Name: Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour lanalyse des lymphocytes infiltrant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez une méthode de dissociation non enzymatique rapide pour homogénéiser des fragments de tissus humains frais en suspension cellulaire unique. Cette technique préserve l'état natif des lymphocytes infiltrants pour analyse par cytométrie en flux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions fromthe Fonds belge pour la recherche scientifique (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer de la Belgique, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson et le Fonds Barsy.

REMARQUE: Tous les spécimens ont été acquis au moyen d&#39;un protocole approuvé par le comité d&#39;éthique médicale de l&#39;Institut Jules Bordet avec le consentement éclairé écrit obtenu de chaque patient. 1. Préparation de l&#39;homogénat de tissu <ol><li> Disséquer les tissus (résection de tissus malins et normal résection de la salle d&#39;opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel qualifié pour la collecte immédiate. Tumeur, NANT (prise la plus grande distance de la tumeur que possible) et des fragments de tissus normaux sont régulièrement traitées dans 1-3 h de l&#39;excision chirurgicale dans un laboratoire de BSL2 en utilisant des procédures de biosécurité standard pour les tissus humains. Un diagramme de flux du protocole est illustré sur la figure 1. </li><li> Peser tous les fragments de tissus (normales, NANT et tumorales) et mesurer la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Ce est une étape importante pour la normalisation ultérieure de sous-populations de cellules, l&#39;ARN extrait, etc. NOTE: La gamme de taille de l&#39;échantillon est de 100 à 10 000 mm 3 sans gras si possible. </li><li> Imprimer le fragment de la tumeur sur une lamelle de verre de coloration H &amp; E afin de vérifier que le tissu est en fait une partie de la tumeur. <ol><li> Pour ce faire, en appuyant sur une lame de microscope en verre sur le fragment de la tumeur et appliquant une légère pression avec les doigts pendant quelques secondes. </li><li> Fixer la lame avec de l&#39;isopropanol pendant 2 min, suivie d&#39;une étape de lavage dans l&#39;eau. Counterstain le tissu pendant 30 secondes avec l&#39;hématoxyline de Mayer. </li><li> Laver la lame dans six bains d&#39;eau. Colorer dans la phloxine B 2% pendant 15 sec. </li><li> Laver à un bain d&#39;eau suivie de quatre salles de bains de l&#39;isopropanol et la finition avec une salle de bain de l&#39;eau. </li><li> Incuber dans l&#39;isopropanol pendant 1 min et le drain. Effacer dans deux bains de xylène. </li><li> Montez avec un milieu de montage à base de xylène. Examinez pour cellularité tumorale (Figure 2). REMARQUE: Principalement, les cellules tumorales collent à la diapositive impressionStylos - les cellules stromales, lymphoïde ou adipose cellules restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2). </li></ol></li><li> Placez le fragment de tissu dans une petite boîte de culture contenant 1 ml de, milieu de cellules hématopoïétiques sans sérum chimiquement défini (ci-après dénommé milieu) à la température ambiante et couper en petits morceaux (~ 1 à 2 mm 2) en utilisant une solution stérile scalpel. </li><li> Transférez tout (fragments de tissus + moyenne) à un tube mécanique dissociateur C. </li><li> Rincer la boîte de Pétri et scalpel avec 2 ml de milieu à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur et ajouter ceci à tube C (volume du milieu de dissociation = 3 ml). </li><li> Utilisez le A.01 de programme de dissociateur mécanique pour tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissus dans une suspension cellulaire unique. Placer le tube de C dans l&#39;appareil et exécuter le programme deux fois de suite (un cycle = 25 sec). NOTE: Cette procédure d&#39;homogénéisation a été établi et validé pour le tissu mammaire humain, autre tumou tissus ou types peuvent avoir besoin d&#39;utiliser un autre programme et devraient être testés en premier. </li><li> Retirer le tube de l&#39;appareil C et l&#39;homogénat décanter directement dans un tamis cellulaire de 40 pm assis sur un tube de 50 ml. En utilisant la même pipette Pasteur comme à l&#39;étape 1.6, transférer le liquide restant dans le tube de C au tamis cellulaire. </li><li> Transférer le liquide filtré dans un tube de 15 ml en utilisant une pointe de micropipette 1 ml. Temporairement maintenir le tamis cellulaire et son tube de 50 ml. </li><li> Rincer le tube de C avec un 3 ml supplémentaires de milieu et transférer ce, encore une fois en utilisant la même pipette Pasteur comme à l&#39;étape 1.6, à l&#39;tamis cellulaire encore assis sur le tube de 50 ml. Pressez un montant maximum de liquide résiduel piégé dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en déplaçant doucement autour de la crépine avec une pipette Pasteur propre ou une pointe ml qui est ensuite jeté pour éviter de contaminer l&#39;éluat. </li><li> Placez