Name: Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour lanalyse des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez la construction d'une langue électronique par approche combinatoire pour l'analyse de protéines. Cette méthode utilise l'imagerie par résonance de plasmons de surface pour générer des profils d'évolution continue en 3D et discriminer efficacement les protéines purifiées.

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Les auteurs tiennent à remercier la bourse de doctorat du LANEF à Grenoble pour le soutien de Laurie-Amandine Garçon. Ces travaux ont été soutenus financièrement par l’Agence nationale de la recherche (subvention ANR 06-NANO-045).

1 Préparation des différentes solutions et échantillons de protéines <ol><li> Préparer 100 ml d&#39;une solution tampon phosphate (PBS-G) contenant 50 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 50 mM, glycerol à 10% et à un pH de 6,8. </li><li> Préparer 250 ml d&#39;une solution tampon HEPES contenant 10 mM d&#39;HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20 à pH 7,4. </li><li> Préparer une solution stock de bloc de construction 1 (BB1) lactose et le renforcement bloc 2 (BB2) sulfaté lactose (Figure 1) à 0,2 mM dans du PBS-G. </li><li> Préparer 1 ml de solutions de protéines dans HEPES: Une lectine rachis hypogaea (AHL) à 500 nm, la myoglobine à 1 uM, et lysozyme à 500 nM. </li><li> Préparer 20 ml de SDS à 1% dans de l&#39;eau ultrapure. </li></ol> 2 Préparation de la matrice CoCRR <ol><li> Nettoyer la surface d&#39;or du prisme 48 heures avant de l&#39;utiliser avec un nettoyeur à plasma pendant 3 min dans ces conditions: 75% d&#39;oxygène, 25% d&#39;argon, 0,6 mbar, puissance 40 W. </li><li> Préparer solutio pur et mixte onzens de BB1 ​​et BB2 avec [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapports entre 0 et 100% par incréments de 10% à une concentration BB total de 0,1 mM dans du PBS-G. </li><li> Dépôt 8 gouttelettes nl de ces solutions pures et mixtes sur la surface du prisme à l&#39;aide d&#39;un observateur sans contact en quatre pour chaque rapport avec 44 points au total (figure 2). NOTE: 10% de glycerol ajoutée dans du PBS-G est très important pour réduire l&#39;évaporation du solvant et le changement de concentration BB après le dépôt. </li><li> Placer le prisme à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri contenant 1 ml d&#39;eau ultra-pure et laisser O / N à la température ambiante pour l&#39;auto-assemblage de BB1 ​​BB2 et sur la surface d&#39;or. Ici, on suppose que la composition de surface moyenne dans le SAM mixte reflète la composition de la solution mixte de dépôt (figure 3) 11. </li><li> Laver soigneusement le prisme avec de l&#39;eau ultra pure et puis on sèche sous un flux d&#39;argon. </li></ol> 3 protéines de détection par SPRi <ol><li> Réglez le incubator dans laquelle l&#39;appareil est placé SPRi à 25 ° C afin d&#39;éviter les changements d&#39;indice de réfraction induits par la variation de température au cours de la détection de protéines. </li><li> Insérer un prisme non fonctionnalisé rinçage dans le 10 ul éther cétone de polyéther (PEEK) cellule connectée à une pompe à seringue commandé par ordinateur, un dégazeur et une soupape d&#39;injection de fluide sous pression 6 ports écoulement (figure 4). Remplir dans le système d&#39;écoulement avec fraîchement filtré et dégazé course de tampon HEPES. </li><li> Retirer le prisme de rinçage et insérer le prisme contenant le réseau CoCRR dans la cellule d&#39;écoulement. Exécuter HEPES à un débit de 100 ul / min. Avec l&#39;aide de la caméra CCD éliminer les bulles d&#39;air présentes sur la surface du prisme en passant rapidement tampon de migration. </li><li> Définir la zone d&#39;étude pour chaque tache en dessinant un cercle de même diamètre pour la zone d&#39;intérêt basé sur une image bien contrastée de la gamme et avec l&#39;aide d&#39;un logiciel intégré dans le système SPRi. </li><li> Tracer des courbes de plasmon, qui représentent le refletLes courbes de ivité en fonction de l&#39;angle d&#39;incidence pour tous les spots. </li><li> Choisir l&#39;angle (position à laquelle les courbes cinétiques seront enregistrées) de travail au plus haut de la pente des courbes de réflectivité. Tourner le miroir de balayage pour fixer l&#39;angle de travail choisi pour les mesures cinétiques. </li><li> Continuez à faire fonctionner HEPES à travers le système d&#39;écoulement jusqu&#39;à ce que le signal de réflectivité pour toutes les taches est stable et constant. </li><li> Injecter 1 ml de solution de LAH avec une seringue dans la boucle d&#39;échantillon (500 ul) à la vanne d&#39;injection en position &quot;charge&quot;. Ensuite, mettre la soupape d&#39;injection en position &quot;injection&quot;. Le débit utilisé pour toutes les injections de la protéine était de 100 pl / min. </li><li> Lancer des mesures cinétiques en surveillant les variations de la réflectivité en fonction du temps à la fois sur tous les points. </li><li> A la fin de l&#39;injection de la protéine, rincer la matrice avec un tampon en cours d&#39;exécution pendant 8 min. Enfin, injecter 1 ml 1% de SDS pour le régénérer. </li><li> Répétez la même procédure pour l&#39;autre proteins. </li></ol> 4 Traitement et analyse des données <ol><li> Suite à l&#39;entrée de la solution de protéine dans la cellule d&#39;écoulement, moléculaire liaison se produit et induit un décalage des courbes de plasmon et une variation de la réflectivité. Le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image convertit les valeurs d&#39;intensité lumineuse mesurées à des niveaux d&#39;échelle de gris, ce qui donne des images SPR Figure 5A, et génère la variation de la réflectivité en fonction du temps, ce qui donne sensorgrammes (Figure 5B). </li><li> Utilisation d&#39;un logiciel mathématique de calcul pour tracer la réflectivité (R%) à la fin de chaque injection de la protéine par rapport à la [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapport pour générer 2D profil d&#39;évolution continue (PEC) pour chaque échantillon (Figure 5C). </li><li> Ajouter le [BB1] / ([BB1] + [BB2]) dans le rapport sensorgrammes (figure 5B) pour générer paysage 3D continu de l&#39;évolution (CEL) pour chaque protéine (figure 5D). </li></ol>

