Name: Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Découvrez des méthodes reproductibles pour évaluer l'engagement précoce des cellules T FH spécifiques du virus chez la souris. Ces protocoles combinent cytométrie en flux et manipulation génique rétrovirale pour optimiser la conception vaccinale.

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Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32300785 à X.C.), du Programme national postdoctoral de Chine pour les talents innovants (n° 100). BX20230449 à X.C.) et le Grand projet national en sciences et technologie (n° 2021YFC2300602 à L.Y.).

Déchiffrer l’engagement précoce des lymphocytes T auxiliaires folliculaires dans l’infection aiguë à LCMV

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La recherche dans le domaine des lymphocytes TFH a été mise en évidence depuis la découverte de la fonction spécialisée des lymphocytes TFH dans l’aide aux lymphocytes B. De plus en plus d’études ont indiqué que la différenciation des cellules TFH est un processus en plusieurs étapes et multifactoriel30, dans lequel l’engagement du destin des cellules TFH est déterminé à un stade précoce5. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux lymphocytes TFH différenciés précocement est cruciale pour la biologie des lymphocytes TFH et la conception rationnelle de vaccins. Dans ce document, nous avons fourni des méthodes pour accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et pour manipuler l’expression génique dans les cellules TFH différenciées précocement en exploitant le modèle d’infection virale LCMV Armstrong, la souris SM transgénique TCR et la transduction médiée par le rétrovirus.
Le récepteur des chimiokines CXCR5 est un marqueur de surface important qui distingue les cellules TFH des autres sous-ensembles de cellules TH CD4+ 6,7,8,31, nécessitant ainsi la méthode de coloration CXCR5 de haute spécificité et sensibilité dans la recherche sur les cellules T FH. Dans l’étude, une méthode de coloration en trois étapes de la streptavidine-biotine CXCR5 a été présentée pour identifier le sous-ensemble de cellules TFH (Figure 1C). Bien que la perte de spécificité soit un problème épineux pour les approches de coloration d’anticorps à deux ou trois streptocoques de haute sensibilité, il a été constaté que le signal de fluorescence par coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes chevauchait presque complètement le signal GFP dans les lymphocytes T SM CD4+ rapporteurs CXCR5-GFP29 le 3e jour après l’infection (Figure 1D), suggérant l’obtention de la spécificité et de la sensibilité par la méthode de coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes. En effet, cette stratégie de coloration CXCR5 à trois streptocoques a fait ses preuves et a aidé les chercheurs à mieux étudier la biologie des cellules TFH 11,14,15,21 ainsi que d’autres types de cellules T exprimant CXCR5 29,32.
Lors de l’infection et de l’immunisation, l’engagement du destin des lymphocytes TFH est généralement modélisé par une différenciation bifurquée des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes TFH ou en lymphocytes TH effecteurs non TFH 2,3,30. Cette étude a mis en évidence la bifurcation équilibrée des cellules TFH et TH1 dans les cellules T SM CD4+ transférées. De plus, ces lymphocytes T SM CD4+ transférés ont une quantité cellulaire adéquate au stade précoce de l’infection, agissant ainsi comme un modèle approprié pour étudier la différenciation des lymphocytes TFH. Certes, l’expression ectopique de Bcl-6 médiée par le rétrovirus dans les lymphocytes T CD4+ CD4+ transférés était fortement biaisée en faveur de la différenciation des lymphocytes TFH par rapport à celle des lymphocytes T CD4+ SM témoins (86,6 % contre 53,8 %) (Figure 3C), ce qui est aligné avec le rapportprécédent 6 et prouve une fois de plus l’exactitude des protocoles décrits dans l’étude. Alternativement, les protocoles susmentionnés peuvent également être appliqués à l’inactivation médiée par le rétrovirus de gènes intéressés (par exemple, bcl6, Tcf7) dans les cellules T SM CD4+ 11 activées précocement (données non présentées).
L’une des limites du protocole est le problème de synchronisation (plus de 2 h au total) et le processus en plusieurs étapes de la méthode de coloration CXCR5 en trois étapes. Alternativement, des méthodes de coloration CXCR5 en une étape18,33 ou en deux étapes 4,9,34 ont également été appliquées dans la recherche sur les cellules TFH. Une comparaison de la spécificité/sensibilité de ces méthodes de coloration CXCR5 est justifiée.
En résumé, l’étude actuelle a fourni des protocoles permettant d’accéder à des cellules TFH spécifiques du virus différenciées précocement et d’étudier le(s) gène(s) intéressé(s) qui régulent potentiellement la différenciation des cellules TFH . Ces protocoles alimenteront les investigations sur l’engagement précoce du destin des cellules TFH .