le filtre cellulaire à l&#39;envers sur til tube d&#39;origine C et rinçage avec 3 ml de milieu de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C. </li><li> Re-homogénéiser comme à l&#39;étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01. </li><li> Pour cette deuxième homogénat à travers le tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml, rincer le tube de C de nouveau avec 3 ml de milieu (comme à l&#39;étape 1.10) et transférer à la pipette Pasteur au tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml à nouveau serrant au maximum quantité de liquide à partir du tissu conjonctif résiduel piégé dans le filtre à cellule. </li><li> À ce stade, un volume de ~ 2,5 ml est dans le tube de 15 ml et ~ 9 ml dans le tube de 50 ml. </li></ol> 2. Séparation du surnageant de cellules et de tissus <ol><li> Centrifuger les homogénats à 15 ml et les tubes de 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante. </li><li> Décanter le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et stocker temporairement à 4 ° C. Ce surnageant = tumeur primaire, NANT ou ti normalessu SN (de volume final de 2,5 ml) est ensuite clarifié et aliquotée avant le stockage à -80 ° C pour les analyses futures (voir ci-dessous). </li><li> Jeter le surnageant à partir du tube de 50 ml. </li><li> Resuspendre doucement les deux culots de cellules dans un volume final de 1 ml de milieu. En bref, la première briser doucement le culot cellulaire dans les deux tubes (en appuyant sur le tube sur une surface dure). Remettre en suspension le culot cellulaire en vrac dans les 50 ml avec 500 ul de milieu et transférer cette suspension de cellules dans le tube de 15 ml pour remettre en suspension le culot secondes. Répétez cette étape une fois avec les secondes 500 pi de milieu pour une récupération maximale des cellules. </li><li> Transfert 10 ul de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélanger avec 10 pi de bleu trypan (dilution 1: 1) et compter le nombre de cellules viables à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. REMARQUE: À ce stade une fraction de la suspension de cellules peut également être analysée par cytométrie de flux pour évaluer la taille de la cellule, la granularité et si on le désire un nombre limité de marqueurs de sous-populations de plus precise évaluation de la distribution des cellules par rapport à l&#39;homogénat avant l&#39;analyse ou expérimentation extensive. Toutes les analyses par cytométrie flux intègrent étiquetage CD45 pour la normalisation des sous-populations. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, NANT, ou un tissu normal sont maintenant prêts pour une autre purification ou d&#39;analyse. Ces étapes supplémentaires sont les mieux lorsqu&#39;elles sont effectuées le même jour que la chirurgie. NOTE: Pour l&#39;analyse par cytométrie de flux mais pas le tri cellulaire des globules rouges résiduels doivent être lysées après marquage de l&#39;anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse de globules rouges au culot cellulaire, vortex immédiatement pendant 1 seconde et l&#39;incubation d&#39;un minimum de 10 min à manger température (abri de la lumière) avant l&#39;analyse. </li></ol> 3. Clarification du surnageant tissulaire <ol><li> Centrifuger les tubes de 1,5 ml avec SN tissulaire à 15 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Retirez délicatement til surnageant sans toucher ni déranger le culot. Transférer dans un tube propre (ou tubes) selon le nombre et le volume des aliquotes souhaités. </li><li> Stocker le surnageant à -80 ° C pour une utilisation future. </li></ol> 4. sang du patient <ol><li> Prélever un échantillon de sang de chaque patient, en tant que témoin par ponction veineuse dans des tubes héparinisés le jour avant la chirurgie. Centrifuger le sang à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec le frein, pour obtenir le plasma et une couenne. </li><li> Retirez le plasma et la clarifier par centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 20 ºC. Aliquoter et magasin plasma à -80 ° C pour une utilisation future. Diluer la couche leuco-plaquettaire en milieu </li><li> Séparer les cellules mononucléaires en utilisant la centrifugation en gradient de Ficoll-Hypaque norme avant l&#39;analyse immédiate, l&#39;isolement des sous-populations, / ARN / extraction de protéines ou d&#39;ADN cryoconservation. </li></ol> 5. cytométrie en flux <ol><li> cellules d&#39;étiquetage selon la fabricationles instructions r à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. Lyser les globules rouges dans les suspensions cellulaires à partir de fragments de tissus après le marquage de l&#39;anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse cellulaire au culot cellulaire. </li><li> Vortexer immédiatement une seconde et incuber un minimum de 10 min à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. Passez les cellules marquées dans un cytomètre de flux pour l&#39;acquisition de données sans lavage. </li></ol>

