La technique d'infiltration-centrifugation pour l'extraction de apoplastique Fluid feuilles des plantes Utilisation Phaseolus vulgaris, Un exemple

L’objectif de cette procédure est de démontrer l’extraction d’un liquide aplasique à partir des feuilles des plantes à l’aide de la technique de centrifugation par infiltration. Pour ce faire, il suffit d’immerger d’abord une feuille dans un fluide d’infiltration et d’utiliser les différences de pression générées à l’aide d’une seringue ou d’une pompe à vide pour l’infiltrer complètement. La deuxième étape consiste à préparer la feuille à centrifuger à l’aide d’un appareil de support.

Ensuite, la feuille est délicatement centrifugée pour obtenir le liquide de lavage APO plast. La dernière étape consiste à déterminer le facteur de dilution de l’APO plast et à analyser la qualité du liquide de lavage en last. En fin de compte, le test de centrifugation par infiltration est utilisé pour obtenir des échantillons représentatifs de plastique APO qui peuvent être utilisés pour une variété d’analyses en aval.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes est qu’il est simple d’optimiser pour une variété de types de feuilles afin d’obtenir des échantillons supérieurs plus qui ont une contamination minimale par des composés cytoplasmiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines tels que la physiologie végétale et les interactions entre les microbes végétaux, où il est important de comprendre comment la composition des APL varie entre les plantes et change dans différentes conditions physiologiques ou stress. Dans un premier temps, prenez des précautions de sécurité en portant une blouse de laboratoire, un gant et des lunettes de protection.

Ensuite, préparez un volume d’eau distillée dans lequel immerger l’échantillon de feuilles. Ayez une lame de rasoir prête à prélever un échantillon, dans ce cas, une feuille du cultivar de haricot vert tendre. Placez la lame de rasoir contre l’animal d’une feuille et fixez la feuille de la plante.

Une fois recueillie, immergez la feuille fraîchement excisée dans de l’eau distillée pour éliminer les contaminants de surface des feuilles. Ensuite, utilisez un mouchoir ou du papier absorbant pour bloquer doucement la feuille. Mesurez le poids des feuilles avant de procéder à l’infiltration.

Cela aidera plus tard à estimer le volume d’infiltration. Démarrez le processus d’infiltration avec une seringue de 60 millilitres. Une fois son piston retiré, roulez et/ou pliez soigneusement la feuille dans la seringue.

Ensuite, remplissez la seringue de liquide d’infiltration. Ici, de l’eau distillée est utilisée. Insérez le piston et retournez la seringue pour éjecter l’air qu’elle contient.

Notez la couleur des feuilles pour une comparaison ultérieure. Déplacez le piston jusqu’à la marque des 40 millilitres à l’aide d’un petit morceau de para param. Couvrez l’embout de la seringue.

Tirez ensuite le piston jusqu’à la marque des 60 millilitres pour créer une pression négative. Retournez la seringue pour libérer les bulles d’air de la surface de la feuille. Remettez lentement le piston à la position de départ pendant environ deux secondes.

Découvrez l’embout de la seringue et éjectez l’air. Ensuite, couvrez à nouveau l’embout et appuyez sur le piston pour créer une modeste quantité de pression positive. Continuez à appliquer une pression négative en éjectant de l’air et en appliquant une pression positive jusqu’à ce que le vantail soit complètement infiltré.

La preuve d’une infiltration totale est la couleur foncée des zones infiltrées. Une fois que vous l’avez vu, retirez la feuille de la seringue. Bloquez doucement la feuille avec du papier absorbant pour enlever le liquide de surface.

Mesurez ensuite le poids de la feuille infiltrée, et une autre méthode d’infiltration utilise une fiole sous vide. Encore une fois, récupérez une feuille et rincez-la à l’eau distillée. Après l’avoir séché au jet rapide, mesurez le poids des feuilles.

Procurez-vous une gourde d’arme de poing d’une capacité minimale de 250 millilitres. Placez la feuille dans la fiole et couvrez-la d’eau distillée. Ensuite, placez un bouchon dans le flacon et fixez une pompe à vide sur le bras de poing.

Appliquez un vide dans le ballon suffisamment longtemps pour obtenir une pression. Environ 650 millimètres de mercure. Agitez doucement le ballon pour libérer les bulles d’air de la feuille sous une pression réduite.

Ensuite, relâchez soigneusement et lentement le vide pendant environ 10 secondes. Répétez le processus d’application du vide, d’agitation de la fiole et de relâchement du vide jusqu’à ce que la feuille soit complètement infiltrée. La preuve d’une infiltration totale est la couleur foncée des zones infiltrées.