Lorsqu’ils rencontrent différents agents pathogènes ou menaces, les lymphocytes T CD4+ naïfs adaptent leurs réponses immunitaires en se différenciant en divers sous-ensembles de lymphocytes T auxiliaires (TH) dotés de fonctions spécialisées1. Dans le scénario d’une infection virale aiguë, une grande partie des lymphocytes T CD4+ naïfs se différencient en lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) qui aident les lymphocytes B 2,3. Distinctes des autres sous-ensembles de cellules TH CD4+ (p. ex., cellules TH1, TH2, TH9 et TH17), les cellules TFH expriment un niveau substantiel de CXCR5, qui est le récepteur de la chimiokine à tête chercheuse des cellules B CXCL13, permettant aux cellules TFH de migrer dans les follicules des cellules B. Dans les follicules des cellules B, les cellules TFH aident les cellules B apparentées à initier et à maintenir les réactions du centre germinal, permettant ainsi une production rapide d’anticorps de haute affinité et une mémoire humorale à long terme 2,3.
Lors d’une infection virale aiguë, l’engagement précoce du devenir des lymphocytes TFH spécifiques du virus se produit dans les 72 h 4,5 et est contrôlé par le répresseur transcriptionnel lymphome-6 à cellules B (Bcl-6)5,6,7,8, qui agit comme le « régulateur principal » régissant les décisions de destin des cellules TFH. La carence en Bcl-6 ralentit sévèrement la différenciation des cellules TFH, tandis que l’expression ectopique de Bcl-6 favorise considérablement l’engagement du destin des cellules TFH. En plus de Bcl-6, plusieurs molécules sont impliquées dans l’instruction de l’engagement précoce du destin des cellules TFH. Les facteurs de transcription TCF-1 et LEF-1 initient la différenciation des cellules TFH via l’induction de Bcl-6 9,10,11. L’inhibition de Blimp1, à la fois par Bcl-6 et TCF-1, est nécessaire pour l’engagement précoce du destin des cellules TFH 11,12. STAT1 et STAT3 sont également nécessaires à la différenciation précoce des cellules TFH 13. De plus, les modifications épigénétiques par l’histone méthyltransférase EZH214,15 et la méthyltransférase m6A METTL316 aident à stabiliser les programmes transcriptionnels des cellules TFH (en particulier Bcl6 et Tcf7) et donc à amorcer l’engagement précoce du destin des cellules TFH. Bien que des progrès, y compris les molécules susmentionnées et d’autres, résumées ailleurs3, aient été réalisés dans la compréhension des régulations transcriptionnelles et épigénétiques de l’engagement précoce des cellules TFH, des molécules jusqu’alors inconnues restent à apprendre.
Dans le modèle murin d’infection par le virus de la chorioméningite lymphoïde aiguë (LCMV), les lymphocytes T CD4+ congéniques SMARTA (SM) transgéniques transférés par adoption, qui reconnaissent spécifiquement l’épitope de la glycoprotéine LCMV I-ABGP66-77, SUBISSENT UNE DIFFÉRENCIATION CELLULAIRE TFH ou TH1 au cours de l’infection virale. Ce modèle de différenciation de la bifurcation TFH/TH1 soutient l’avancement du modèle d’infection SM/LCMV aiguë dans l’étude de la biologie des cellules TFH spécifiques du virus. En effet, le modèle d’infection SM/LCMV aiguë a été largement utilisé dans le domaine de la recherche sur les cellules TFH et a joué un rôle crucial dans des découvertes marquantes en biologie des cellules TFH. Cela comprend l’identification de Bcl-6 susmentionné comme facteur de transcription définissant la lignée des cellules TFH 5,6, ainsi que d’autres facteurs transcriptionnels importants (par exemple, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 et Itch19) guidant la différenciation des cellules TFH, les régulations post-transcriptionnelles ( par exemple, METTL316 et miR-17~9220) de la différenciation des cellules TFH, de la mémoire et de la plasticité des cellules TFH 21,22 et des stratégies de vaccination rationnelles ciblant les cellules TFH (par exemple, le sélénium23).
La présente étude décrit des méthodes reproductibles pour accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus, y compris (1) l’établissement d’un modèle de souris chimère SM infectée par un LCMV aigu adapté à l’accès aux cellules TFH différenciées précocement, (2) la réalisation de colorations par cytométrie en flux de molécules associées aux cellules TFH différenciées précocement, et (3) la manipulation de gènes basée sur des vecteurs rétroviraux dans SM CD4+ lymphocytes T. Ces méthodes seront utiles pour les études portant sur l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde Fix Solution, 4 % PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; passoire à cellules m</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-souris TCR V&alpha ; 2 (clone B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-souris CD45.1 (clone A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>APC anti-souris CD25 (clone PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. souris SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotine anti-souris F4/80 Anticorps (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Biotine Rat anti-souris CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Biotine Rat anti-souris CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Biotine Rat anti-souris CD8a (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Biotine Rat anti-souris NK-1.1 (clone PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Biotine Rat anti-souris TER-119/Cellules érythroïdes (clone TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>albumine sérique bovine, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-souris CD279 (-1) (clone 29F.1A12)</td><td>Biolegend</td><td>135220</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>souris C57BL/6J (B6)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>souris rapporteure</td><td></td><td></td> <td>knock-in CXCR5-GFPEn interne ; la ligne de souris knock-in CXCR5-GFP a été générée par l’insertion d’une construction IRES-GFP après le cadre de lecture ouvert de Cxcr5.</td></tr><tr><td>DMEM 10 % medium</td><td></td><td></td><td>Medium DMEM contenant 10 % de FBS</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (version 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>Le kit contient trois réactifs : a. Concentré de fixation/perméabilisation (4X) ; b. Diluant de fixation/perméabilisation ; c. Tampon de perméabilisation.</td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-rat de chèvre (H+L),</td><td>laboratoires de vecteurs</td> biotinylés <td>BA-9400-1.5</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>d’isolation FACS contenant 0,5 % de BSA et 2mM EDTA</td></tr><tr><td>LCMV peptide GP61-77 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)</td><td>Chinese Peptide Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes proche infrarouge fixable, pour excitation 633 ou 635 nm</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-souris CD69 (clone H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>PE Souris anti-Bcl-6 (clone K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>dilution 1:50</td></tr><tr><td>Phosphate tamponné salin, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Purifié Rat Anti-Souris CXCR5 (clone 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>dilution 1:50</td></tr><tr><td>Rat monoclonal PerCP anti-souris CD4 (clone RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>souris recombinante IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2 %</td><td>RPMI 1640 medium contenant 2 %</td><td></td><td></td> FBS</tr><tr><td>SMARTA (SM) TCR souris transgénique</td><td></td><td></td><td>La lignée transgénique SM TCR dans notre laboratoire est un don du Dr Rafi Ahmed (Université Emory). De plus, cette lignée de souris peut également être obtenue auprès du Jackson Laboratory (colorant # : 030450).</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> de coloration <td>PBS contenant 2 % de FBS et 0,01 % de NaN3</td></tr><tr><td>Streptavidine PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (conjugué Alexa Fluor 488)&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>6444S</td><td>dilution 1:400</td></tr><tr>Tampon <td></td><td></td><td>de coloration cellulaire TFH</td><td>Tampon FACS contenant 1 % de BSA et 2 % de sérum</td></tr><tr><td>de souris Réactif TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