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%27elite+hacker%27%3A+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Quezada, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+tumor+infiltration+by+activated+T+effector+cells+restricts+the+therapeutic+activity+of+regulatory+T+cell+depletion+against+established+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma.</a> J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>McCauley, H. A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li>
<li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+B+cell+characterization+in+blood%2C+lymph+nodes%2C+and+tumors+from+patients+with+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+%3A+Density%2C+Composition+And+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’existe aucun conflit d’intérêts.

Cette étude décrit un procédé optimisé pour la préparation rapide d&#39;homogénats de tissus du sein normaux et malins sans digestion enzymatique pour le tri ultérieur de la cellule, l&#39;extraction, la cryoconservation et / ou l&#39;analyse phénotypique de CD45 + sous-populations. L&#39;objectif de cette approche expérimentale est de produire des images de la TIL qui reflètent étroitement leur état ​​in vivo et de les comparer aux tissus normaux avec une manipulation minimale des tissus frais de la...

Le microenvironnement tumoral est composé de différents types de cellules, de nombreuses études montrant qu’elles jouent chacune un rôle distinct et important dans la tumorigenèse1,2. Il s’agit, sans s’y limiter, des cellules immunitaires infiltrantes, des cellules stromales, des cellules endothéliales et des cellules tumorales3. Des études ex vivo de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL ; CD45+ ou leucocytes, qui sont principalement des lymphocytes dans les tumeurs du sein) provenant d’échantillons de tissus humains frais est rendue difficile par leur faible fréquence, la petite taille des échantillons souvent disponibles pour la recherche et le risque de perte de viabilité lors de l’extraction. Parce que les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs sont généralement présentes en tant que passagers plutôt que résidents permanents, elles sont généralement plus faciles à libérer de la matrice tissulaire.
La dissociation du tissu tumoral tout en maintenant l’intégrité cellulaire est techniquement difficile et a traditionnellement été réalisée en utilisant une combinaison d’étapes mécaniques et enzymatiques pour préparer des suspensions de cellules uniques4-8. Cette approche implique de longues périodes d’incubation et est associée à une réduction significative de la viabilité cellulaire ainsi qu’à la perte de récepteurs de surface cellulaire par clivage enzymatique. Il est plus difficile de réaliser des études de cytométrie en flux de haute qualité caractérisant la TIL dans le microenvironnement tumoral ainsi que des purifications propres des sous-populations CD45+ par cytométrie en flux ou des billes enrobées d’anticorps à partir de tissus tumoraux digérés par des enzymes. De plus, le surnageant (SN) de l’homogénat tumoral résultant ne se prête pas à une analyse plus approfondie, y compris la quantification des protéines sécrétées (cytokines, chimiokines, immunoglobulines ou antigènes tumoraux) ou le traitement expérimental de cellules normales, en raison du potentiel de dégradation des protéines dans les digestions enzymatiques.
Dans notre recherche d’une méthode pour préparer des homogénats unicellulaires à partir de tissus mammaires [y compris les tissus tumoraux, non tumoraux non adjacents (NANT) et normaux (issus de réductions mammaires)) sans digestion enzymatique, nous avons testé une variété de techniques d’homogénéisation mécanique. Les homogénats préparés à l’aide d’un dissociateur mécanique ont augmenté la viabilité cellulaire (2 fois) et la récupération cellulaire totale (2 fois) tout en préservant l’expression des récepteurs de surface. La digestion enzymatique du matériel insoluble restant n’a pas permis de récupérer d’autres cellules CD45+, ce qui suggère qu’elles ont toutes été libérées dans l’homogénat initial. Ainsi, cette approche simple et rapide permet une évaluation à la fois qualitative et quantitative des sous-populations de CD45+ présentes dans divers tissus humains normaux et malins. Un avantage supplémentaire de cette approche est que le SN de l’homogénat initial (SN de tissu primaire) peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation ultérieure.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine est quelque peu équivalent</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ou autre centrifugeuse de table standard</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>ou autre microcentrifugeuse standard</td></tr><tr><td>Esco Classe II A2 Biosafety Cabinet</td><td>ESCO global</td><td></td><td>ou autre standard BSL2 hotte</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>ou autre microscope compatible pour un hémacytomètre</td></tr><tr><td>B&uuml ; Chambre de chambre</td><td>Marienfield&nbsp ;</td><td>640210</td><td>ou autre hémacytomètre standard</td></tr><tr><td>Navios Cytomètre en flux</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>ou autre cytomètre en flux (8-10 couleur recommandée)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine utilise Filcon</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>ou d’autres objets en plastique apyrogènes</td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>ou scalpel stérile standard à usage unique</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 & micro ; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>ou autre objet en plastique apyrogène</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>ou autre objet en plastique apyrogène</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>ou autre objet en plastique apyrogène</td></tr><tr><td>BD FACS Tube 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>ou autre objet en plastique apyrogène</td></tr><tr><td>Pasteur stérile Pipette 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>ou autre plastique apyrogène</td></tr><tr><td>Tube à microfuge 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>ou autre plastique apyrogène</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>sans sérum moyen recommandé</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>physiologique standard PBS</td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>ou autre tache vitale</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Viabilité fixable Dye eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>pour les expériences de cytométrie</td></tr><tr><td>en flux anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>pour les expériences</td></tr> <tr><td>de cytométrie en fluxanti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>pour les expériences de cytométrie</td></tr><tr><td>en flux anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>pour les expériences de cytométrie</td></tr><tr><td>en flux anti-CD45 VioGreen Miltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-096-906</td><td>pour les expériences de cytométrie en flux</td></tr></tbody></table>

