Électroporation murine in utero
L’électroporation in utero est une technique importante pour l'étude des mécanismes moléculaires qui régissent la prolifération, la différenciation, l…
L’électroporation in utero est une technique clé pour étudier les mécanismes moléculaires qui régissent le développement neurologique. En injectant de l'ADN pour modifier l'expression génique dans des régions spécifiques du cerveau de rongeurs en développement, les chercheurs peuvent étudier la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules nerveuses dans leur environnement naturel. Cette vidéo présente les principes clés derrière l’électroporation in utero, une vue d'ensemble sur la façon de realiser cette technique et ses applications en neurobiologie.
Avant de nous plonger dans la façon d'effectuer cette procédure, passons d'abord en revue certains principes relatifs a électroporation. Ce procédé utilise des impulsions électriques qui créent des trous temporaires dans les membranes cellulaires, ce qui permet à l’ADN d'entrer dans la cellule. Étant donné que l'ADN chargé négativement se déplace vers l'électrode positive, différentes populations de cellules peuvent être ciblées en changeant la position du champ électrique. Bien que l'électroporation fût traditionnellement utilisée in vitro, les progrès scientifiques permettent maintenant son utilisation sur des organes, y compris ceux trouvés dans les embryons de souris en développement in utero.
L’électroporation in utero, contrairement à la culture cellulaire et aux techniques ex vivo, permet que suite à la transfection, les cellules continuent à être exposées à tous les signaux physiologiques qui guident le développement normal. Ceci est particulièrement important dans le cerveau, où différentes structures, telles que les axones, se développent grâce à des signaux de guidage en provenance d'autres types de cellules. Le développement du cerveau en particulier implique une série programmée d'évènements de prolifération et de migration, ce qui signifie que différentes couches de tissus peuvent être ciblées en fonction du timing précis de l’électroporation.
Enfin, l'existence de différents types d'électrodes permet aux chercheurs d'accéder aux régions superficielles du cerveau, ainsi qu’à des zones plus profondes. Des électrodes en forme de pagaie sont utilisées lors du ciblage de parties superficielles du cerveau, telles que le cortex et l'hippocampe, tandis que les petites électrodes en forme d’aiguille sont utilisées pour cibler des structures profondes comme le thalamus et de l'hypothalamus.
Maintenant que nous avons discuté de certains principes de base de la technique, parlons des préparatifs nécessaires pour la procédure chirurgicale et l’électroporation in utero.
Tout d'abord, stérilisez les instruments et nettoyez la surface chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, préparez la solution d’injection en dissolvant l’ADN plasmique dans une solution PBS stérile contenant 0,1% de vert solide. Le colorant alimentaire vert solide est ajouté pour visualiser la solution lors de l'injection dans l'embryon. Enfin, pour réduire la perte de liquide amniotique et ainsi éviter la mort du fœtus, une micropipette ultra mince doit être créée à l'aide d’une étireuse de pipette.
Maintenant que nous avons tout préparé, passons en revue les étapes de base pour l'électroporation du tissu cérébral chez les rongeurs en développement. Pour commencer, une femelle enceinte est anesthésiée en utilisant 5% d'isoflurane puis 2,25% d’isoflurane est administré via un respirateur pour le reste de la procédure. Ensuite, pour soulager de la douleur post-opératoire, injectez en sous-cutané un analgésique, comme la buprénorphine. Ensuite l’abdomen est rasé et stérilisé à l’endroit de l'incision.
Pour exposer l’utérus, faites une incision verticale le long de la ligne médiane dans la peau et, en utilisant des ciseaux, coupez à travers le péritoine. Afin d’éviter leur assèchement, les embryons sont recouvert d’une gaze imbibée de solution saline stérile. Ensuite, tirez doucement la chaîne embryonnaire hors de la cavité abdominale en prenant soin de garder les embryons humides en couvrant avec une solution saline stérile préchauffée.
En utilisant un microscope de dissection, identifiez les embryons correctement positionnés afin de faciliter l'accès au cerveau. Avec vos doigts ou des pinces, maintenez la tête de l'embryon et injectez la solution d'ADN dans le cerveau en passant à travers la paroi de l'utérus. Placez une électrode sur chaque côté de la tête, avec l'électrode positive dans la direction vers laquelle vous voulez que l'ADN se déplace. Une fois que tous les embryons positionnés de manière appropriée sont électroporés, replacez soigneusement la corne utérine dans la cavité abdominale.
