Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

L’objectif global de l’expérience suivante est de montrer la migration des lymphocytes T effecteurs non adhérents sur une monocouche de cellules tumorales adhérentes. Ceci est réalisé en établissant d’abord une monocouche de cellules tumorales adhérentes dans les puits de lames masquées en téflon recouvertes de lysine poly D comme un effecteur marqué par fluorescence dans un deuxième temps, les lymphocytes T sont sédimentés au centre de la monocouche à l’aide d’un collecteur de sédimentation cellulaire. Ensuite, la microscopie optique et la microscopie à fluorescence sont utilisées pour visualiser la migration des cellules non adhérentes sur la monocouche.

Les résultats montrent que les fonctions de migration et d’effecteur des lymphocytes T non adhérents en co-culture avec une monocouche de cellules tumorales adhérentes sont maintenues après que les lymphocytes ont été transduits avec un vecteur rétroviral. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que la migration radiale des lymphocytes T effecteurs non adhérents peut être mesurée dans une culture de charbon avec des cellules tumorales adhérentes. Cela a des implications considérables pour les patients atteints de tumeurs cérébrales primaires ou métastatiques, car les lymphocytes T cytotoxiques allogéniques qui sont modifiés pour exprimer un gène pro-activateur de médicaments, tel que la cytosine désaminase, sont testés en tant qu’approche multimodale pour éliminer la tumeur dans le cerveau.

En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal à établir des monocouches de cellules tumorales adhérentes en raison de l’hétérogénéité de la croissance des cellules tumorales dans les caractéristiques d’adhésion. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes permettant de générer une monocouche tumorale uniforme et une sédimentation efficace de L-O-C-T-L non adhérents nécessitent une compréhension expérimentée des caractéristiques des deux types de cellules. Pour commencer, placez jusqu’à quatre stérilisés.

Lames recouvertes de téflon à 10 puits dans une boîte de Pétri stérile de 150 millimètres sur 15 millimètres. Placez une boîte de Pétri de 35 millimètres sur 10 millimètres contenant deux à trois millilitres d’eau stérile à côté des lames pour fournir de l’humidité. Ensuite, précocez les lames en recouvrant chaque puits d’une solution de 100 microgrammes par millilitre de lycine poly D ou de lysine poly L.

Incuber les lames pendant une heure à température ambiante, puis aspirer la solution et rincer la surface du puits deux fois avec du PBS avec les puits d’échantillon préparés. Récoltez un flacon confluent de cellules tumorales adhérentes. Comptez le nombre de cellules viables par microscopie optique, puis suspendez les cellules à une concentration de cinq fois 10 à six cellules par millilitre.

Dans un milieu de croissance tamponné, ajoutez cinq à 10 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits, selon le type de cellule tumorale, portez le volume du puits jusqu’à 40 microlitres avec le milieu et pipetez lentement de haut en bas pour répartir uniformément les cellules. Après avoir ensemencer les puits, laissez les cellules tumorales se déposer à température ambiante pendant 30 minutes. Placez ensuite le couvercle sur la boîte de Pétri et transférez-la soigneusement dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, incubez pendant au moins 24 heures.

Changez quotidiennement le milieu de culture sur les puits en retirant soigneusement une partie du milieu de la monocouche et en le remplaçant par un plus grand volume de milieu de cellules T complet frais. Les cellules confluent généralement en un à trois jours pour préparer les cellules à la sédimentation sur la monocouche de cellules tumorales. Récoltez les lymphocytes T non adhérents et étiquetez-les avec un colorant de prolifération cellulaire selon le protocole du fabricant au moins une heure avant le test.

Ensuite, placez la chambre humidifiée contenant les lames de cellules tumorales dans l’enceinte de sécurité biologique. Lavez les puits avec du PBS par pipetage, puis ajoutez 45 microlitres de milieu complet avec 10 % de sérum dans les puits. Faites glisser un collecteur de sédimentation cellulaire stérilisé sur les puits jusqu’à ce que le crochet à l’extrémité du collecteur touche le bas de la lame.

Assurez-vous que le fluide est visible dans les canaux collecteurs. Comptez ensuite les cellules non adhérentes et suspendez-les à une à deux fois 10 puissance cinquième. Cellules par microlitre dans le milieu.