<ol><li>Margulies, D., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+protein+recognition+as+an+alternative+approach+to+antibody-mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).</li>
<li>Umali, A. P., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+to+differential+sensing+using+synthetic+molecular+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).</li>
<li>Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-based+detection+of+different+proteins+using+an+array+of+fluorescent+protein+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).</li>
<li>Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+of+proteins+based+on+an+array+of+functionalized+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).</li>
<li>Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptors+create+patterns+that+distinguish+various+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differential receptors create patterns that distinguish various proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).</li>
<li>Wright, A. T., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptor+arrays+and+assays+for+solution-based+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition.</a> Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle%E2%80%93fluorescent+polymer+%E2%80%98chemical+nose%E2%80%99+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).</li>
<li>De, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+proteins+in+human+serum+using+conjugates+of+nanoparticles+and+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein.</a> Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+evolution+profiles+for+electronic-tongue-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).</li>
<li>Campbell, C. T., Kim, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPR+microscopy+and+its+applications+to+high-throughput+analyses+of+biomolecular+binding+events+and+their+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics.</a> Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).</li>
<li>Stranick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-scale+phase+separation+in+mixed+composition+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers.</a> Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

<html> Les étapes les plus critiques pour la construction de cette eT sont dédiés à assurer une bonne reproductibilité du système. Par exemple, le nettoyage de la surface d&#39;or du prisme avec une procédure normalisée avant utilisation, en ajoutant 10% de glycerol dans les onze solutions pures et mixtes de BB1 ​​et BB2 pour éliminer l&#39;évaporation du solvant pendant BB auto-assemblage sur la surface d&#39;or du prisme, dépôt de plusieurs répétitions pour chaque [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Ratio, etc. Comme pour...

