Name: Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Découvrez le traçage de lignée multicouleur des cellules épithéliales cornéennes chez la souris R26R-Confetti. Cette méthode permet de suivre la migration et la survie des cellules souches in vivo.

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RSF a reçu un financement du septième programme-cadre de l’Union européenne (FP7/2007-2013]) dans le cadre de la convention de subvention n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, ainsi que de la Fondation israélienne pour la science (218/14).

Déclaration éthique: Dans ce soin des animaux de l&#39;étude et l&#39;utilisation ont été conforme à la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local. 1. Choisissez une recombinase Cre Convient Exprimant souris de souche <ol><li> Rupture de la grande variété de lignées transgéniques Cre disponibles à l&#39;achat 26 et selon le tissu cible à étudier, pour choisir une souche de souris transgénique Cre dans laquelle le gène de la recombinase Cre est contrôlée par un promoteur qui est spécifique pour le tissu d&#39;intérêt. En cas de contrôle temporel est nécessaire, choisissez une ligne Cre inductible. Note: Nous avons choisi le inductible transgène Cre-K14 tamoxifène ERT d&#39;étiqueter spécifiquement les cellules souches / progénitrices épithéliales limbiques et la cornée 24. Notez qu&#39;il peut y avoir des différences entre les souches, comme Di Girolamo et ses collègues ont signalé la spécificité limbique sans expression de la cornée pour leur K14-Cre ERT 22. Un avantage à l&#39;utilisation de souris transgéniques inductibles Cre est qu&#39;il permet l&#39;induction de la lignée de traçage à des délais polyvalents. </li></ol> 2. Choisissez un Convient Strain Br souris <ol><li> Choisissez la cassette Br appropriée en fonction de la question de recherche et disponible en ligne Cre 16,18,20. <ol><li> Si une souche non-inductible Cre souris est utilisée, choisissez une cassette Br qui ne permet pas continues ADN inversions / excisions et donc donner naissance à des produits de dead-end (par exemple Br1.0 ou Br1.1) 16. </li></ol></li></ol> 3. Traverser les lignées transgéniques d&#39;intérêt <ol><li> Pour le protocole illustré ici, traverser la souche homozygote R26R-Confetti (Br2.1 / Br2.1) avec la souche homozygote Cre ERT (Cre ERT / Cre ERT) pour obtenir descendants hémizygotes (Br2.1 / +; Cre / +) qui sont prêts à mono-allélique lignée de traçage car ils contiennent tous un seul allèle Br2.1 et unseul allèle Cre. Remarque: Pour augmenter l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage, on pourrait générer des souris qui contiennent deux allèles (CRE Br2.1 / +; Cre / Cre), tandis que deux allèles Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) serait augmenter combinaisons de couleurs (comme détaillé dans 22). </li></ol> Induction 4. recombinase Cre Remarque: L&#39;administration de tamoxifène dans ces expériences a été effectuée par injection intraperitoneale tous les jours, pendant la durée de 3-4 jours, afin d&#39;induire la translocation de Cre recombinase ERT dans le noyau de la cornée limbique et tige de base positif K14 / progénitrices cellules épithéliales. Le protocole suivant peut être utilisé pour l&#39;injection de quatre souris. En variante, l&#39;application topique de tamoxifène à la surface oculaire donne un rendement plus élevé. La solution Tamoxifen peut être conservé dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. Chauffez la solution avant de l&#39;utiliser. <ol><li> Peser 100 mg de tamoxifène et le dissoudre dans 5 ml d&#39;huile de maïs àformer un / ml solution tamoxifène 20 mg. </li><li> Injecter 200 ul de tamoxifène (4 mg) à une solution par voie intraperitoneale des souris âgées de 8 semaines pendant 3-4 jours consécutifs. Remarque: La solution Tamoxifen peut être conservé dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. Chauffez la solution avant de l&#39;utiliser. </li><li> Pour une application topique: peser 60 mg de tamoxifène et le dissoudre dans 1 ml d&#39;huile de maïs pour former une / ml solution de 60 mg de tamoxifène. Vortex et définir la solution dans un bain d&#39;eau agité maintenu à 65 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne clair congé dans le bain jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Appliquer soigneusement 100 ul de la solution de tamoxifène à chaque surface oculaire de la souris. </li></ol></li></ol> 5. Préparation des tissus pour l&#39;imagerie <ol><li> Animaux de sacrifice en utilisant l&#39;isoflurane (2% vaporisés en oxygène) anesthésie (confirmer anesthésie appropriée par l&#39;absence de réflexes) suivie par inhalation de CO 2 à des moments appropriés après l&#39;injection tamoxifène et coltionner