Électroporation murine in utero

L’électroporation in utero est une technique clé pour étudier les mécanismes moléculaires qui régissent le développement neurologique. En injectant de l'ADN pour modifier l'expression génique dans des régions spécifiques du cerveau de rongeurs en développement, les chercheurs peuvent étudier la prolifération, la différenciation, la migration et la maturation des cellules nerveuses dans leur environnement naturel. Cette vidéo présente les principes clés derrière l’électroporation in utero, une vue d'ensemble sur la façon de realiser cette technique et ses applications en neurobiologie.

Avant de nous plonger dans la façon d'effectuer cette procédure, passons d'abord en revue certains principes relatifs a électroporation. Ce procédé utilise des impulsions électriques qui créent des trous temporaires dans les membranes cellulaires, ce qui permet à l’ADN d'entrer dans la cellule. Étant donné que l'ADN chargé négativement se déplace vers l'électrode positive, différentes populations de cellules peuvent être ciblées en changeant la position du champ électrique. Bien que l'électroporation fût traditionnellement utilisée in vitro, les progrès scientifiques permettent maintenant son utilisation sur des organes, y compris ceux trouvés dans les embryons de souris en développement in utero.

L’électroporation in utero, contrairement à la culture cellulaire et aux techniques ex vivo, permet que suite à la transfection, les cellules continuent à être exposées à tous les signaux physiologiques qui guident le développement normal. Ceci est particulièrement important dans le cerveau, où différentes structures, telles que les axones, se développent grâce à des signaux de guidage en provenance d'autres types de cellules. Le développement du cerveau en particulier implique une série programmée d'évènements de prolifération et de migration, ce qui signifie que différentes couches de tissus peuvent être ciblées en fonction du timing précis de l’électroporation.

Enfin, l'existence de différents types d'électrodes permet aux chercheurs d'accéder aux régions superficielles du cerveau, ainsi qu’à des zones plus profondes. Des électrodes en forme de pagaie sont utilisées lors du ciblage de parties superficielles du cerveau, telles que le cortex et l'hippocampe, tandis que les petites électrodes en forme d’aiguille sont utilisées pour cibler des structures profondes comme le thalamus et de l'hypothalamus.

Maintenant que nous avons discuté de certains principes de base de la technique, parlons des préparatifs nécessaires pour la procédure chirurgicale et l’électroporation in utero.

Tout d'abord, stérilisez les instruments et nettoyez la surface chirurgicale avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, préparez la solution d’injection en dissolvant l’ADN plasmique dans une solution PBS stérile contenant 0,1% de vert solide. Le colorant alimentaire vert solide est ajouté pour visualiser la solution lors de l'injection dans l'embryon. Enfin, pour réduire la perte de liquide amniotique et ainsi éviter la mort du fœtus, une micropipette ultra mince doit être créée à l'aide d’une étireuse de pipette.

Maintenant que nous avons tout préparé, passons en revue les étapes de base pour l'électroporation du tissu cérébral chez les rongeurs en développement. Pour commencer, une femelle enceinte est anesthésiée en utilisant 5% d'isoflurane puis 2,25% d’isoflurane est administré via un respirateur pour le reste de la procédure. Ensuite, pour soulager de la douleur post-opératoire, injectez en sous-cutané un analgésique, comme la buprénorphine. Ensuite l’abdomen est rasé et stérilisé à l’endroit de l'incision.

Pour exposer l’utérus, faites une incision verticale le long de la ligne médiane dans la peau et, en utilisant des ciseaux, coupez à travers le péritoine. Afin d’éviter leur assèchement, les embryons sont recouvert d’une gaze imbibée de solution saline stérile. Ensuite, tirez doucement la chaîne embryonnaire hors de la cavité abdominale en prenant soin de garder les embryons humides en couvrant avec une solution saline stérile préchauffée.

En utilisant un microscope de dissection, identifiez les embryons correctement positionnés afin de faciliter l'accès au cerveau. Avec vos doigts ou des pinces, maintenez la tête de l'embryon et injectez la solution d'ADN dans le cerveau en passant à travers la paroi de l'utérus. Placez une électrode sur chaque côté de la tête, avec l'électrode positive dans la direction vers laquelle vous voulez que l'ADN se déplace. Une fois que tous les embryons positionnés de manière appropriée sont électroporés, replacez soigneusement la corne utérine dans la cavité abdominale.

Avant de refermer l'incision, ajoutez 2 à 3ml de solution saline stérile chauffée dans la cavité. Suturez le péritoine avec du fil résorbable, puis fermez la peau à l'aide d'agrafes. Enfin, transférez la souris dans une cage avec une plateforme chauffante et surveillez l’animal.

Maintenant que nous avons passé en revue comment effectuer une électroporation in utero, regardons quelques utilisations de cette technique.

L’électroporation in utero est une méthode utile pour étudier la façon dont des gènes spécifiques contribuent au développement neural. Des structures électroporées peuvent permettre la surexpression d’une protéine normale ou mutante, ou encore le blocage complet de l’expression d’une protéine. Les phénotypes neurologiques peuvent ensuite être observés soit au niveau microscopique, soit au niveau de l’organisme. Par exemple, ces chercheurs ont déterminé que la surexpression transitoire du gène DISC-1, associé à la schizophrénie dans le cerveau de souris en développement, donne plus tard lieu à une hypersensibilité à l'amphétamine.

L’électroporation in utero peut aussi être utile pour visualiser des populations de cellules spécifiques et les connections qu’elles font par la livraison de séquences codant les protéines fluorescentes dans les tissus neuraux. Par exemple, ces chercheurs électroporent le gène de la protéine fluorescente verte dans des rétines E13,5 pour étudier les cellules ganglionnaires de la rétine, ou CGRs, qui transmettent l’information visuelle de l’œil au cerveau. L'examen de la rétine au stade embryonnaire 18,5 montre comment cette technique peut être utilisée pour décrire le chemin emprunté par l’axone de CGR dans le nerf optique, le chiasma optique et le tractus optique.

Enfin, de nombreux évènements importants dans le développement neural surviennent après la naissance, ce qui a inspiré les scientifiques à développer une technique modifiée appelée électroporation in vivo. Cette procédure comporte les mêmes étapes que électroporation in utero, mais elle est généralement effectuée dans les premiers jours suivant la naissance. La manipulation génétique postnatale est particulièrement utile pour étudier les types de cellules nées plus tard, tels que celles trouvées dans le bulbe olfactif montré ici.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’électroporation in utero. Cette vidéo couvre les principes clés et une vue d’ensemble sur comment réaliser l’électroporation in utero, ainsi que quelques utilisations qui permettent aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent le développement neuronal. Merci de nous avoir regardés!