Retirez la feuille complètement infiltrée de la fiole et épongez doucement la feuille avec du papier absorbant. Pour éliminer le liquide de surface, mesurez le poids de la feuille infiltrée afin de permettre de déterminer le volume approximatif d’infiltration. Une fois qu’une feuille a été complètement infiltrée, préparez-la pour la centrifugation.

Étalez un morceau de film para de quatre pouces de large. Placez la feuille sur le film para. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette de cinq millilitres, enroulez la feuille dans le film para

Prenez un corps de seringue de 20 millilitres avec le piston retiré et insérez la feuille enroulée avec la pointe de la pipette. Positionnez les bords des feuilles coupées et faites face à l’extrémité du piston. Procurez-vous un tube en polyéthylène ou en polycarbonate de 50 millilitres et insérez-y la seringue.

Utilisez une centrifugeuse avec un rotor à godets oscillants. Chargez le tube contenant la feuille infiltrée et la centrifugeuse de quatre degrés Celsius et 1000 G pendant 10 minutes. Après la centrifugation, examinez la feuille pour déterminer si la majorité du liquide d’infiltration a été expulsée.

Le tube de centrifugation contient maintenant le liquide de lavage APO plast récupéré et continuez en pipetant le liquide de lavage alast récupéré dans des tubes frais de 1,5 millilitre. Placez les échantillons de liquide de lavage APO plast dans la centrifugeuse et faites-les tourner à 15 000 G pendant cinq minutes pour éliminer les cellules ou les particules. Après la centrifugation, pipeter le supinat dans des tubes frais.

Conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’ils puissent être conservés à moins 80 degrés Celsius. Une méthode pour évaluer la qualité du liquide de lavage de plaque APO consiste à calculer le facteur de dilution de plaque APO. Pour ce faire, préparez deux volumes d’eau distillée de liquide d’infiltration dans ce cas chacun suffisant pour plusieurs infiltrations à un volume.

Ajouter la poudre de carmin d’indigo à une concentration finale de 50 micromolaires. N’ajoutez rien à l’autre. Obtenez une microplaque de 96 puits remplissez trois puits avec 200 microlitres de solution d’infiltration.

Avec du carmin d’indigo, remplissez trois autres avec 200 microlitres de la solution d’infiltration pure pour baser la microplaque dans le lecteur pour mesurer l’absorbance de chaque fluide. À 610 nanomètres, l’absorbance moyenne d’un fluide contenant du carmin d’indigo moins l’absorbant moyen d’un fluide sans, ce qui donne l’absorbance corrigée de l’infiltrat. Ensuite, répétez le protocole d’infiltration des feuilles trois fois pour chacune des solutions d’infiltration.

Immergez un échantillon de feuille dans l’eau. Appliquez une pression négative et positive lors de l’utilisation de la solution d’infiltration de carmin d’indigo, rincez les feuilles à l’eau distillée après l’infiltration pour éliminer tout carmin d’indigo restant de la surface des feuilles. Récupérer un liquide de lavage par centrifugation.

Après avoir récupéré le liquide de lavage alast, retournez dans le lecteur de plaques dans les puits de la microplaque. Placé 200 microlitres de chacune des extractions sans carmin d’indigo, ainsi que 200 microlitres de chaque extraction de liquide de lavage au carmin d’indigo. Mesurer l’absorbance des échantillons à 610 nanomètres pour obtenir l’absorbance corrigée.

Faites la moyenne de chaque série de chiffres et prenez la différence. Utiliser l’absorbance corrigée de l’infiltrat et l’absorbance corrigée du liquide de lavage aplasique pour déterminer le facteur de dilution APL afin d’obtenir des estimations des concentrations ou des activités dans le liquide aplasique. L’implanteur multiplie les valeurs de concentration ou d’activité du liquide de lavage par le facteur de dilution extrait du cultivar fasi vulgaris.

Le vert tendre a été utilisé pour produire cette chromatographie en phase gazeuse à spectre de masse d’acides organiques. Les sucres simples et les acides aminés représentent la majeure partie des métabolites identifiables. Voici une comparaison de la page SDS, gels de coloration Kumasi de fasi vulgarus alast extraits de feuilles de liquide de lavage.

Les extractions diffèrent par la quantité de contamination cytoplasmique. Ceci est observé sous la forme de différentes quantités de l’enzyme de plâtre rubis. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d’être au moins aussi doux que possible pour éviter de causer des lésions tissulaires ou une contamination cytoplasmique Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que la spectrométrie de masse des protéines ou des métabolites peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la composition du fluide aplasique. Le liquide de lavage aplasique peut également être utilisé comme milieu grossier pour étudier l’effet des produits chimiques aplasiques sur les micro-organismes qui colonisent les tissus végétaux.