Avant de refermer l'incision, ajoutez 2 à 3ml de solution saline stérile chauffée dans la cavité. Suturez le péritoine avec du fil résorbable, puis fermez la peau à l'aide d'agrafes. Enfin, transférez la souris dans une cage avec une plateforme chauffante et surveillez l’animal.
Maintenant que nous avons passé en revue comment effectuer une électroporation in utero, regardons quelques utilisations de cette technique.
L’électroporation in utero est une méthode utile pour étudier la façon dont des gènes spécifiques contribuent au développement neural. Des structures électroporées peuvent permettre la surexpression d’une protéine normale ou mutante, ou encore le blocage complet de l’expression d’une protéine. Les phénotypes neurologiques peuvent ensuite être observés soit au niveau microscopique, soit au niveau de l’organisme. Par exemple, ces chercheurs ont déterminé que la surexpression transitoire du gène DISC-1, associé à la schizophrénie dans le cerveau de souris en développement, donne plus tard lieu à une hypersensibilité à l'amphétamine.
L’électroporation in utero peut aussi être utile pour visualiser des populations de cellules spécifiques et les connections qu’elles font par la livraison de séquences codant les protéines fluorescentes dans les tissus neuraux. Par exemple, ces chercheurs électroporent le gène de la protéine fluorescente verte dans des rétines E13,5 pour étudier les cellules ganglionnaires de la rétine, ou CGRs, qui transmettent l’information visuelle de l’œil au cerveau. L'examen de la rétine au stade embryonnaire 18,5 montre comment cette technique peut être utilisée pour décrire le chemin emprunté par l’axone de CGR dans le nerf optique, le chiasma optique et le tractus optique.
Enfin, de nombreux évènements importants dans le développement neural surviennent après la naissance, ce qui a inspiré les scientifiques à développer une technique modifiée appelée électroporation in vivo. Cette procédure comporte les mêmes étapes que électroporation in utero, mais elle est généralement effectuée dans les premiers jours suivant la naissance. La manipulation génétique postnatale est particulièrement utile pour étudier les types de cellules nées plus tard, tels que celles trouvées dans le bulbe olfactif montré ici.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’électroporation in utero. Cette vidéo couvre les principes clés et une vue d’ensemble sur comment réaliser l’électroporation in utero, ainsi que quelques utilisations qui permettent aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent le développement neuronal. Merci de nous avoir regardés!
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L’électroporation in utero est une technique clé pour étudier les mécanismes moléculaires qui régissent le développement neurologique. En injectant de l'ADN pour modifier l'expression génique dans des régions spécifiques du cerveau de rongeurs en développement, les chercheurs peuvent étudier la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules nerveuses dans leur environnement naturel. Cette vidéo présente les principes clés derrière l’électroporation in utero, une vue d'ensemble sur la façon de realiser cette technique et ses applications en neurobiologie.
Avant de nous plonger dans la façon d'effectuer cette procédure, passons d'abord en revue certains principes relatifs a électroporation. Ce procédé utilise des impulsions électriques qui créent des trous temporaires dans les membranes cellulaires, ce qui permet à l’ADN d'entrer dans la cellule. Étant donné que l'ADN chargé négativement se déplace vers l'électrode positive, différentes populations de cellules peuvent être ciblées en changeant la position du champ électrique. Bien que l'électroporation fût traditionnellement utilisée in vitro, les progrès scientifiques permettent maintenant son utilisation sur des organes, y compris ceux trouvés dans les embryons de souris en développement in utero.
L’électroporation in utero, contrairement à la culture cellulaire et aux techniques ex vivo, permet que suite à la transfection, les cellules continuent à être exposées à tous les signaux physiologiques qui guident le développement normal. Ceci est particulièrement important dans le cerveau, où différentes structures, telles que les axones, se développent grâce à des signaux de guidage en provenance d'autres types de cellules. Le développement du cerveau en particulier implique une série programmée d'évènements de prolifération et de migration, ce qui signifie que différentes couches de tissus peuvent être ciblées en fonction du timing précis de l’électroporation.
Enfin, l'existence de différents types d'électrodes permet aux chercheurs d'accéder aux régions superficielles du cerveau, ainsi qu’à des zones plus profondes. Des électrodes en forme de pagaie sont utilisées lors du ciblage de parties superficielles du cerveau, telles que le cortex et l'hippocampe, tandis que les petites électrodes en forme d’aiguille sont utilisées pour cibler des structures profondes comme le thalamus et de l'hypothalamus.
