Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

L'objectif général de l'expérience suivante est de montrer la migration de lymphocytes T effecteurs non adhérents sur une monocouche de cellules tumorales adhérentes. Cette expérience est réalisée en deux étapes : premièrement, une monocouche de cellules tumorales adhérentes est établie dans les puits de lames en téflon recouvertes de poly-D-lysine ; deuxièmement, des lymphocytes T effecteurs marqués au fluorochrome sont déposés au centre de la monocouche à l’aide d’un dispositif de sédimentation cellulaire. Ensuite, la migration des cellules non adhérentes sur la monocouche est visualisée par microscopie optique et en fluorescence.

Les résultats montrent que la migration et les fonctions effectrices des lymphocytes T non adhérents en co-culture avec une monocouche de cellules tumorales adhérentes sont conservées après la transduction des lymphocytes par un vecteur rétroviral. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la possibilité de mesurer la migration radiaire de lymphocytes T effecteurs non adhérents en co-culture avec des cellules tumorales adhérentes. Ces résultats ont des implications importantes pour les patients atteints de tumeurs cérébrales primitives ou métastatiques, car des lymphocytes T cytotoxiques allogéniques modifiés pour exprimer un gène activateur de pro-drogue, tel que la cytosine désaminase, sont actuellement évalués dans une approche multimodale visant à éliminer les tumeurs cérébrales.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à établir des monocouches de cellules tumorales adhérentes en raison de l'hétérogénéité de la croissance des cellules tumorales concernant leurs caractéristiques d'adhérence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes permettant d'obtenir une monocouche tumorale uniforme et une sédimentation efficace des L-O-C-T-L non adhérents nécessitent une compréhension expérimentée des caractéristiques des deux types cellulaires. Pour commencer, placer jusqu'à quatre éléments stérilisés.

10 lames en téflon avec puits dans une boîte de Petri stérile de 150 millimètres par 15 millimètres. Placer une boîte de Petri de 35 millimètres par 10 millimètres contenant deux à trois millilitres d'eau stérile à côté des lames afin d'assurer l'humidité. Ensuite, préparer les lames en recouvrant chaque puits d'une solution de 100 microgrammes par millilitre de poly-D-lysine ou de poly-L-lysine.

Incubez les lames pendant une heure à température ambiante, puis aspirez la solution et rincez deux fois la surface du puits avec du PBS en utilisant les puits d'échantillon préparés. Récoltez les cellules tumorales adhérentes à partir d'un flacon confluent. Comptez le nombre de cellules viables par microscopie optique, puis suspendez les cellules à une concentration de cinq fois dix puissance six cellules par millilitre.

Dans un milieu de croissance tamponné, ajouter de cinq à dix microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits, selon le type de cellule tumorale, compléter le volume des puits à 40 microlitres avec du milieu et pipeter lentement plusieurs fois afin de répartir uniformément les cellules. Après avoir ensemencé les puits, laisser les cellules tumorales se déposer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, poser le couvercle sur la boîte de Pétri et transférer délicatement celle-ci dans une étuve humidifiée à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, et incuber pendant au moins 24 heures.

Changer le milieu de culture des puits quotidiennement en retirant soigneusement une partie du milieu de la monocouche et en le remplaçant par un volume plus important de milieu complet pour lymphocytes T. Les cellules atteignent généralement la confluence en un à trois jours afin de préparer les cellules pour leur sédimentation sur la monocouche de cellules tumorales. Récolter les lymphocytes T non adhérents et les marquer avec un colorant de prolifération cellulaire selon le protocole du fabricant au moins une heure avant le test.

Placez ensuite la chambre humidifiée contenant les lames de cellules tumorales dans la hotte de sécurité biologique. Lavez les puits avec du PBS à l’aide d’une pipette, puis ajoutez 45 microlitres de milieu complet contenant 10 % de sérum dans les puits. Faites glisser un manifold stérilisé de sédimentation cellulaire au-dessus des puits jusqu’à ce que le crochet situé à l’extrémité du manifold touche le fond de la lame.

Vérifiez que le milieu est visible dans les canaux du collecteur. Ensuite, comptez les cellules non adhérentes et suspendez-les à une à deux fois 10 à la puissance 5 cellules par microlitre dans le milieu.