Méthodes de détection des protéines précises et rapides sont très importants dans le diagnostic médical et de la protéomique. Puces à protéines de détection classiques, tels que les biopuces, sont basés sur le principe de la reconnaissance &quot;clé lock-et-&quot; et nécessitent des récepteurs spécifiques tels que les aptamères, des anticorps ou mimétiques. Au cours des dernières années, la détection différentielle inspiré par le olfaction humaine et gustation a émergé comme une alternative 1. Ce nez / langue électronique (fr / eT) approche est basée sur la liaison d&#39;analytes à un réseau de récepteurs à réaction croisée (SDRC), qui n&#39;ont pas besoin d&#39;être très spécifique ou sélective pour les molécules cibles différentielle permet donc de surmonter le laborieux processus de développement de récepteurs hautement sélectifs. Il s&#39;agit de la réponse combinée de tous les récepteurs qui crée un motif distinct pour chaque échantillon, comme une empreinte digitale, permettant son identification. Les deux principaux défis pour le développement des electronic nez / langue pour la détection de la protéine efficace sont la production d&#39;éléments de détection qui ont la capacité de faire la distinction entre les analytes structurellement similaires et le système de transduction approprié pour l&#39;événement de liaison. Jusqu&#39;à présent, les études ont rapporté diverses approches du développement du tableau 2. Par exemple, dans une étude d&#39;une identification basée sur la baie de protéines a été développé en utilisant CRC qui préparés à partir des dérivés tétra-carboxyphenylporphyrin par couplage de groupes carboxyle de différents acides aminés ou de dipeptides à fournir des récepteurs différentiels possédant un noyau hydrophobe de l&#39;affinité pour les protéines et les périphéries chargées distinctes pour transmettre liaison différentielle. En utilisant ce système, les différentes protéines et des mélanges de protéines ont été identifiées par la mesure de l&#39;extinction de fluorescence des récepteurs de l&#39;interaction avec les analytes 3,4. Dans une autre étude, une bibliothèque de 29 CRC qui tripeptide contenant et fragments d&#39;acide boronique synthétisé d&#39;une manière combinatoire sur un hexasubstil&#39;ar- échafaudage de benzène a été mis au point pour détecter les protéines avec une détection colorimétrique indicateur d&#39;absorption de 5,6. Avec une telle conception, chaque récepteur différentiel a montré une capacité de liaison de protéines sur la base de la variance dans les bras et les peptides, les acides boroniques ont aidé à la différenciation de protéines à partir de glycoprotéines. Plus récemment, un tableau composé de différents cationiques fonctionnalisés nanoparticules d&#39;or conjugués avec un poly anionique polymère fluorescente (p-phénylèneéthynylène) (PPE) a été créé pour détecter et identifier les protéines 7. La liaison de concurrence entre les analytes de protéines et trempé complexes de nanoparticules / or EPI fluorescence régénérées, la production de modèles de reconnaissance distinctes pour les protéines. Dans cette étude, les interactions protéines-nanoparticules fonctionnalisées ont été réglées en faisant varier les propriétés physico-chimiques des groupes terminaux de nanoparticules. En outre, il a été montré que cette approche est efficace pour l&#39;analyse des protéines dans un milieu complexe et riche en protéines telleque le sérum humain à des concentrations physiologiquement pertinents, montrant ainsi le potentiel de eT dans le profilage des échantillons réels pour diagnostiquer des états pathologiques 8. Bien que très prometteur, ces systèmes ont des limites inhérentes. Ils nécessitent la conception et la synthèse du 5 au 29 CRC qui avec des structures très compliquées. En outre, contrairement au système olfactif qui est remis à zéro après chaque mesure, de la protéine de détection nécessite la préparation d&#39;une matrice par exemple. Enfin, le suivi des événements de liaison en temps réel sont extrêmement difficiles. Dans ce contexte, une approche combinatoire a été proposée en utilisant un petit nombre de molécules simples et facilement accessibles avec différentes propriétés physico-chimiques (hydrophile, hydrophobe, chargé positivement, chargé négativement, neutre, etc.) En tant que blocs de construction (BBS) 9. En mélangeant les BB en variant et des proportions contrôlées et en permettant aux mélanges à s&#39;auto-assembler sur la surface d&#39;or d&#39;unprisme, un réseau de surfaces combinatoires comportant des propriétés appropriées pour la protéine de liaison a été créé. Notamment, les monocouches auto-assemblées sur ce système permettent le réglage facile d&#39;une gamme de propriétés de surface de manière très divergente, ce qui permet divers récepteurs à réaction croisée combinatoires (CoCRRs) pour être rapidement et efficacement produite. Protéine de détection a été effectuée en utilisant un système de détection optique, la surface d&#39;imagerie par résonance de plasmon (SPRi). En bref, un large faisceau monochromatique de lumière polarisée à partir d&#39;une LED illumine toute la surface de la matrice CoCRR sur la surface du prisme. Une caméra CCD haute résolution de la vidéo fournit des images de différence en temps réel sur tous les spots de la gamme CoCRR. Il saisit toutes les modifications locales à la surface de la matrice CoCRR fournissant des informations détaillées sur les événements de liaison et les processus cinétiques 10. Pendant ce temps, à l&#39;aide de logiciels d&#39;imagerie, images SPR correspondant aux taches sont automatiquement converties en variations de réflectivité versus le temps, générer une série de courbes de liaison cinétiques appelés sensorgrammes. Ainsi, SPRi permet une observation, synchrone, parallèle, sans étiquette et en temps réel des événements de liaison. En outre, le tableau CoCRR obtenu est régénérable et réutilisable pour l&#39;analyse des protéines. Ce protocole décrit la construction de la langue électronique en utilisant seulement deux petites molécules comme des blocs de construction et illustre son application pour l&#39;analyse des protéines communes basées sur des modèles de reconnaissance continus obtenus avec SPRi.