un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

La capacité des cellules malignes à échapper au système immunitaire, caractérisé par l&#39;échappement tumoral à partir des réponses immunitaires innées et adaptatives, est maintenant accepté comme une caractéristique importante de cancer. Notre recherche sur le cancer du sein se concentre sur le rôle actif que les lymphocytes infiltrant les tumeurs jouent dans la progression tumorale et les résultats des patients. Dans ce but, nous avons développé une méthodologie pour l&#39;isolement rapide des cellules lymphoïdes intacts de tissus normaux et anormaux dans un effort pour les évaluer à proximité de leur état natif. Homogénats préparés en utilisant un spectacle de dissociateur mécanique à la fois la viabilité accrue et la cellule de récupération tout en préservant l&#39;expression du récepteur de surface par rapport aux tissus digéré par une enzyme. En outre, la digestion enzymatique de la matière insoluble restante n&#39;a pas récupéré CD45 + cellules supplémentaires indiquant que les mesures quantitatives et qualitatives dans l&#39;homogénat primaire susceptibles reflètent véritablement sous-populations infiltrant dans le fragm de tissusent. Les cellules lymphoïdes dans les homogénats peuvent être facilement caractérisées en utilisant immunologique (phénotype, la prolifération, etc.) ou moléculaire (ADN, ARN et / ou protéine) approches. les cellules CD45 + peuvent également être utilisés pour la purification de la sous-population, l&#39;expansion in vitro ou cryoconservation. Un autre avantage de cette approche est que le surnageant de tissu primaire à partir des homogénats peut être utilisée pour caractériser et de comparer des cytokines, des chimiokines, des immunoglobulines et des antigènes présents dans les tissus normaux et malins. Cette fonction de protocole extrêmement bien pour les tissus mammaires humains et doivent être applicables à une grande variété de tissus normaux et anormaux.