accès à la différenciation précoce des lymphocytes t cd4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le lcmv aigu

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Les lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) sont perçus comme une lignée de lymphocytes T CD4+ indépendante qui aide les lymphocytes B apparentés à produire des anticorps de haute affinité, établissant ainsi une immunité humorale à long terme. Au cours d’une infection virale aiguë, l’engagement du destin des lymphocytes TFH spécifiques du virus est déterminé au début de la phase d’infection, et l’étude des lymphocytes TFH différenciés précocement est cruciale pour comprendre l’immunité humorale dépendante des lymphocytes T et optimiser la conception du vaccin. Dans l’étude, à l’aide d’un modèle murin d’infection par le virus de la chorioméningite lymphoïde aiguë (LCMV) et de la souris SMARTA (SM) transgénique TCR avec des lymphocytes T CD4+ reconnaissant spécifiquement l’épitope de la glycoprotéine LCMV I-AbGP66-77, nous avons décrit des procédures permettant d’accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus sur la base de colorations par cytométrie en flux. De plus, en exploitant la transduction rétrovirale des lymphocytes T SM CD4+ , des méthodes permettant de manipuler l’expression génique dans les lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement sont également fournies. Par conséquent, ces méthodes aideront aux études explorant le(s) mécanisme(s) sous-jacent(s) à l’engagement précoce des cellules TFH spécifiques du virus.