Maintenant que nous avons discuté de certains principes de base de la technique, parlons des préparatifs nécessaires pour la procédure chirurgicale et l’électroporation in utero.
Tout d'abord, stérilisez les instruments et nettoyez la surface chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, préparez la solution d’injection en dissolvant l’ADN plasmique dans une solution PBS stérile contenant 0,1% de vert solide. Le colorant alimentaire vert solide est ajouté pour visualiser la solution lors de l'injection dans l'embryon. Enfin, pour réduire la perte de liquide amniotique et ainsi éviter la mort du fœtus, une micropipette ultra mince doit être créée à l'aide d’une étireuse de pipette.
Maintenant que nous avons tout préparé, passons en revue les étapes de base pour l'électroporation du tissu cérébral chez les rongeurs en développement. Pour commencer, une femelle enceinte est anesthésiée en utilisant 5% d'isoflurane puis 2,25% d’isoflurane est administré via un respirateur pour le reste de la procédure. Ensuite, pour soulager de la douleur post-opératoire, injectez en sous-cutané un analgésique, comme la buprénorphine. Ensuite l’abdomen est rasé et stérilisé à l’endroit de l'incision.
Pour exposer l’utérus, faites une incision verticale le long de la ligne médiane dans la peau et, en utilisant des ciseaux, coupez à travers le péritoine. Afin d’éviter leur assèchement, les embryons sont recouvert d’une gaze imbibée de solution saline stérile. Ensuite, tirez doucement la chaîne embryonnaire hors de la cavité abdominale en prenant soin de garder les embryons humides en couvrant avec une solution saline stérile préchauffée.
En utilisant un microscope de dissection, identifiez les embryons correctement positionnés afin de faciliter l'accès au cerveau. Avec vos doigts ou des pinces, maintenez la tête de l'embryon et injectez la solution d'ADN dans le cerveau en passant à travers la paroi de l'utérus. Placez une électrode sur chaque côté de la tête, avec l'électrode positive dans la direction vers laquelle vous voulez que l'ADN se déplace. Une fois que tous les embryons positionnés de manière appropriée sont électroporés, replacez soigneusement la corne utérine dans la cavité abdominale.
Avant de refermer l'incision, ajoutez 2 à 3ml de solution saline stérile chauffée dans la cavité. Suturez le péritoine avec du fil résorbable, puis fermez la peau à l'aide d'agrafes. Enfin, transférez la souris dans une cage avec une plateforme chauffante et surveillez l’animal.
Maintenant que nous avons passé en revue comment effectuer une électroporation in utero, regardons quelques utilisations de cette technique.
L’électroporation in utero est une méthode utile pour étudier la façon dont des gènes spécifiques contribuent au développement neural. Des structures électroporées peuvent permettre la surexpression d’une protéine normale ou mutante, ou encore le blocage complet de l’expression d’une protéine. Les phénotypes neurologiques peuvent ensuite être observés soit au niveau microscopique, soit au niveau de l’organisme. Par exemple, ces chercheurs ont déterminé que la surexpression transitoire du gène DISC-1, associé à la schizophrénie dans le cerveau de souris en développement, donne plus tard lieu à une hypersensibilité à l'amphétamine.
L’électroporation in utero peut aussi être utile pour visualiser des populations de cellules spécifiques et les connections qu’elles font par la livraison de séquences codant les protéines fluorescentes dans les tissus neuraux. Par exemple, ces chercheurs électroporent le gène de la protéine fluorescente verte dans des rétines E13,5 pour étudier les cellules ganglionnaires de la rétine, ou CGRs, qui transmettent l’information visuelle de l’œil au cerveau. L'examen de la rétine au stade embryonnaire 18,5 montre comment cette technique peut être utilisée pour décrire le chemin emprunté par l’axone de CGR dans le nerf optique, le chiasma optique et le tractus optique.
Enfin, de nombreux évènements importants dans le développement neural surviennent après la naissance, ce qui a inspiré les scientifiques à développer une technique modifiée appelée électroporation in vivo. Cette procédure comporte les mêmes étapes que électroporation in utero, mais elle est généralement effectuée dans les premiers jours suivant la naissance. La manipulation génétique postnatale est particulièrement utile pour étudier les types de cellules nées plus tard, tels que celles trouvées dans le bulbe olfactif montré ici.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’électroporation in utero. Cette vidéo couvre les principes clés et une vue d’ensemble sur comment réaliser l’électroporation in utero, ainsi que quelques utilisations qui permettent aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent le développement neuronal. Merci de nous avoir regardés!
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Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.