La digestion enzymatique de fragments de tissus disponibles dans le commerce avec des solutions de dissociation des tissus ou divers mélanges de laboratoire de la collagénase, la DNase et / ou des inhibiteurs de la hyaluronidase, cliver une large gamme de récepteurs à la surface des cellules. Nos études, d&#39;abord axées sur les cellules T CD4 + infiltrant les tumeurs du sein, ont été rapidement présentés à un problème technique majeur dû au clivage des récepteurs CD4 de surface en utilisant des protocoles d...

Ce protocole décrit la dissociation rapide non enzymatique de fragments de tissus humains frais pour l’évaluation qualitative et quantitative des cellules CD45+ (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins. De plus, le surnageant obtenu à partir de l’homogénat de tissu primaire peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation plus approfondie.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

L'objectif général de cette procédure est d'homogénéiser rapidement des fragments de tissu humain en une suspension de cellules uniques sans digestion enzymatique, afin d'effectuer des analyses qualitatives et quantitatives ainsi que l'isolement de sous-populations spécifiques de lymphocytes. Cette étape est réalisée en premier lieu en utilisant un scalpel stérile pour découper les fragments de tissu en petits morceaux. Ensuite, la mixture tissulaire est transférée dans un tube de dissociation mécanique, où les fragments sont davantage homogénéisés en une suspension de cellules uniques.Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation pour une analyse en aval. En fin de compte, la cytométrie en flux peut être utilisée pour analyser les lymphocytes infiltrant la tumeur, ainsi que leurs sous-populations. Mon laboratoire a mis au point cette technique car nous recherchions un moyen d'observer les lymphocytes infiltrant la tumeur sans affecter considérablement leur état natif.Nous souhaitions disposer d'une méthode permettant d'isoler rapidement les cellules et de les analyser telles qu'elles se présentaient lors de l'intervention chirurgicale. Cette technique a été utilisée sur plus de 300 tumeurs mammaires et tissus normaux dans notre laboratoire, est facile à mettre en œuvre et peut être utilisée quotidiennement. Elle permet d'examiner des marqueurs pronostiques, la réponse au traitement et l'évolution clinique à long terme.Aujourd'hui, cette technique sera démontrée par John Nicola Loic, technicien dans mon laboratoire. Commencez par peser l'échantillon de tissu, puis mesurez sa longueur, sa largeur et sa hauteur. Transférez ensuite le fragment de tissu dans une petite boîte de Pétri contenant un millilitre de milieu cellulaire hématopoïétique défini chimiquement et sans sérum, et utilisez un scalpel stérile pour découper les échantillons en petits morceaux de un à deux millimètres carrés.Ensuite, transférez le contenu de la boîte dans un tube C de dissociation mécanique et rincez la boîte et le scalpel avec deux millilitres de milieu. Ajoutez le rinçage au tube C, puis exécutez deux fois de suite le programme de dissociation mécanique 0.01 afin d'homogénéiser délicatement les fragments de tissu en une suspension monocellulaire. Après le deuxième cycle, versez délicatement l'homogénat à travers un filtre cellulaire de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, utilisez le même piston pour pipette afin de rincer la boîte de Pétri et transférer tout liquide restant dans le tube C vers le filtre à cellules. Puis, utilisez une micropipette de un millilitre pour transférer le liquide filtré dans un tube conique de 15 millilitres et rincez le tube C avec trois millilitres supplémentaires de milieu. Transférez ce rinçage à travers le filtre à cellules dans le tube de 50 millilitres.Ensuite, déplacez délicatement le tissu non homogénéisé dans le filtre à l’aide d’une pointe propre de un millilitre afin d’expulser la quantité maximale de liquide résiduel piégé dans le tissu vers le tube de 50 millilitres. Placez maintenant le filtre à cellules retourné au-dessus du tube C d’origine et rincez le filtre avec trois millilitres supplémentaires de milieu, de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C. Réalisez une nouvelle homogénéisation du tissu pendant deux cycles supplémentaires comme vient de l’être démontré, puis versez cet homogénat secondaire à travers le filtre à cellules.De nouveau, rincez le tube C avec trois millilitres supplémentaires de milieu. Ensuite, filtrez le surnageant à travers le tamis et exprimez le liquide résiduel du tissu comme vient de l'être démontré. À ce stade, un volume d'environ 2,5 millilitres de suspension de cellules isolées devrait être présent dans le tube de 15 millilitres, et environ neuf millilitres devraient être observés dans le tube de 50 millilitres.Pour séparer le surnageant tissulaire des cellules, centrifuger d'abord les deux tubes d'homogénat pendant 15 minutes à 600 G et à température ambiante, puis verser délicatement le surnageant du tube de 15 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre, le placer à quatre degrés Celsius, et jeter le surnageant du tube de 50 millilitres. Ensuite, taper doucement chaque tube sur une surface dure afin de disperser les culots cellulaires. Redisperser le culot cellulaire lâche dans le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de milieu, puis transférer les cellules dans le tube de 15 millilitres pour redisperser le second culot.Ensuite, rincez le tube de 50 millilitres avec encore 500 microlitres de milieu et transférez le rinçage dans le tube de 15 millilitres pour une récupération maximale des cellules. Après avoir dénombré le nombre de cellules viables par exclusion au bleu de trypan, mettez en pellet le suspense cellulaire. Enfin, centrifugez le surnageant tissulaire réservé.Ensuite, transférez soigneusement le surnageant vers au moins un tube propre sans toucher ni perturber le culot, puis stockez-le à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures en aval. Sur ces graphiques, des dot plots représentatifs de cytométrie en flux provenant d'homogénats de cellules tumorales dissociées, suivis d'un marquage par des anticorps spécifiques dirigés contre les marqueurs des leucocytes et des cellules épithéliales, sont présentés comme illustré. Ce protocole n'altère pas significativement la viabilité des cellules positives pour CD 45.Cependant, on observe une perte considérable de cellules viables positives pour EPAM. Malgré cela, les sous-populations viables positives pour EPAM et positives pour CD45 peuvent être séparées en fonction de leur taille et de leur structure en grandes cellules tumorales épithéliales, petites cellules épithéliales, ou cellules positives pour CD45 de grande et petite taille. Des histogrammes représentatifs de cytométrie en flux des principales sous-populations infiltrant la tumeur sont présentés ici, les lymphocytes étant sélectionnés en fonction de la viabilité des cellules positives pour CD45.Enfin, l'expression des cytokines ou les immunoglobulines totales présentes dans le surnageant de cancer du sein peuvent être comparées au surnageant de tissu mammaire normal, révélant, comme le montre cette expérience représentative, une augmentation des deux types de protéines associées au tissu tumoral. Bien que la procédure soit simple, il est important de se rappeler de travailler rapidement et avec soin, et de récupérer la quantité maximale de matériel à chaque étape du protocole afin d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour l'analyse finale.