Caractéristiques des lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement au cours d’une infection aiguë par le LCMV Afin de sonder l’engagement précoce des lymphocytes TFH spécifiques du virus, des lymphocytes T congéniques SM CD4+ naïfs qui reconnaissent spécifiquement l’épitope I-AbGP66-77 du LCMV ont été transférés adoptivement chez des receveurs CD45.2+ C57BL/6. Le lendemain, ces receveurs ont été infectés par voie intraveineuse avec une forte dose du LCMV Armstrong, à résolution aiguë (figure 1A). Le 3e jour après l’infection, les splénocytes des receveurs du vaccin C57BL/6 ont été analysés par cytométrie en flux, et les résultats ont indiqué une grande quantité de lymphocytes T CD4+ CD4+ SM transférés (~10 % du total des lymphocytes T CD4+) (figure 1B), ce qui a fourni un nombre suffisant de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus pour un examen plus approfondi. D’autres analyses des lymphocytes T CD4+ SM transférés ont montré une co-expression de CXCR5 et Bcl-6/TCF-1 et une expression réciproque de CXCR5 et CD25/T-bet, définissant ainsi les lignées TFH (CXCR5+Bcl-6+ ou CXCR5+TCF-1+) et TH1 (CXCR5-CD25+ ou CXCR5-T-bet+) (Figure 1C). Pour évaluer la spécificité et la sensibilité de la coloration des anticorps CXCR5 présentée dans l’étude, nous avons ensuite croisé la lignée de souris CD45.1+ SM susmentionnée avec la lignée de souris knock-in CXCR5-GFP, qui a été générée par l’insertion d’une construction IRES-GFP après le cadre de lecture ouvert de Cxcr529. Ensuite, des cellules SM rapporteures CD45.1+ CXCR5-GFP ont été transférées dans des receveurs C57BL/6. Ces receveurs ont été infectés par le LCMV Armstrong, et leurs splénocytes ont été analysés le 3e jour suivant l’infection. En effet, le signal de fluorescence de la méthode de coloration des anticorps CXCR5 dans l’étude chevauchait finement le signal GFP dans les cellules T CD4+ 29 SM rapporteures CXCR5-GFP transférées au jour 3 de l’infection (Figure 1D), indiquant la grande spécificité de la méthode de coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes.
Surexpression de Bcl-6 basée sur le rétrovirus dans les lymphocytes T CD4+ SM Bcl-6 est l’une des molécules les plus importantes dans la promotion de la différenciation des cellules TFH 6,7,8. Afin de déterminer la fiabilité du protocole actuel pour l’accès aux lymphocytes TFH différenciés précocement, les lymphocytes T CD4+ CD4+ SM CD4+ ont été activés et transduits in vivo avec un surnageant rétroviral à partir de cellules 293T transfectées par plasmide de surexpression du plasmide MigR1 ou de cellules 293T de surexpression de MigR1-Bcl6 (Figure 2 et Figure 3A). Les lymphocytes T SM CD4+ transduits par le rétrovirus ont ensuite été transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6, qui ont ensuite été infectés par le LCMV Armstrong (figure 3B). Le 3e jour après l’infection, nous avons constaté une bifurcation équilibrée des lymphocytes TFH et TH1 dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-SM, tandis qu’une différenciation prédominante dirigée parles lymphocytes T CD4+ MigR1-Bcl6-SM (Figure 3C). De manière constante, le niveau d’expression de Bcl-6 a été augmenté dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-Bcl6-SM par rapport à celui dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-SM (Figure 3D). Par conséquent, le phénotype selon lequel ladifférenciation 6 des cellules TFH induite par l’expression ectopique de Bcl-6 a été finement reproduit selon le protocole actuel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> Figure 1 : Analyses par cytométrie en flux de l’engagement précoce du devenir des cellules SM TFH au cours de l’infection par le LCMV Armstrong. (A) Conception expérimentale. Des lymphocytes T CD4+ spléniques ont été prélevés sur des souris CD45.1+ SM, puis transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6 (CD45.2+). Le lendemain, ces receveurs ont été infectés par le LCMV Armstrong. Le 3e jour après l’infection, les cellules CD45.1+ SM transférées de la