Perturbez doucement les cellules pour éliminer tout amas de cellules qui interféreraient avec la sédimentation cellulaire. Pipetez lentement un microlitre de suspension cellulaire dans le canal du collecteur pour chacun. Ensuite, incubez l’appareil à température ambiante pendant 20 à 30 minutes pour permettre aux cellules du canal de se déposer sur la monocouche.

Une fois que les cellules se sont tassées, soulevez doucement le collecteur vers le haut sans toucher la lame. Assurez-vous que les pastilles de la cellule ont été placées dans la circonférence du canal du collecteur. À l’aide d’un microscope, les cellules assises doivent adhérer légèrement à la monocouche afin que le déplacement doux de la lame ne disperse pas la pastille.

Après avoir vérifié que les cellules se sont sédimentées, transférez la lame dans un microscope inversé équipé d’une chambre à dioxyde de carbone et d’humidité. Utilisez l’objectif quatre x pour l’imagerie fluorescente en fond clair et multicanal des cellules. Acquérez des images d’une zone donnée en fond clair et en canaux fluorescents, puis ajoutez des barres de microns à l’aide d’un logiciel de capture d’image.

Rangez la lame dans un incubateur humidifié entre les points temporels une fois que tous les points temporels sont acquis. Faites glisser et déposez les fichiers image dans le programme d’édition d’images et sélectionnez l’option Ajouter un calque pour créer un fichier image avec plusieurs calques. Fusionnez la lumière et les images fluorescentes en une seule couche.

Utilisez le logiciel d’acquisition pour prendre des photos d’une zone de huit millimètres sur huit millimètres. Le logiciel doit être configuré pour assembler automatiquement les images capturées à l’aide du canal le mieux représenté dans l’ensemble du puits. Si seuls les canaux de fluorescence sont imagés, ce canal devrait être le canal d’imagerie des cellules adhérentes.

Alternativement, les images peuvent être assemblées à l’aide d’un logiciel de retouche d’images. Pour ce faire, il suffit d’aligner les régions des images conservées d’une image à l’autre et de superposer les images les unes sur les autres jusqu’à ce qu’une image complète soit générée. Assemblez les images à l’aide du logiciel d’imagerie.

Utilisez les images combinées pour créer des cartes de fluorescence d’intensité de surface avec le logiciel Image J afin de visualiser l’agrégation ou la propagation des cellules T fluorescentes dans le temps. Des lymphocytes T cytotoxiques allo-réactifs humains connus sous le nom d’Allo CTL transduits, avec un vecteur rétroviral compétent pour la réplication codant un gène d’expression de protéine fluorescente vert émeraude, ont été placés au centre d’une monocouche de cellules de gliome. Après quatre heures, tous les OCTL avaient formé des agrégats visibles au bout de 24 heures.

Des taches vides sont apparues dans la monocouche cellulaire adhérente, indiquant la lyse des cellules tumorales et une partie allo CTL avait migré au-delà du bord d’attaque. Des Allo CTL murins marqués par fluorescence étaient assis au centre d’une monocouche de cellules de gliome marquées par fluorescence de la grippe à une heure Allo CTL étroitement associé aux cellules de gliome par 48 heures, Allo CTL avait migré loin du centre de l’intensité de surface de la mono couche. Des cartes de fluorescence ont été générées à partir de ces images avec le logiciel d’image J et montrent une migration substantielle loin du centre après 48 heures.

Il est important de changer quotidiennement le milieu de culture pour la monocouche de cellules tumorales afin de maintenir des conditions de culture saines. De plus, une fois maîtrisée, la sédimentation des cellules non adhérentes devrait prendre environ 20 minutes Suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que le traçage du chemin cellulaire, peuvent être utilisées pour répondre à des questions sur la vitesse à laquelle les allo CTL migrent à travers la monocouche ou le moment où ils sont en contact avec les cellules tumorales remplissant leurs fonctions cytotoxiques.

Ce protocole aidera les chercheurs dans le domaine de l’immunothérapie génique à explorer la migration des lymphocytes T génétiquement modifiés en co-culture avec des cellules tumorales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des cellules non adhérentes et adhérentes par co-culture et comment utiliser le collecteur de sédimentation cellulaire pour étudier la migration radiale horizontale des cellules non adhérentes sur la monocouche de cellules tumorales.