ARN-Seq analyse de l'expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer les niveaux d’expression de tous les gènes et échantillons de moelle épinière embryonnaire de poulet électroporée. Ceci est accompli en examinant d’abord in ovo le côté droit des tubes neuraux embryonnaires précoces et en réincubant les embryons au stade souhaité. La deuxième étape de la procédure consiste à disséquer des moitiés de tube neural transfectées avec succès dans un environnement sans ARN et à procéder à la lyse le plus rapidement possible.

La troisième étape consiste à isoler l’ARN et à soumettre les échantillons à la préparation de banques et au séquençage à haut débit. La dernière étape consiste à traiter les ensembles de données pour supprimer les artefacts de séquençage. Associez les races au génome et attribuez des niveaux d’expression à chaque gène.

En fin de compte, les résultats peuvent montrer des gènes exprimés différemment en comparant les niveaux d’expression dans des conditions de contrôle et expérimentales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle dans le cadre d’un curage ganglionnaire. Les étapes sont difficiles à apprendre parce que nous devons être familiers avec la manipulation des embryons.

Pour cette démonstration, les embryons ont été transformés avec la construction d’expression de la GFP au niveau du tube neural. Préparez-vous à passer deux heures à travailler sur un maximum de 10 embryons pour recueillir un à deux microgrammes d’ARN total par embryon. Dans des conditions libres, récoltez les embryons à l’aide de ciseaux de dissection fins et d’une cuillère de collecte SVE pour transférer chaque embryon au froid.

Traité DEPC. PBS a utilisé une solution pour toutes les étapes d’isolement du tube neural, procédez à l’aide d’une pince à épiler fine pour retirer toute la région du flanc d’un embryon entre les bourgeons des membres. Déplacez cette section dans une solution fraîche et froide avec le côté dorsal du tissu vers le haut.

À l’aide de deux fines aiguilles de verre, perforez trois points sur chaque côté latéral dorsal de l’embryon, entre le tube neural et le mésoderme paradial. Introduisez maintenant les deux aiguilles de verre dans la perforation centrale et écartez-les le long de l’axe AP. Faites-le à travers chaque perforation si nécessaire pour finalement détacher le mésoderme paracal, retirer et jeter ce tissu.

Ensuite, tournez l’embryon sur le côté et introduisez les pointes de deux pinces à épiler entre le tube neural et le cordon ganglionnaire. Faites-les glisser le long de l’axe AP pour diviser les structures. Terminez de retirer les plus gros morceaux de tissu médier du tube neural en le fixant doucement avec une pince à épiler tout en épilant l’excès de mésoderme.

Transférez ensuite doucement le tube neural dans une solution fraîche et froide. À l’aide d’une pipette en verre munie d’une pompe manuelle, récupérez tous les tubes neuronaux nécessaires et conservez-les sur de la glace avant de continuer. Maintenant, divisez chacun des tubes neuraux en deux moitiés.

Insérez une pince à épiler à pointe pointue dans la lumière et déchirez la plaque de toit. Ensuite, utilisez la pince à épiler pour couper la plaque de sol et divisez le mouchoir en deux. À l’aide d’un microscope à dissection fluorescente, triez les moitiés électroporées des moitiés non électroporées.

Transférez les moitiés du tube neural triées dans un tube de 1,5 millilitre avec une solution fraîche. Agitez ces tubes pour faire descendre tous les tissus vers le bas. Ensuite, faites tourner les tubes à 100 GS pendant quelques secondes.

Ensuite, très soigneusement sous un éclairage vif, aspirez le snat. Si le tissu est aspiré, éjectez-le lentement et répétez l’essorage. Une fois que les moitiés du tube neural ont été débarrassées de la solution, ajoutez 70 microlitres par tube neural, la moitié du tampon de lyse dans le tube.

Retournez le tube et incubez-le à température ambiante pendant 15 minutes toutes les cinq minutes, agitez vigoureusement le tube et procédez à la collecte de l’ARN pour purifier l’ARN. Pour le séquençage, ayez au moins huit moitiés de tube neural par échantillon. D’autres collections de tubes neuraux de lyce stockés à moins 80 degrés Celsius peuvent être regroupées dans la collection. Commencez par les décongeler sur de la glace pendant 15 à 30 minutes, puis terminez la décongélation à température ambiante.

Une fois décongelés, agitez vigoureusement tous les échantillons et laissez-les reposer pendant cinq minutes. Ensuite, vortex à nouveau les échantillons et les centrifuger à 15 000 GS pendant une minute. Pour se débarrasser des matières insolubles, transférez le surnageant dans un nouveau tube et procédez à l’extraction.

À l’aide d’un kit d’isolement d’ARN, terminez le processus en éludant l’ARN à la plus grande concentration possible. Ce protocole nécessite un compte sur le site Web Galaxy pour garantir le quota d’espace nécessaire. Tout d’abord, FTP télécharge les fichiers FASTQ sur le site, à moins que les scores de qualité ne soient déjà encodés dans Shred plus 33.