<table><tbody><tr><td>Appareil SPRi&nbsp ;</td><td>L’appareil SPRi de Horiba Scientific-GenOptics</td><td></td><td>est placé dans un incubateur à température régulée à 25 °C.</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue&nbsp ;</td><td>Cavro scientific instruments</td><td>Cavro XLP 6000</td><td></td></tr><tr><td>Micro Elite Degasser&nbsp ;</td><td>Vanne</td><td></td> d’injection moyenne pression à 6 ports Alltech AT590507 <td></td></tr><tr><td></td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Le volume de la boucle d’injection utilisée est de 500 &micro ;l.</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma femto (version 7)</td>Système de dégazage <td>en ligne Diener Electronic</td><td></td><td>avec 2 canaux.</td></tr><tr><td>Spotter</td><td>Siliflow</td><td></td><td>Il s’agit d’un spotter piézoélectrique sans contact.</td></tr><tr><td>SPRi-Biochip</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td>36000067</td><td>Le prisme est constitué d’un prisme en verre à indice de réfraction élevé recouvert d’une fine pellicule d’or (45 nm) et spécialement développé à des fins d’imagerie.</td></tr><tr><td>Erythrina cristagalli lectine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5390</td><td></td></tr><tr><td>Arachis hypogaea lectine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>CXCL12&alpha ;</td><td></td><td></td><td>Fourni par le Dr Hugues Lortat-Jacob ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9</td></tr><tr><td>CXCL12&gamma ; &nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Fourni par le Dr Hugues Lortat-Jacob ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9</td></tr><tr><td>Lactose</td><td></td><td></td><td>fourni par le Prof. David Bonnaff ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9</td></tr><tr><td>Lactose</td><td></td><td></td> sulfaté <td>fourni par le Prof. David Bonnaff ; pour les détails de préparation, voir les informations complémentaires dans la référence 9</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr></tbody></table>

langue electronique génération schémas de reconnaissance continue pour l&#39;analyse des protéines

