L’électroporation in utero est une technique importante pour l’étude des mécanismes moléculaires qui régissent la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules pendant le développement neural. L’électroporation permet l’injection rapide et ciblée de matériel génétique dans des cellules en utilisant des impulsions électriques pour créer des pores temporaires dans les membranes cellulaires. Bien que l’électroporation fût traditionnellement utilisée dans les études in vitro, les progrès scientifiques ont maintenant élargi son utilisation à des organes intacts, tels que ceux trouvés dans des embryons de souris en développement in utero.
Cette vidéo présente les principes clés derrière l’électroporation in utero en plus d’examiner les techniques chirurgicales de base nécessaires pour accéder à des embryons en développement au sein d’une rongeuse gravide. Les détails des étapes d’injection et d’électroporation sont fournis avec des considérations importantes pour la livraison de gènes dans des régions spécifiques du cerveau. Finalement, les applications neurobiologiques de l’électroporation in utero sont présentées, comme par exemple l’étude de comment des gènes spécifiques contribuent au développement neural et comment les connexions se forment entre les neurones en développement.
L’électroporation in utero est une technique clé pour étudier les mécanismes moléculaires qui régissent le développement neurologique. En injectant de l’ADN pour modifier l’expression génique dans des régions spécifiques du cerveau de rongeurs en développement, les chercheurs peuvent étudier la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules nerveuses dans leur environnement naturel. Cette vidéo présente les principes clés derrière l’électroporation in utero, une vue d’ensemble sur la façon de realiser cette technique et ses applications en neurobiologie.
Avant de nous plonger dans la façon d’effectuer cette procédure, passons d’abord en revue certains principes relatifs a électroporation. Ce procédé utilise des impulsions électriques qui créent des trous temporaires dans les membranes cellulaires, ce qui permet à l’ADN d’entrer dans la cellule. Étant donné que l’ADN chargé négativement se déplace vers l’électrode positive, différentes populations de cellules peuvent être ciblées en changeant la position du champ électrique. Bien que l’électroporation fût traditionnellement utilisée in vitro, les progrès scientifiques permettent maintenant son utilisation sur des organes, y compris ceux trouvés dans les embryons de souris en développement in utero.
L’électroporation in utero, contrairement à la culture cellulaire et aux techniques ex vivo, permet que suite à la transfection, les cellules continuent à être exposées à tous les signaux physiologiques qui guident le développement normal. Ceci est particulièrement important dans le cerveau, où différentes structures, telles que les axones, se développent grâce à des signaux de guidage en provenance d’autres types de cellules. Le développement du cerveau en particulier implique une série programmée d’évènements de prolifération et de migration, ce qui signifie que différentes couches de tissus peuvent être ciblées en fonction du timing précis de l’électroporation.
Enfin, l’existence de différents types d’électrodes permet aux chercheurs d’accéder aux régions superficielles du cerveau, ainsi qu’à des zones plus profondes. Des électrodes en forme de pagaie sont utilisées lors du ciblage de parties superficielles du cerveau, telles que le cortex et l’hippocampe, tandis que les petites électrodes en forme d’aiguille sont utilisées pour cibler des structures profondes comme le thalamus et de l’hypothalamus.
Maintenant que nous avons discuté de certains principes de base de la technique, parlons des préparatifs nécessaires pour la procédure chirurgicale et l’électroporation in utero.
Tout d’abord, stérilisez les instruments et nettoyez la surface chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, préparez la solution d’injection en dissolvant l’ADN plasmique dans une solution PBS stérile contenant 0,1% de vert solide. Le colorant alimentaire vert solide est ajouté pour visualiser la solution lors de l’injection dans l’embryon. Enfin, pour réduire la perte de liquide amniotique et ainsi éviter la mort du fœtus, une micropipette ultra mince doit être créée à l’aide d’une étireuse de pipette.