Tout d’abord, préparez les ensembles de données téléchargés à l’aide de l’outil de toilettage FASTQ dans le menu NGS QC et manipulation. Sinon, sous attributs, remplacez le type de fichier par FASTQ sender. Ensuite, dans le menu Contrôle de la qualité NGS et manipulation, utilisez l’outil CQ RAPIDE pour analyser la qualité générale des ensembles de données.

Sélectionnez la tondeuse de qualité FASTQ dans le même menu pour éliminer les trois extrémités principales de mauvaise qualité. Un score de qualité de 20 ou plus doit être traité. Allez maintenant dans l’outil de clip sous le même menu.

Configurez cet outil pour ignorer les lectures avec moins de 45 paires de bases. Entrez la séquence de l’adaptateur. Désactivez l’option permettant d’ignorer les lectures avec des bases inconnues et choisissez la sortie pour inclure les séquences écrêtées et non écrêtées.

Poursuivez avec l’outil de découpage des séquences. Utilisez-le pour couper les premières bases de la lecture afin de supprimer le biais de séquence à cinq premiers qui est détecté par FAST qc. L’étape suivante consiste à télécharger et à décompresser le dernier assemblage du génome de poulet à partir du site génomique Illumina I.

Téléchargez ensuite le fichier de format plus rapide du génome entier et le fichier de format GTF d’annotation du gène dans l’historique Galaxy. Maintenant, mappez les lectures de chaque échantillon au génome en accédant au menu d’analyse N-G-S-R-N-A et en sélectionnant l’outil chapeau deux. Sélectionnez le fichier fasta téléchargé dans l’histoire de Galaxy comme génome de référence.

Ensuite, choisissez l’outil de boutons de manchette dans le même menu pour construire un transcriptome prédit. Pour chaque échantillon, choisissez le fichier GTF à utiliser comme guide d’annotation de référence. Sélectionnez Effectuer la correction de biais à l’aide du fichier FASTA pour les données de séquence et activez l’option Utiliser la correction en plusieurs lectures.

Fusionnez ensuite tous les transcriptomes d’assemblage à l’aide de l’outil de fusion de brassard. Avec cet outil, choisissez le fichier GTF pour l’annotation de référence et le fichier FASTA pour les données de séquence. Comparez maintenant les fichiers BAM générés par le chapeau haut de forme deux pour chaque échantillon à l’aide de l’outil TIFF du brassard toujours sous le menu d’analyse de l’ARN.

Dans le champ Transcriptions, sélectionnez le transcriptome de fusion généré par la fusion de brassard et activez les options. Utilisez la correction multi-lecture et effectuez la correction de biais à l’aide du fichier FASTA pour les données de séquence. L’étape suivante consiste à trier les tables différentielles À l’aide de la colonne Valeur Q, sélectionnez l’outil de tri dans le menu de filtrage et de tri.

Les séquences présentant une différence significative entre les conditions expérimentales auront les valeurs Q les plus faibles sur la colonne 13. Jetez maintenant un coup d’œil aux graphiques de couverture. Tout d’abord, convertissez les fichiers BAM en fichiers de graphique de lit à l’aide de l’outil de conversion sous le menu des outils de lit sous les options, désactivez le rapport des régions sans couverture et choisissez de traiter les entrées épissées comme des intervalles distincts.

Dimensionnez également la couverture en fonction d’un facteur qui normalise toutes les couvertures de l’expérience. Convertissez ensuite le fichier de graphique de lit résultant au format big wig à l’aide de l’outil dans le menu convertir les formats et téléchargez le fichier big wig en tant que piste personnalisée sur le serveur UCSE. Sur la page du navigateur de génome de l’USCS, utilisez l’assemblage de quatre GAL et les recherches de gènes pour une couverture visuelle des ensembles de données à l’aide des méthodes décrites : les tubes neuraux exprimant des vecteurs PS vides ont été récoltés pour leur ARN.

Cela a été fait en double et l’ARN résultant était de très haute qualité avec une valeur RIN optimale de 10 comme prévu. La comparaison globale des transcriptomes des témoins vectoriels vides dupliqués n’a montré aucune différence nette et le coefficient de corrélation de Pearson était de 99. De plus, il y a eu une nette augmentation du nombre de lectures associées à la séquence du gène scratch two dans un échantillon expérimental exprimant les domaines du doigt de zinc scratch two.

Ainsi, les méthodes étaient suffisamment sensibles pour détecter l’enrichissement prévu. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’isoler le tube neuronal embryonnaire et d’avoir une bonne compréhension de la façon de traiter et de comparer l’ensemble de données IC pour trouver des gènes exprimés de manière différentielle en suivant les étapes d’analyse du silicium dans la section quatre du protocole.