rate des receveurs ont été analysées par cytométrie en flux. (B) Données représentatives de cytométrie en flux montrant la stratégie de déclenchement des lymphocytes T CD45.1 SM CD4+ transférés à partir de la rate des receveurs au 3e jour de l’infection par le LCMV Armstrong. (C) Des données représentatives de cytométrie en flux montrant des co-coloration de CXCR5 et d’autres molécules associées aux cellules TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 et T-bet) dans les cellules SM CD45.1+ transférées de la rate des receveurs au 3e jour de l’infection par LCMV Armstrong. (D) Données représentatives de cytométrie en flux montrant des co-coloration de l’anticorps conjugué à la fluorescence contre CXCR5 et le signal GFP dans les cellules SM rapporteures CD45.1+ CXCR5-GFP transférées de la rate des receveurs au 3e jour après l’infection par LCMV Armstrong. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> Figure 2 : Transduction rétrovirale dans les lymphocytes T CD4+ SM. (A) Schéma de principe de la production et de la transduction rétrovirales dans les lymphocytes T CD4+ SM. Pour la production de rétrovirus, les cellules 293T ensemencées dans une plaque à 6 puits ont été transfectées avec des plasmides d’ADN cibles lorsque la densité cellulaire atteint ≥80 % de confluence. Ensuite, un surnageant de culture cellulaire contenant des rétrovirus a été prélevé 72 h après la transfection et immédiatement utilisé ou stocké à -80 °C. Pour la transduction rétrovirale dans les lymphocytes T CD4+ SM, une souris CD45.1+ SM a reçu une injection intraveineuse de 200 μg de peptide LCMV GP61-77. Ensuite, la rate a été disséquée chez la souris SM 16 à 18 h après l’injection peptidique, et l’état d’activation des lymphocytes T CD4+ spléniques a été détecté. Les lymphocytes T CD4+ SM activés ont été transduits avec un surnageant de culture contenant des rétrovirus et cultivés in vitro pendant 48 h avant d’accéder à l’efficacité de transduction. (B) Imagerie par microscopie à fluorescence de la GFP dans les cellules 293T transfectées par l’ADN plasmidique. Barre d’échelle : 400 μm. (C) Analyse par cytométrie en flux des niveaux d’expression de CD25 et CD69 dans des lymphocytes T CD4+ naïfs de souris naïves (naïves, à gauche) ou de lymphocytes T CD4+ spléniques de souris SM injectées de peptide LCMV GP61-77 (activé, à droite). (D) Analyse par cytométrie en flux de l’expression de la GFP dans les lymphocytes T SM CD4+ transduits par rétrovirus (transduits, à gauche) ou les lymphocytes T SM CD4+ non transduits par rétrovirus (non transduits, à gauche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> Figure 3 : Effets de la surexpression de Bcl-6 dans l’engagement du destin cellulaire SM TFH. (A) Cartes linéaires des squelettes rétroviraux MigR1 (panneau en haut) et du vecteur MigR1 modifié avec la région CDS Bcl6 en amont de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (panneau inférieur). (B) Conception expérimentale. Les lymphocytes T SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6 ont été transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6 (CD45.2+) un jour avant le LCMV Armstrong. Le 3e jour après l’infection, les lymphocytes T CD45.1+ SM CD4+ transférés de la rate des receveurs ont été analysés par cytométrie en flux. (C) Analyse par cytométrie en flux de CXCR5 et CD25 dans les lymphocytes T GFP+ SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6. Les chiffres adjacents à la porte indiquent les fréquences des cellules TFH dans les cellules T SM CD4+. (D) Analyse par cytométrie en flux du niveau d’expression de Bcl-6 dans les lymphocytes T SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6. MFI, intensité moyenne de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.

Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

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Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4⁺ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

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