1.14: Électroporation murine in utero

L’électroporation in utero est une technique clé pour étudier les mécanismes moléculaires qui guident le développement neurologique. En injectant de l’ADN pour modifier l’expression des gènes dans des régions spécifiques du cerveau des rongeurs en développement, les chercheurs peuvent étudier la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules neurales dans le contexte de leur environnement naturel.

Cette vidéo présentera les principes clés de l’électroporation in utero, un aperçu de base de la mise en œuvre de la technique et ses applications dans la recherche en neurobiologie.

Avant d’approfondir la procédure de cette procédure, passons d’abord en revue certains principes de l’électroporation. Cette procédure utilise des impulsions électriques qui créent des pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant à l’ADN de pénétrer dans la cellule. Étant donné que l’ADN chargé négativement se déplacera vers l’électrode positive, différentes populations cellulaires peuvent être ciblées en fonction du positionnement du champ électrique.

Bien que l’électroporation ait traditionnellement été utilisée dans les études in vitro, les progrès scientifiques ont élargi son utilisation aux organes intacts, y compris ceux trouvés dans les embryons de souris se développant in utero.

L’électroporation in utero, contrairement à la culture cellulaire ou aux techniques ex vivo, présente l’avantage que les cellules transfectées continueront d’être exposées à tous les signaux physiologiques qui guident le développement normal. Ceci est particulièrement important dans le cerveau, où des structures telles que les axones nécessitent des signaux guidés d’autres types de cellules pour se développer correctement.

Le développement du cerveau, en particulier, implique une série programmée d’événements de prolifération et de migration, ce qui signifie que différentes couches de tissus peuvent être ciblées en fonction du moment de l’électroporation.

Enfin, la disponibilité de différents types d’électrodes permet aux chercheurs d’accéder à la fois aux régions proches de la surface du cerveau et aux zones plus profondes. Les électrodes à palette sont utilisées pour cibler les parties superficielles du cerveau, telles que le cortex et l’hippocampe, tandis que les électrodes à aiguille plus petites sont utilisées pour cibler des structures profondes comme le thalamus et l’hypothalamus.

Maintenant que nous avons discuté de certains principes de base de la technique, laissons de côté nos préparatifs afin de pouvoir nous plonger dans la procédure chirurgicale et l’électroporation in utero.

Tout d’abord, stérilisez tous les instruments et essuyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, préparez une solution injectable en dissolvant l’ADN plasmidique dans du PBS stérile contenant 0,1 % de Fast Green. Le Fast Green est ajouté pour permettre la visualisation de la solution d’injection dans l’embryon. Enfin, à l’aide d’un extracteur d’aiguille, une aiguille ultra fine doit être créée pour réduire la perte de liquide amniotique et la mortalité fœtale subséquente.

Maintenant que tout est prêt, passons en revue les étapes de base de l’électroporation du tissu cérébral chez les rongeurs en développement. Commencez par anesthésier une mère enceinte à l’aide d’isoflurane à 5 %, puis transférez-la dans un tube de respirateur délivrant 2,25 % d’isoflurane pendant toute la durée de la procédure. Ensuite, pour soulager la douleur postopératoire, administrez un analgésique comme la buprénorphine par voie sous-cutanée. Ensuite, rasez l’abdomen et stérilisez le site d’incision.

Pour exposer chirurgicalement l’utérus, faites une incision verticale le long de la ligne médiane de la peau et, à l’aide de ciseaux, coupez à travers le péritoine. Pour éviter que les embryons ne se dessèchent, couvrez l’ouverture avec de la gaze stérile imbibée de solution saline. Ensuite, retirez doucement la chaîne embryonnaire de la cavité abdominale en veillant à garder les embryons humides en les recouvrant d’une solution saline stérile préchauffée.

À l’aide d’un microscope de dissection, identifiez les embryons correctement positionnés pour un accès facile au cerveau. À l’aide de vos doigts ou de vos pinces, stabilisez la tête de l’embryon et injectez la solution d’ADN à travers la paroi utérine et dans le cerveau. Placez une électrode de chaque côté de la tête, avec l’électrode positive dans la direction dans laquelle vous souhaitez électroporer l’ADN. Une fois que tous les embryons correctement positionnés sont électroporés, replacez soigneusement la corne utérine dans la cavité abdominale.

Avant de fermer l’incision, ajoutez 2 à 3 ml de solution saline tiède dans la cavité. Cousez le péritoine avec des sutures résorbables, puis fermez la peau à l’aide d’agrafes. Enfin, transférez la souris dans une cage avec un coussin chauffant et un moniteur.

Maintenant que nous avons vu comment effectuer l’électroporation in utero, examinons quelques applications en aval de cette technique.

L’électroporation in utero est un outil utile pour étudier comment des gènes spécifiques contribuent au développement neuronal. Les constructions électroporatives peuvent guider la surexpression de protéines de type sauvage ou mutantes ou bloquer complètement l’expression des protéines. Les phénotypes neurologiques peuvent ensuite être évalués au niveau microscopique ou au niveau de l’organisme. Par exemple, ces expérimentateurs ont déterminé que la surexpression transitoire du gène associé à la schizophrénie, DISC-1, dans le cerveau de souris en développement, entraînait une hypersensibilité aux amphétamines plus tard dans la vie.

L’électroporation in utero peut également être utile pour visualiser des populations cellulaires spécifiques et les connexions qu’elles établissent en délivrant des séquences codant pour des protéines fluorescentes dans le tissu neural. Par exemple, ces expérimentateurs ont électroporé le gène de la protéine fluorescente verte dans les rétines E13.5 pour étudier les cellules ganglionnaires rétiniennes, ou RGC, qui transmettent des informations visuelles de l’œil au cerveau. L’examen des rétines à E18.5 montre comment cette technique peut être utilisée pour tracer le chemin de l’axone RGC à travers le nerf optique, le chiasma optique et le tractus optique.

Enfin, de nombreux événements importants dans le développement neuronal se produisent après la naissance, ce qui a inspiré les scientifiques à développer une technique modifiée appelée électroporation in vivo. Cette procédure suit les mêmes étapes de base que l’électroporation in utero, mais elle est généralement effectuée dans les premiers jours suivant la naissance. La manipulation génétique postnatale est particulièrement utile pour étudier les types de cellules nées plus tard, telles que celles trouvées dans le bulbe olfactif montré ici.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’électroporation in utero. Cette vidéo contenait des principes clés et un aperçu de base sur la façon d’effectuer l’électroporation in utero, ainsi que quelques applications en aval qui permettent aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui guident le neurodéveloppement.

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