Maintenant que nous avons tout préparé, passons en revue les étapes de base pour l’électroporation du tissu cérébral chez les rongeurs en développement. Pour commencer, une femelle enceinte est anesthésiée en utilisant 5% d’isoflurane puis 2,25% d’isoflurane est administré via un respirateur pour le reste de la procédure. Ensuite, pour soulager de la douleur post-opératoire, injectez en sous-cutané un analgésique, comme la buprénorphine. Ensuite l’abdomen est rasé et stérilisé à l’endroit de l’incision.
Pour exposer l’utérus, faites une incision verticale le long de la ligne médiane dans la peau et, en utilisant des ciseaux, coupez à travers le péritoine. Afin d’éviter leur assèchement, les embryons sont recouvert d’une gaze imbibée de solution saline stérile. Ensuite, tirez doucement la chaîne embryonnaire hors de la cavité abdominale en prenant soin de garder les embryons humides en couvrant avec une solution saline stérile préchauffée.
En utilisant un microscope de dissection, identifiez les embryons correctement positionnés afin de faciliter l’accès au cerveau. Avec vos doigts ou des pinces, maintenez la tête de l’embryon et injectez la solution d’ADN dans le cerveau en passant à travers la paroi de l’utérus. Placez une électrode sur chaque côté de la tête, avec l’électrode positive dans la direction vers laquelle vous voulez que l’ADN se déplace. Une fois que tous les embryons positionnés de manière appropriée sont électroporés, replacez soigneusement la corne utérine dans la cavité abdominale.
Avant de refermer l’incision, ajoutez 2 à 3ml de solution saline stérile chauffée dans la cavité. Suturez le péritoine avec du fil résorbable, puis fermez la peau à l’aide d’agrafes. Enfin, transférez la souris dans une cage avec une plateforme chauffante et surveillez l’animal.
Maintenant que nous avons passé en revue comment effectuer une électroporation in utero, regardons quelques utilisations de cette technique.
L’électroporation in utero est une méthode utile pour étudier la façon dont des gènes spécifiques contribuent au développement neural. Des structures électroporées peuvent permettre la surexpression d’une protéine normale ou mutante, ou encore le blocage complet de l’expression d’une protéine. Les phénotypes neurologiques peuvent ensuite être observés soit au niveau microscopique, soit au niveau de l’organisme. Par exemple, ces chercheurs ont déterminé que la surexpression transitoire du gène DISC-1, associé à la schizophrénie dans le cerveau de souris en développement, donne plus tard lieu à une hypersensibilité à l’amphétamine.
L’électroporation in utero peut aussi être utile pour visualiser des populations de cellules spécifiques et les connections qu’elles font par la livraison de séquences codant les protéines fluorescentes dans les tissus neuraux. Par exemple, ces chercheurs électroporent le gène de la protéine fluorescente verte dans des rétines E13,5 pour étudier les cellules ganglionnaires de la rétine, ou CGRs, qui transmettent l’information visuelle de l’œil au cerveau. L’examen de la rétine au stade embryonnaire 18,5 montre comment cette technique peut être utilisée pour décrire le chemin emprunté par l’axone de CGR dans le nerf optique, le chiasma optique et le tractus optique.
Enfin, de nombreux évènements importants dans le développement neural surviennent après la naissance, ce qui a inspiré les scientifiques à développer une technique modifiée appelée électroporation in vivo. Cette procédure comporte les mêmes étapes que électroporation in utero, mais elle est généralement effectuée dans les premiers jours suivant la naissance. La manipulation génétique postnatale est particulièrement utile pour étudier les types de cellules nées plus tard, tels que celles trouvées dans le bulbe olfactif montré ici.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’électroporation in utero. Cette vidéo couvre les principes clés et une vue d’ensemble sur comment réaliser l’électroporation in utero, ainsi que quelques utilisations qui permettent aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent le développement neuronal. Merci de nous avoir regardés!
In utero electroporation is a key technique for studying the molecular mechanisms that guide neurodevelopment. By injecting DNA to alter gene expression in specific regions of the developing rodent brain, researchers can study the proliferation, differentiation, migration, and maturation of neural cells in the context of their natural environment.
This video will introduce the key principles behind in utero electroporation, a basic overview on how to perform the technique, and its applications in neurobiology research.
