Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l'analyse des lymphocytes infiltrant

L'objectif général de cette procédure est d'homogénéiser rapidement des fragments de tissu humain en une suspension de cellules uniques sans digestion enzymatique, afin d'effectuer des analyses qualitatives et quantitatives ainsi que l'isolement de sous-populations spécifiques de lymphocytes. Cette étape est réalisée en premier lieu en utilisant un scalpel stérile pour découper les fragments de tissu en petits morceaux. Ensuite, la mixture tissulaire est transférée dans un tube de dissociation mécanique, où les fragments sont davantage homogénéisés en une suspension de cellules uniques.

Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation pour une analyse en aval. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour analyser les lymphocytes infiltrant la tumeur, ainsi que leurs sous-populations. Mon laboratoire a mis au point cette technique car nous recherchions un moyen d'observer les lymphocytes infiltrant la tumeur sans affecter considérablement leur état natif.

Nous souhaitions disposer d'une méthode permettant d'isoler rapidement les cellules et de les analyser telles qu'elles se présentaient lors de l'intervention chirurgicale. Cette technique a été utilisée sur plus de 300 tumeurs mammaires et tissus normaux dans notre laboratoire, est facile à mettre en œuvre et peut être utilisée quotidiennement. Elle permet d'examiner des marqueurs pronostiques, la réponse au traitement et l'évolution clinique à long terme.

Aujourd'hui, cette technique sera démontrée par John Nicola Loic, technicien dans mon laboratoire. Commencez par peser l'échantillon de tissu, puis mesurez sa longueur, sa largeur et sa hauteur. Transférez ensuite le fragment de tissu dans une petite boîte de Pétri contenant un millilitre de milieu cellulaire hématopoïétique défini chimiquement et sans sérum, et utilisez un scalpel stérile pour découper les échantillons en petits morceaux de un à deux millimètres carrés.

Ensuite, transférez le contenu de la boîte dans un tube C de dissociation mécanique et rincez la boîte et le scalpel avec deux millilitres de milieu. Ajoutez le rinçage au tube C, puis exécutez deux fois de suite le programme de dissociation mécanique 0.01 afin d'homogénéiser délicatement les fragments de tissu en une suspension monocellulaire. Après le deuxième cycle, versez délicatement l'homogénat à travers un filtre cellulaire de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, utilisez le même piston pour pipette afin de rincer la boîte de Pétri et transférer tout liquide restant dans le tube C vers le filtre à cellules. Puis, utilisez une micropipette de un millilitre pour transférer le liquide filtré dans un tube conique de 15 millilitres et rincez le tube C avec trois millilitres supplémentaires de milieu. Transférez ce rinçage à travers le filtre à cellules dans le tube de 50 millilitres.

Ensuite, déplacez délicatement le tissu non homogénéisé dans le filtre à l’aide d’une pointe propre de un millilitre afin d’expulser la quantité maximale de liquide résiduel piégé dans le tissu vers le tube de 50 millilitres. Placez maintenant le filtre à cellules retourné au-dessus du tube C d’origine et rincez le filtre avec trois millilitres supplémentaires de milieu, de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C. Réalisez une nouvelle homogénéisation du tissu pendant deux cycles supplémentaires comme vient de l’être démontré, puis versez cet homogénat secondaire à travers le filtre à cellules.

De nouveau, rincez le tube C avec trois millilitres supplémentaires de milieu. Ensuite, filtrez le surnageant à travers le tamis et exprimez le liquide résiduel du tissu comme vient de l'être démontré. À ce stade, un volume d'environ 2,5 millilitres de suspension de cellules isolées devrait être présent dans le tube de 15 millilitres, et environ neuf millilitres devraient être observés dans le tube de 50 millilitres.

Pour séparer le surnageant tissulaire des cellules, centrifuger d'abord les deux tubes d'homogénat pendant 15 minutes à 600 G et à température ambiante, puis verser délicatement le surnageant du tube de 15 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre, le placer à quatre degrés Celsius, et jeter le surnageant du tube de 50 millilitres. Ensuite, taper doucement chaque tube sur une surface dure afin de disperser les culots cellulaires. Redisperser le culot cellulaire lâche dans le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de milieu, puis transférer les cellules dans le tube de 15 millilitres pour redisperser le second culot.

Ensuite, rincez le tube de 50 millilitres avec encore 500 microlitres de milieu et transférez le rinçage dans le tube de 15 millilitres pour une récupération maximale des cellules. Après avoir dénombré le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan, mettez en pellet le suspense cellulaire. Enfin, centrifugez le surnageant tissulaire réservé.

Ensuite, transférez soigneusement le surnageant vers au moins un tube propre sans toucher ni perturber le culot, puis stockez-le à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures en aval. Sur ces graphiques, des dot plots représentatifs de cytométrie en flux provenant d'homogénats de cellules tumorales dissociées, suivis d'un marquage par des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs des leucocytes et des cellules épithéliales, sont présentés comme illustré. Ce protocole n'altère pas significativement la viabilité des cellules positives pour CD 45.

Cependant, on observe une perte considérable de cellules viables positives pour EPAM. Malgré cela, les sous-populations viables positives pour EPAM et positives pour CD45 peuvent être séparées en fonction de leur taille et de leur structure en grandes cellules tumorales épithéliales, petites cellules épithéliales, ou cellules positives pour CD45 de grande et petite taille. Des histogrammes représentatifs de cytométrie en flux des principales sous-populations infiltrant la tumeur sont présentés ici, les lymphocytes étant sélectionnés en fonction de la viabilité des cellules positives pour CD45.

Enfin, l'expression des cytokines ou les immunoglobulines totales présentes dans le surnageant de cancer du sein peuvent être comparées au surnageant de tissu mammaire normal, révélant, comme le montre cette expérience représentative, une augmentation des deux types de protéines associées au tissu tumoral. Bien que la procédure soit simple, il est important de se rappeler de travailler rapidement et avec soin, et de récupérer la quantité maximale de matériel à chaque étape du protocole afin d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour l'analyse finale.