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

Dans le protocole actuel, une approche combinatoire a été développée pour simplifier la conception et la production de matériaux de détection pour la construction de langues électroniques (eT) pour l’analyse des protéines. En mélangeant un petit nombre de molécules simples et facilement accessibles avec des propriétés physicochimiques différentes, utilisées comme blocs de construction (BB), dans des proportions variables et contrôlées et en permettant aux mélanges de s’auto-assembler sur la surface dorée d’un prisme, un ensemble de surfaces combinatoires présentant des propriétés appropriées pour la détection des protéines a été créé. De cette façon, un grand nombre de récepteurs à réaction croisée peuvent être obtenus rapidement et efficacement. En combinant un tel réseau de récepteurs combinatoires à réaction croisée (CoCRR) avec un système de détection optique tel que l’imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), l’eT obtenu peut surveiller les événements de liaison en temps réel et générer des modèles de reconnaissance continue, y compris un profil d’évolution continue 2D (CEP) et un paysage d’évolution continue (CEL) 3D pour les échantillons dans liquide. Un tel système eT est efficace pour la discrimination des protéines purifiées courantes.

Pour sonder la capacité de la languette électronique pour l'analyse des protéines commun, trois protéines ont été utilisées: AHL, la myoglobine et le lysozyme. Pour chaque protéine, un profil 2D distinct continu de l'évolution de la CEP, a été générée par l'ET, comme le montre la figure 6. En outre, grâce à SPRi, qui est capable de surveiller les adsorption et de désorption cinétique en temps réel, pour chaque protéine un temps de modèle de reconnaissance continue dépendant,...

Une nouvelle approche est décrite pour la construction de la langue électronique (eT), qui simplifie considérablement la conception et la production de matériaux de détection, et permet à l’eT de générer des profils d’évolution continue et des paysages pour les échantillons en liquide. L’eT obtenu est efficace pour l’analyse des protéines courantes telles que la discrimination.

Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour l&#39;analyse des protéines