Before we delve into how to perform this procedure, lets first go over some principles of electroporation. This procedure utilizes electrical pulses that create transient pores in cell membranes, allowing DNA to enter the cell. Since the negatively charged DNA will move towards the positive electrode, different cell populations can be targeted depending on the positioning of the electric field.
Though electroporation has traditionally been used in in vitro studies, scientific advancements have broadened its utilization to intact organs, including those found in mouse embryos developing in utero.
In utero electroporation, unlike cell culture or ex vivo techniques, has the advantage that transfected cells will continue to be exposed to all the physiological cues that guide normal development. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types in order to develop properly.
Brain development in particular involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning that different tissue layers can be targeted based on the timing of electroporation.
Lastly, the availability of different types of electrodes allows researchers to access both regions near the surface of the brain as well as deeper areas. Paddle electrodes are used when targeting superficial parts of the brain, such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes are used when targeting deep structures like the thalamus and hypothalamus.
Now that we have discussed some basic principles behind the technique, lets get our preparations out of the way so we can delve into the surgical procedure and in utero electroporation.
First, sterilize all instruments and wipe down the surgical area with 70% ethanol. Next, make an injection solution by dissolving plasmid DNA in sterile PBS containing 0.1% Fast Green. The Fast Green is added to allow for visualization of injection solution in the embryo. Lastly, using a needle puller, an ultra thin needle must be created to reduce the loss of amniotic fluid and subsequent fetal mortality.
Now that we have everything prepared, lets go over the basic steps for electroporating brain tissue in developing rodents. Start by anesthetizing a pregnant dam using 5% isoflurane then transferring it to a respirator tube delivering 2.25% isoflurane for the entirety of the procedure. Next, for postoperative pain relief, deliver an analgesic like buprenorphine subcutaneously. Then shave the abdomen and sterilize the incision site.
To surgically expose the uterus, make a vertical incision along the midline in the skin and, using scissors, cut through the peritoneum. To prevent the embryos from drying out, cover the opening with sterile saline soaked gauze. Next, gently pull the embryonic chain out of the abdominal cavity being sure to keep the embryos wet by covering with sterile pre-warmed saline.
Using a dissection microscope, identify embryos properly positioned for easy access to the brain. Using your fingers or forceps stabilize the head of the embryo and inject the DNA solution through the uterine wall and into the brain. Place an electrode on each side of the head, with the positive electrode in the direction to which you want the DNA electroporated. Once all appropriately positioned embryos are electroporated, carefully place the uterine horn back into the abdominal cavity.
Before closing the incision, add 2 – 3 ml of warm saline to the cavity. Sew the peritoneum together with absorbable sutures, then close the skin using staples. Lastly, transfer the mouse to a cage with a heating pad and monitor.
Now that we have gone over how to perform in utero electroporation, lets examine some downstream applications of this technique.
In utero electroporation is a useful tool for investigating how specific genes contribute to neural development. Electroporated constructs can guide overexpression of wildtype or mutant proteins or block protein expression completely. Neurological phenotypes can then be assessed at either the microscopic or organismal level. For example, these experimenters determined that transient overexpression of the schizophrenia-associated gene, DISC-1 in the developing mouse brain, resulted in hypersensitivity to amphetamine later in life.
In utero electroporation can also be useful for visualizing specific cell populations and the connections they make by delivering sequences encoding fluorescent proteins into neural tissue. For example, these experimenters electroporated the green fluorescent protein gene into E13.5 retinas to study retinal ganglion cells, or RGCs, which transmit visual information from the eye to the brain. Examination of retinas at E18.5 shows how this technique can be used to trace the path of the RGC axon through the optic nerve, optic chiasm, and optic tract.
Finally, many important events in neural development occur after birth, inspiring scientists to develop a modified technique called in vivo electroporation. This procedure follows the same basic steps as in utero electroporation, but it is usually performed within the first few days following birth. Postnatal genetic manipulation is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb shown here.
You’ve just watched JoVE’s video on in utero electroporation. This video contained key principles and a basic overview on how to perform in utero electroporation, as well as a few downstream applications that allow researchers to investigate the molecular mechanisms that guide neurodevelopment.
Thanks for watching!