le tissu concerné. <ol><li> Pour ces expériences, énucléer yeux aux points de temps suivants: 1, 4, 8, 12, et 16 semaines après l&#39;injection tamoxifène. Atteindre l&#39;énucléation en utilisant pince courbe. Appuyez sur les paupières à l&#39;origine du globe oculaire pour le faire sortir de l&#39;orbite de l&#39;œil. Placez la pince derrière le globe oculaire en maintenant le nerf optique. Tirez doucement sur le globe oculaire et le détacher. Note: A ce stade, comme décrit ci-dessous, les tissus peuvent être préparés pour l&#39;analyse wholemount de cellules marquées. Sections de tissus congelés réguliers peuvent également être préparés, fixe en PFA et imagé comme décrit ci-dessous (voir la section 6 et 22). </li></ol></li><li> Placez chaque oeil dans une boîte de 60 mm rempli avec du PBS. </li><li> Sous un microscope stéréo à l&#39;aide de forceps détiennent l&#39;œil près du nerf optique avec la cornée vers le bas et utilisent un scalpel pour enlever le nerf optique, le muscle et le tissu conjonctif et de faire une petite incision dans la partie postérieure de l&#39;œil. </li><li> Avec des ciseaux de printemps attentivement l&#39;agrandircoupé en laissant la lentille pop et retirez l&#39;iris en utilisant une pince. </li><li> Aplatir la cornée en faisant des incisions radiales 4-5 à partir du centre vers la périphérie à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Utiliser un scalpel pour couper les tissus périphériques excès au-delà du limbe. </li><li> Fixer des cornées en PFA 4% pendant 10 min, puis les laver rapidement avec du PBS. </li><li> Incuber les échantillons avec DAPI pendant 10 minutes et laver rapidement avec du PBS. </li><li> Cornées de montage sur des lames de verre avec le côté épithélial vers le haut. Déposer une goutte de milieu de montage sur le dessus de la cornée et de la couverture d&#39;un couvercle en verre. Laissez sécher diapositives O / N en RT. Gardez diapositives à 4 ° C. </li></ol> 6. microscopie confocale et analyse d&#39;imagerie <ol><li> Utiliser un système de confocale spectrale qui permet la séparation des émissions YFP / GFP / PCP. Set excitation de fluorescence et de longueurs d&#39;onde d&#39;émission en fonction des protéines fluorescentes de la cassette Br. Choisissez la longueur d&#39;onde d&#39;excitation la plus appropriée pour chaque protéine visant à minimiser croixexcitation. Choisir les plages d&#39;émission étroites afin de minimiser la fuite des signaux provenant des différentes protéines. <ol><li> Pour la cassette Br2.1, utilisez la commande suivante mise en place de l&#39;excitation de fluorescence (ex) et d&#39;émission (em) comme point de départ: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, PCP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, et RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Afin de visualiser les zones grandes de tissus à haute résolution, l&#39;imagerie acquérir de tuiles. Pour les résultats présentés à la figure image de la totalité de la cornée par l&#39;obtention d&#39;une matrice de 12 x 12 images 2A-B, c.-à acquérir des champs 144 (512 x 512) à l&#39;aide de 4 canaux fluorescents dans chaque champ. Au total, la collecte de 576 images, puis de fusionner. </li><li> Pour explorer la localisation de cellules marquées dans différentes profondeurs et les structures du tissu, acquérir des images Z-stack de différentes régions d&#39;intérêt. Afin to l&#39;image toute la profondeur de la cornée, acquérir 8 sections optiques à 3 pm intervalles. Les vues orthogonales des sections recueillies ainsi que des projections d&#39;images sur la base des intensités maximales peuvent être construits en utilisant des logiciels d&#39;imagerie conventionnelles 24. </li></ol> 7. cornée blessures combinée avec le tamoxifène induction <ol><li> Anesthésier la souris avec de l&#39;isoflurane (2% vaporisé en oxygène) et d&#39;administrer des analgésiques (10 mg / kg Carpofen, injection sous-cutanée). Confirmez anesthésie appropriée par l&#39;absence de réponse à l&#39;orteil-pincement. </li><li> Peser 1 g de poudre tamoxifène et le dissoudre dans 5 ml de DMSO stérile pour produire 200 mg / ml de solution de concentration. </li><li> Chauffez la solution tamoxifène à 65 ° C dans un bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que la solution devient limpide. Conserver la solution dans le bain jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li><li> Appliquer une pommade oculaire à l&#39;oeil controlatéral non traitée pour éviter la déshydratation pendant l&#39;anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu&#39;il a retrouvé suffisamment conconscience de maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas les souris qui avaient subi oeil blessant à la compagnie d&#39;autres