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de construire une langue électronique basée sur une approche combinatoire et d’effectuer une imagerie plasmatique et résonnante de surface pour l’analyse des protéines. Ceci est réalisé en utilisant du lactose et du lactose sulfaté comme éléments constitutifs et en déposant leurs mélanges sur la surface dorée d’un prisme pour l’auto-assemblage afin de créer un réseau de récepteurs combinatoires à réaction croisée. Dans un deuxième temps, l’imagerie plasma et l’imagerie par résonance sont appliquées, qui surveillent les événements de liaison en temps réel et produisent des images SPR et une série de courbes de liaison cinétiques appelées grammes de capteur.Ensuite, le traitement des données est effectué sur la base des grammes du capteur à l’aide d’un logiciel de calcul mathématique afin de créer un profil d’évolution continue 2D et un paysage d’évolution continue 3D pour chaque échantillon, les résultats montrent que la langue électronique est capable de générer des paysages d’évolution continue 3D distincts pour les protéines purifiées courantes, et est efficace pour leur discrimination basée sur la reconnaissance de formes. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes comme la gnose classique, électronique et les langues. Tout d’abord, la préparation des récepteurs de chant est largement simplifiée.Une grande diversité de récepteurs réactifs croisés peut être choisie en mélangeant un petit nombre de molécules. Deuxièmement, grâce à l’approche combinatoire, les modèles de reconnaissance générés par notre langue électronique peuvent être considérés comme continus, de sorte que les signaux anormaux peuvent être plus facilement identifiés. Par conséquent, une analyse plus fiable peut être obtenue pour préparer le réseau de récepteurs combinatoires inter-réactifs.Tout d’abord, nettoyez la surface dorée du prisme 48 heures avant de l’utiliser avec un nettoyeur plasma pendant trois minutes sous 75 % d’oxygène, 25 % d’argon, 0,6 millibar et 40 watts de puissance. Préparez ensuite 100 millilitres de solution tampon de phosphate contenant 10 % de glycérol ou PBSG. L’ajout de glycérol au PBS est très important pour réduire l’évaporation du solvant et les changements dans l’élément constitutif ou la concentration de la BHE après le dépôt.Préparez ensuite des solutions mères de lactose ou d’élément constitutif un et de lactose sulfaté, ou d’élément constitutif deux à partir des solutions mères. Préparez 11 solutions pures et mixtes avec des rapports compris entre zéro et 100 % par incréments de 10 % et une concentration totale de blocs de construction de 0,1 millimolaire dans le PBSG, déposez huit gouttelettes de nanolitres de ces solutions pures et mélangées sur la surface du prisme à l’aide d’un observateur sans contact en quadruple duplicata pour chaque rapport avec 44 points au total, placez le prisme à l’intérieur d’une boîte de Pétri contenant un millilitre d’eau ultra pure et laissez-le toute la nuit à température ambiante pour l’auto-assemblage de BB un et BB deux sur la surface dorée ici. On suppose que la composition superficielle moyenne des monocouches auto-assemblées mélangées reflète la composition de la solution mixte de dépôt.Le lendemain, lavez soigneusement le prisme à l’eau ultrapure avant de le sécher sous un flux d’Argonne. Réglez l’incubateur dans lequel les appareils d’imagerie par plasma et résonance de surface sont placés à 25 degrés Celsius pour éviter les changements d’indice de réfraction induits par les variations de température lors de la détection des protéines. Insérez un prisme de rinçage non fonctionnalisé dans la cellule d’écoulement de polyéther éther cétone de 10 microlitres connectée à une pompe à seringue commandée par ordinateur, à un dessereur et à une vanne d’injection moyenne pression à six orifices.Remplissez le système d’écoulement avec un tampon fraîchement filtré et des tas de Degas. Retirez le prisme de rinçage et insérez le prisme contenant le réseau de récepteurs combinés à réaction croisée dans les tas de cellules d’écoulement à un débit de 100 microlitres par minute. À l’aide de la caméra CCD, éliminez toutes les bulles d’air présentes sur la surface du prisme en passant le tampon de fonctionnement.Définissez rapidement la zone d’étude de chaque point en dessinant un cercle de même diamètre pour la zone d’intérêt sur la base d’une image bien contrastée du réseau, et à l’aide d’un logiciel intégré dans le système d’imagerie par plasma et résonance de surface, les courbes de plasma trace, qui représentent les courbes de réflectivité en fonction de l’angle d’incidence pour tous les points. Choisissez l’angle de travail, c’est-à-dire la position à laquelle les courbes cinétiques seront enregistrées à la pente la plus élevée des courbes de réflectivité. Faites pivoter le miroir de balayage pour fixer l’angle de travail sélectionné pour les mesures cinétiques.Continuez à faire fonctionner des tas à travers le système d’écoulement jusqu’à ce que le signal de réflectivité pour tous les points soit stable et constant. Ensuite, à l’aide d’une seringue, injectez un millilitre de lectine d’arachide ou une solution HL dans la boucle d’échantillonnage de 500 microlitres avec la soupape d’injection en position de charge avec le débit réglé à 100 microlitres par minute, mettez la soupape d’injection en position d’injection. Démarrer les mesures cinétiques en suivant simultanément les variations de réflectivité en fonction du temps sur tous les points en fin d’injection de protéines.Rincez la matrice avec la mémoire tampon en cours d’exécution pendant huit minutes. Enfin, injectez un millilitre de 1 %MS pour régénérer le réseau. Répétez la même procédure pour les autres protéines après l’entrée de la solution protéique dans la cellule d’écoulement.La liaison moléculaire se produit et induit un décalage des courbes du plasma et une variation de la réflexivité. Le logiciel d’acquisition d’images convertit les valeurs d’intensité lumineuse mesurées en niveaux d’échelle de gris, ce qui donne des images SPR et génère la variation de la réflectivité en fonction du temps en grammes du capteur. Ensuite, utilisez un logiciel de calcul mathématique pour tracer la réflectivité à la fin de chaque injection de protéine en fonction du rapport entre les blocs de construction et générer un profil d’évolution continue 2D pour chaque échantillon.Enfin, ajoutez le rapport des blocs de construction dans les grammes du capteur pour générer un modèle de reconnaissance continue dépendant du temps appelé Un paysage d’évolution continue 3D pour chaque protéine pour sonder la capacité de la langue électronique pour l’analyse des protéines communes, trois protéines ont été utilisées, une myoglobine HL et un lysozyme pour chaque protéine. Un profil d’évolution continue 2D distinct a été généré par la languette électronique, comme illustré en 3D. Des paysages d’évolution continue ont également été générés pour une myoglobine HL et un lysozyme.La langue électronique est sensible aux caractéristiques de surface des protéines, telles que la distribution des résidus d’acides aminés hydrophobes, neutres et chargés. Les profils d’évolution continue des paysages obtenus peuvent être utilisés comme empreintes digitales pour une discrimination efficace des protéines et une identification prospective basée sur la reconnaissance de formes. En tentant cette approche, il est important de ne pas oublier de suivre les procédures expérimentales optimisées et standardisées afin d’assurer une bonne reproductibilité de la langue électronique.Ces procédures comprennent une surface propre et de bonne qualité du prisme, le choix de l’angle de travail pour l’imagerie par résonance plasma de surface et l’application d’une solution appropriée pour régénérer complètement le système en vue de sa réutilisation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire la langue électronique sur la base de l’approche COMBINATOR et de l’imagerie par résonance plasma SOFA pour l’analyse des protéines. Bonne chance pour vos expériences.

