Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l'analyse des lymphocytes infiltrant

L’objectif global de cette procédure est d’homogénéiser rapidement des fragments de tissu humain en une suspension cellulaire unique sans digestion enzymatique pour l’analyse qualitative et quantitative et l’isolement de sous-populations lymphocytaires spécifiques. Pour ce faire, il suffit d’abord d’utiliser un scalpel stérile pour couper les fragments de tissu en petits morceaux. Ensuite, la suspension tissulaire est transférée dans un tube dissocié mécaniquement où, après quoi les fragments sont encore homogénéisés en une suspension unicellulaire.

Les cellules sont ensuite collectées par centrifugation pour une analyse en aval. À terme, la cytométrie en flux peut être utilisée pour analyser les lymphocytes infiltrants, les sous-populations asiatiques. Mon laboratoire a développé cette technique parce que nous cherchions un moyen d’imager les lymphocytes infiltrant la tumeur sans affecter considérablement leur état natif.

Nous voulions quelque chose qui nous permettrait d’isoler rapidement les cellules et de les analyser telles qu’elles étaient lors de la chirurgie. Cette technique a été utilisée sur plus de 300 tumeurs du sein et tissus normaux dans notre laboratoire, et est facile à utiliser et peut être utilisée au quotidien. Il peut être utilisé pour examiner les marqueurs pronostiques, la réponse au traitement et les résultats cliniques à long terme.

La démonstration de cette technique aujourd’hui sera assurée par John Nicola Loic. Un technicien de mon laboratoire commence par peser l’échantillon de tissu, puis mesure la longueur, la largeur et la hauteur du tissu. Transférez ensuite le fragment de tissu dans une petite boîte de Pétri contenant un millilitre de milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum approprié et chimiquement défini, et utilisez un scalpel stérile pour couper les échantillons en petits morceaux d’un à deux millimètres carrés.

Ensuite, transférez le contenu du plat dans un tube C de dissociation mécanique et rincez le plat et le scalpel avec deux millilitres de fluide. Ajoutez le lavage dans le tube C, puis exécutez deux fois de suite le programme de dissociation mécanique de 0,01 pour homogénéiser doucement les fragments de tissu en une suspension unicellulaire. Après le deuxième cycle, décantez l’homogénat à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, utilisez le même parasite que votre pipette de lavage de la boîte de Pétri pour transférer tout liquide restant dans le tube C dans la crépine de la cellule. Ensuite, utilisez une micro-pipette d’un millilitre pour transférer le liquide filtré dans un tube conique de 15 millilitres et rincez le tube C avec trois millilitres supplémentaires de fluide. Transférez ce lavage à travers la crépine de la cellule dans le tube de 50 millilitres.

Ensuite, déplacez doucement le tissu non homogénéisé autour de la passoire avec un embout propre d’un millilitre pour presser la quantité maximale de liquide résiduel piégé dans le tissu dans le tube de 50 millilitres. Maintenant, placez la passoire à cellules à l’envers sur le tube C d’origine et rincez la passoire avec trois millilitres supplémentaires de fluide afin que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C. Réhomogénéisez le tissu pendant deux cycles supplémentaires, comme nous venons de le démontrer, puis versez ce deuxième homogénat à travers la crépine cellulaire.

Encore une fois, rincez le tube C avec trois autres millilitres de fluide. Ensuite, filtrez le surnageant à travers la crépine et pressez le liquide résiduel hors du tissu comme cela vient d’être démontré. À ce stade, un volume d’environ 2,5 millilitres de suspension à cellule unique doit être présent dans le tube de 15 millilitres, et environ neuf millilitres doivent être observés dans le tube de 50 millilitres.

Pour séparer le surnageant tissulaire des cellules, centrifugez d’abord les deux tubes d’homogénat pendant 15 minutes à 600 G et à température ambiante, décantez le surnageant du tube de 15 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre, en le plaçant à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant du tube de 50 millilitres. Ensuite, tapotez doucement chaque tube sur une surface dure pour briser chacune des pastilles de cellule. Remettez en suspension la pastille à cellules libres dans le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de fluide, et transférez les cellules dans le tube de 15 millilitres pour remettre en suspension la deuxième pastille.

Rincez ensuite le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de fluide et transférez le lavage dans le tube de 15 millilitres pour une récupération cellulaire maximale. Après avoir compté le nombre de cellules viables par pastille d’exclusion trian blue, la suspension cellulaire. Enfin, faites tourner le surnageant tissulaire réservé.

Ensuite, transférez soigneusement le surnageant dans au moins un tube propre sans toucher ni déranger la pastille et stockez-la à moins 80 degrés Celsius pour une analyse future en aval. Dans ces graphiques, des graphiques représentatifs de la cytométrie en flux des homogénats de cellules tumorales dissociées, suivis d’un marquage avec des anticorps spécifiques contre les leucocytes et les marqueurs de cellules épithéliales, sont présentés comme démontrés. Ce protocole ne modifie pas significativement la viabilité des cellules positives pour le CD 45.

Cependant, il y a une perte considérable de cellules EPAM positives viables. Malgré cela, les sous-ensembles positifs à l’EPAM et aux CD 45 positifs peuvent être séparés en fonction de leur taille et de leur structure en cellules tumorales épithéliales de grande taille, en petites cellules épithéliales ou en cellules positives pour CD 45 de grande et de petite taille. Des diagrammes de points représentatifs de la cytométrie en flux des principaux sous-ensembles infiltrant la tumeur sont présentés ici, les lymphocytes étant contrôlés sur la viabilité des cellules positives pour le CD 45.

Enfin, l’expression des cytokines ou des immunoglobulines totales présentes dans le surnageant du cancer du sein peut être comparée à celle du surnageant du tissu mammaire normal, révélant, comme le démontre cette expérience représentative, une augmentation des deux types de protéines associées au tissu tumoral. l’analyse de vos terminaux.