Dispersez délicatement les cellules afin d'éliminer tous les agrégats cellulaires qui pourraient interférer avec la sédimentation. Pipetez lentement un microlitre de la suspension cellulaire dans chaque canal du collecteur, puis incubez l'appareil à température ambiante pendant 20 à 30 minutes pour permettre aux cellules présentes dans le canal de se déposer sur la monocouche.

Une fois les cellules sédimentées, soulevez délicatement le collecteur verticalement sans toucher la lame. Assurez-vous que les pastilles de cellules se trouvent bien à l'intérieur du périmètre du canal du collecteur. À l'aide d'un microscope, les cellules fixées doivent adhérer légèrement à la monocouche de sorte que le déplacement doux de la lame n'entraîne pas la dispersion de la pastille.

Après avoir confirmé que les cellules se sont sédimentées, transférez la lame vers un microscope inversé équipé d'une chambre à dioxyde de carbone et d'humidité. Utilisez l'objectif 4 x pour l'imagerie en champ clair et en fluorescence multicanal des cellules. Acquérez des images d'une zone donnée en champ clair et dans les canaux fluorescents, puis ajoutez des barres micron avec le logiciel de capture d'images.

Conserver la lame dans un incubateur humidifié entre les différents points temporels une fois que tous les points temporels ont été acquis. Glisser et déposer les fichiers d'image dans le logiciel de retouche d'image et sélectionner l'option d'ajout de calque afin de créer un fichier image comportant plusieurs calques. Fusionner les images en lumière visible et les images en fluorescence en un seul calque.

Utilisez le logiciel d'acquisition pour prendre des images d'une zone de huit millimètres sur huit millimètres. Le logiciel doit être configuré pour assembler automatiquement les images capturées en utilisant le canal le mieux représenté sur l'ensemble du puits. Si seuls les canaux de fluorescence sont imagés, il s'agit du canal destiné à l'imagerie des cellules adhérentes.

Alternativement, les images peuvent être assemblées à l'aide d'un logiciel de retouche d'images. Cette opération consiste à aligner les régions des images qui sont conservées d'une image à l'autre et à superposer les images les unes sur les autres jusqu'à l'obtention d'une image complète. Assemblez les images ensemble à l'aide du logiciel d'images.

Utilisez les images combinées pour créer des cartes de fluorescence d'intensité de surface à l'aide du logiciel Image J afin de visualiser l'agrégation ou la dispersion des lymphocytes T au fil du temps. Des lymphocytes T cytotoxiques allogéniques humains, appelés Allo CTL, transduits avec un vecteur rétroviral à réplication compétente codant pour un gène d'expression de la protéine fluorescente verte émeraude, ont été déposés au centre d'une monocouche de cellules de gliome. Après quatre heures, les Allo CTL avaient formé des agrégats visibles au bout de 24 heures.

Des zones vides sont apparues dans la monocouche de cellules adhérentes, indiquant une lyse des cellules tumorales et une migration de certains CTL allo au-delà du bord avant. Des CTL allo murins marqués de façon fluorescente ont été placés au centre d'une monocouche de cellules de gliome marquées de façon fluorescente ; une heure plus tard, les CTL allo étaient étroitement associés aux cellules de gliome. Au bout de 48 heures, les CTL allo avaient migré en dehors du centre de la surface de la monocouche. Des cartes de fluorescence ont été générées à partir de ces images à l’aide du logiciel ImageJ et montrent une migration importante en provenance du centre après 48 heures.

Il est important de changer quotidiennement le milieu de culture de la monocouche de cellules tumorales afin de maintenir des conditions de culture saines. En outre, une fois maîtrisée, la sédimentation des cellules non adhérentes devrait prendre environ 20 minutes selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que le traçage du trajet cellulaire, peuvent être utilisées pour répondre à des questions concernant la vitesse à laquelle les CTL allogéniques migrent à travers la monocouche ou la durée pendant laquelle ils sont en contact avec les cellules tumorales lors de l'exécution de leurs fonctions cytotoxiques.

Ce protocole aidera les chercheurs dans le domaine de l'immunogénie thérapeutique à explorer la migration de lymphocytes T modifiés génétiquement en co-culture avec des cellules tumorales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des cellules non adhérentes et adhérentes pour la co-culture, ainsi que de l'utilisation du collecteur de sédimentation cellulaire pour étudier la migration radiaire horizontale des cellules non adhérentes au-dessus d'une monocouche de cellules tumorales.