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Microfluidique digitale est une technique caractérisée par la manipulation de gouttelettes discrètes (~ nL - ml) sur un réseau d'électrodes par l'application de champs électriques. Il est bien adapté pour la réalisation rapide, séquentielle, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Ici, nous rapportons une plate-forme capable d'automatiser plusieurs étapes de traitement protéomique.

Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Cette vidéo présente un protocole d’immunodosage par électrophorèse capillaire pour détecter un biomarqueur protéique associé à la sclérose latérale amyotrophique (SLA) à partir de plaquettes sanguines humaines. La confirmation de la présence de la protéine biomarqueur de la SLA est obtenue par une séparation des protéines plaquettaires en fonction de la taille, suivie d’une détection chimiluminescente.

Un dosage immunologique par électrophorèse capillaire pour la détection de biomarqueurs protéiques

Un protocole rapide pour la digestion protéolytique avec un microréacteur tryptique à flux continu construit en interne et couplé à un spectromètre de masse à ionisation par électronébulisation (ESI) est présenté. La fabrication du microréacteur, le montage expérimental et le processus d’acquisition des données sont décrits.

Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

La focalisation isoélectrique capillaire est une technique de base d’anticorps, ultrasensible, haut débit, ce qui permet une caractérisation détaillée de protéines et leurs isoformes de très petits échantillons biologiques. Ce qui suit décrit un protocole pour la détection et la quantification des protéines spécifiques et leurs isoformes de manière automatisée et robotisée.

Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Le microfluidique numérique à base d’électrowetting est une technique qui utilise un changement de tension dans l’angle de contact apparent d’une gouttelette de volume de microlitre pour faciliter sa manipulation. La combinaison de ces perles magnétiques avec des perles magnétiques fonctionnalisées permet l’intégration de multiples opérations d’unité de laboratoire pour la préparation d’échantillons et l’identification d’agents pathogènes à l’aide d’analyses immunosorbent liées à l’enzyme...

Plateforme microfluidique numérique basée sur l’électrowetting pour l’analyse immunosorbent liée à l’enzyme automatisée

Un système d’analyse automatisée et rapide des glycanes sur les protéines a déjà été développé. Cet article présente le protocole d'« analyse glyco-qualitative », optimisé pour un large éventail d’utilisateurs, tels que ceux engagés dans l’analyse des structures glycanes dans les produits biopharmaceutiques et autres matériaux glycoconjugués.

Évaluation glyco-qualitative rapide de protéines recombinantes à l’aide d’un système entièrement automatisé

Dans le cadre de ces travaux, nous avons discuté du protocole de conception et de développement d’un dispositif POCT E-Eye-Enable pour détecter Fe, Cr, As et F dans des échantillons environnementaux, des échantillons biologiques, des aliments et des boissons. Près de 2000 échantillons ont été testés, et les résultats sont conformes à la technique de référence.

TD-DFT Technique avancée de détection E-Eye guidée pour la quantification sur site de Fe, Cr, F et As dans les échantillons environnementaux, biologiques et alimentaires

Découvrez la construction d'une langue électronique par approche combinatoire pour l'analyse de protéines. Cette méthode utilise l'imagerie par résonance de plasmons de surface pour générer des profils d'évolution continue en 3D et discriminer efficacement les protéines purifiées.

Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour l'analyse des protéines

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