez les animaux vieillissants et comment pouvons-nous réaliser une reconstitution des lymphocytes T in vitro ?
Les principaux avantages de cette technique sont la récupération élevée des cellules germales émiques variables, l’enrichissement non biaisé des cellules épithéliales émiques et la grande pureté qui peut finalement être obtenue par le tri cellulaire. Pour isoler les cellules stromales thymiques, identifiez d’abord le thymus, qui se trouve juste sous les côtes et ressemble à deux minces lobes blancs recouvrant le cœur. Débranchez ensuite le tissu conjonctif entourant le thymus et utilisez une pince dentelée incurvée pour tirer et retirer doucement les lobes thymiques.
Placez les lobes dans une assiette à six puits contenant cinq millilitres de milieu et coupez la graisse et le tissu conjonctif environnants. Ensuite, transférez les lobes coupés dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de solution enzymatique fraîchement préparée et utilisez des ciseaux fins pour faire de petites incisions dans le tissu. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius.
Après 20 minutes, pipetez doucement le tissu de haut en bas plusieurs fois avec une pipette de cinq millilitres pour dissocier la suspension en une suspension unicellulaire. Recueillir la fraction surnageante dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de tampon froid riche en albumine sur de la glace pour neutraliser les enzymes. Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de solution enzymatique au tissu restant.
Incuber l’assiette pendant 15 minutes. Après cela, agitez doucement le tissu avec une seringue de trois millilitres équipée d’une aiguille à 18 gènes pour briser tous les agrégats. Transférez ensuite le dans le tube de collecte.
Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de solution enzymatique au tissu restant. Incuber l’assiette pendant 15 minutes. Après la troisième incubation, répétez l’agitation mécanique avec une aiguille 20 5G.
Après avoir incubé le tissu pendant cinq à 10 minutes, transférez le surnageant dans le tube de collecte pour la centrifugation afin d’identifier la technologie récupérée par cytométrie en flux Conformément aux procédures standard de coloration des anticorps, analysez les échantillons sur un cytomètre en flux multiparamètre et analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse par fax approprié pour enrichir davantage la technologie par la méthode de panoramique. Tout d’abord, incubez les cellules avec l’anticorps approprié pour l’enrichissement. Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire dans une plaque de panoramique précodée, puis faites tourner la plaque et incubez à température ambiante.
Après 30 minutes, faites tourner vigoureusement la plaque, puis transférez le surnageant dans un tube conique. Rincez la plaque deux fois avec un produit frais, moyen, en regroupant les lavages dans le tube de collecte. Ensuite, après avoir fait tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de frais et transférez la suspension cellulaire sur une nouvelle plaque de cuisson, en recueillant les cellules après avoir tourbillonné et incubé comme nous venons de le démontrer pour purifier davantage la technologie enrichie dans leurs sous-ensembles de cellules thymiques.
Après le marquage avec les anticorps appropriés, triez la technologie à travers une buse de 100 micromètres par tri cellulaire activé par fluorescence, en collectant les cellules à 30 % volume par volume FBS dans le milieu. Dans cette stratégie de contrôle représentative pour l’identification de la technologie par cytométrie en flux, l’expression de l’epca, mais pas du CD 45 par la technologie peut être observée. Ainsi, la technologie peut être fermée en fonction de leur expression ep, camm et CD 45 la technologie sont composées de sous-ensembles épithéliales corticaux ou CEC et médullaires ou thymiques mtech.
Ces sous-ensembles peuvent être distingués par l’anticorps vivant 51, qui reconnaît la G glutamyl amino peptidase exprimée par ctec et la lectine UEA, qui se lie à mtech à la fois ctech et Mtech expriment le CMH de classe deux sur leurs surfaces. Bien que mtech puisse être classé en populations mtech low et mtech high, en fonction de leur niveau d’expression du CMH deux, environ huit fois plus de tech peut être récupéré en utilisant le protocole basé sur l’enzyme liase qui vient d’être démontré par rapport à un protocole avec collagénase et espace disque avec environ neuf fois 10 à cinquième, pouvant être récupéré à partir d’un seul thymus de souris pour diminuer le temps de tri et augmenter la viabilité de la cellules stromales récupérées. Le panoramique peut être utilisé, comme cela vient d’être démontré, pour épuiser les sites thymocytaires par rapport aux cellules entières du thymus préparées.
La proportion de technologies passe de moins de 0,5 % à plus de 15 % dans la population cellulaire post-enrichie. Après le panoramique, les proportions des sous-ensembles techniques ne sont pas modifiées, ce qui suggère qu’aucun des sous-ensembles n’est perdu de manière sélective pendant le déplacement. Par rapport à l’échantillon de pré-enrichissement, le taux de récupération de la technologie est d’environ 85 %Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enrichir les cellules germinales thématiques de plus de par panique, ainsi que de la façon d’identifier et de purifier davantage de gouttes épithéliales thématiques par cytométrie en flux.
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Aperçu
Cet article présente une méthode pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales thymiques (CET) de souris. Le protocole est conçu pour faciliter les études sur la fonction du thymus, le développement des cellules T et le dysfonctionnement thymique.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Fonction du thymus
Contexte
- Les cellules épithéliales thymiques jouent un rôle crucial dans le développement des cellules T.
- La compréhension des CET peut fournir des aperçus sur les processus de sélection thymique.
- Le dysfonctionnement thymique est associé au vieillissement et à diverses maladies.
- La reconstitution des cellules T est vitale pour les stratégies thérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Isoler et purifier les CET pour une analyse détaillée.
- Investiguer les mécanismes de sélection thymique.
- Explorer les causes du dysfonctionnement thymique dans le vieillissement.
Méthodes utilisées
- Digestion enzymatique et rupture mécanique du thymus.
- Cytométrie en flux pour l'analyse des CET.
- Stratégie de panning pour l'enrichissement des CET.
- Tri cellulaire activé par fluorescence pour la purification des sous-ensembles CET.
Résultats principaux
- Isolement et purification réussis des CET.
- Identification des sous-ensembles clés de CET impliqués dans le développement des cellules T.
- Aperçus sur les mécanismes de sélection thymique.
- Implications potentielles pour les thérapies de reconstitution des cellules T.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour étudier les CET.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la fonction et du dysfonctionnement thymique.
- Les recherches futures peuvent s'appuyer sur ce protocole pour explorer le développement des cellules T.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