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit la dissociation non enzymatique de tissus humains frais pour obtenir des cellules viables. La technique est utilisée pour l’analyse qualitative et quantitative des cellules CD45 positives (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins.

Dissociation mécanique : une méthode pour obtenir des cellules viables à partir d’un tissu

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

L’isolement des cellules stromales des ganglions lymphatiques est une procédure en plusieurs étapes comprenant la digestion enzymatique et la désagrégation mécanique pour obtenir des cellules réticulaires fibroblastiques, des cellules endothéliales lymphatiques et sanguines. Dans la procédure décrite, une digestion courte est combinée à une désagrégation mécanique automatisée pour minimiser la dégradation des marqueurs de surface des cellules stromales viables des ganglions lymphatiques.

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ce protocole produit un nombre suffisant de lymphocytes résidents de la peau humaine viables pour l’analyse cytométrique en flux et la culture ex vivo.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes.  Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Les procédures expérimentales pour l’extraction ultérieure des tissus lymphatiques pour tester l’activation des cellules dendritiques lymphoïdes sont décrites après traitement d’un nanomatériau immunostimulante.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Il s’agit d’une méthode pour isoler les cellules lymphoïdes utérines de souris gestantes et non enceintes. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples applications en aval telles que le phénotypage FACS, le tri cellulaire, les tests fonctionnels, la séparation de l’ARN et la protéomique. Le protocole montre ici comment phénotyper les cellules lymphoïdes innées utérines du groupe 1 par cytométrie en flux.

Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Découvrez une méthode de dissociation non enzymatique rapide pour homogénéiser des fragments de tissus humains frais en suspension cellulaire unique. Cette technique préserve l'état natif des lymphocytes infiltrants pour analyse par cytométrie en flux.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l'analyse des lymphocytes infiltrant

Explorer plus de vidéos