souris jusqu&#39;à guérison complète. Souris doit être étroitement surveillée après la blessure. Dans le cas où ils perdent plus de 10% de leur poids corporel, souffrent de l&#39;érosion de la cornée, ou de l&#39;inconfort, l&#39;expérience devrait être arrêtée. Répétez l&#39;administration de tous les analgésiques de 24 heures tout au long de toute l&#39;expérience. </li><li> Utiliser une seringue stérile, sans l&#39;aiguille attachée à elle; 200 ul de solution appliquer tamoxifène par voie topique sur toute la surface de la cornée d&#39;un œil de chaque souris. Remarque: Le liquide se solidifie rapidement la solution sur la surface de l&#39;oeil à la température ambiante. L&#39;effet de la lésion de la cornée dépend de la gravité de la blessure. Suite à une application de solution Tamoxifen / DMSO pas d&#39;effets indésirables sont observés chez les souris. En cas d&#39;applications répétées opacité de la cornée peut être observée. </li><li> Continuer avec la préparation des tissus et de l&#39;imagerie (voir sections 5 et 6) à des moments pertinents. Pour les résultats présentés ici, le sacrifice des souris (comme détaillé dans l&#39;étape 5.1) après la blessure d&#39;une semaine (Figure 2 et 24). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Expériences de la lignée de traçage ont été menées depuis de nombreuses années. Les améliorations technologiques récentes et l&#39;émergence des souches de souris Confetti ont ouvert de nouvelles pistes de recherche. Aujourd&#39;hui, les chercheurs peuvent bénéficier d&#39;un grand nombre de lignes disponibles dans le commerce Cre tissu-spécifiques, souris knock-out et des souris transgéniques. Ceci constitue une opportunité pour la conception de systèmes expérimentaux polyvalente pour aborder les questions scientifiques ayant une expertise de base, en évitant la pratique laborieuse, tout en fournissant des données robustes et fiables. Souris R26R-Confetti sont un outil élégant pour le suivi efficace et l&#39;étude de la nature et le comportement des cellules dans un organisme vivant. Le système est facile à mettre en place et il permet le traçage lignée non-invasive de cellules isolées au cours de l&#39;embryogenèse, la régénération des cellules souches sous l&#39;homéostasie, ou dans des circonstances différentes, comme des blessures, l&#39;inflammation et le cancer. Les données obtenue fournit une descript robusteion de la survie des cellules cibles, l&#39;expansion clonale de cellules et la migration cellulaire, d&#39;une manière quantifiable. Une étape cruciale serait de choisir la souche de souris génétique approprié qui peut sûrement permettre un étiquetage spécifique des tissus efficace à un stade de développement précis. Une limitation de ce système est que, pour la surveillance d&#39;un organisme vivant, le tissu doit être accessible et transparent. De même, le suivi d&#39;un épais tissu dans un animal vivant peut être que facilitée par deux photons ou la microscopie multi-photon. Toutefois, le suivi de la cellule est possible sur des coupes de tissus post-mortem et peut-être le tissu intact peut être étudiée après qu&#39;elle a été transformée pour devenir transparent par le procédé de CLARTE 32,33. Une autre limite à prendre en compte est que, bien que les cellules adjacentes qui expriment le même fluorophore appartiennent vraisemblablement la même lignée clonale, il est également possible qu&#39;ils peuvent être dérivés d&#39;origine cellulaire indépendante qui exprime de façon aléatoire le même gène fluorescent. Cette PossiblesTy devient très peu probable lorsque vous utilisez plusieurs allèles Br pour permettre de nombreuses combinaisons de couleurs. Dans le futur, combinant le système Confetti avec des outils génétiques disponibles (c.-à-KO, modèles knock et souris transgéniques) permettra l&#39;étude des gènes et leurs mutations en matière de santé et de la pathologie. De même, la lignée de traçage sous différentes perturbations du système (c.-à enrayer la destruction de niche cellulaire, laser ablation à médiation cellulaire, traitement de la toxicomanie) va apporter de nouvelles idées sur l&#39;implication des voies dans les décisions du destin de la signalisation cellulaire. En fin de compte, l&#39;utilisation combinatoire de marquage fluorescent et bioluminescence, les journalistes génétiques des voies de signalisation et de coupe microscopie bord fournira aux chercheurs un système robuste d&#39;apprendre comment les cellules seule répondre à leur environnement dans leur environnement natif.

Pendant le développement embryonnaire, le tissu et la morphogenèse d&#39;organes ont lieu grâce à un programme précis qui peut être décrite en termes de prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la spécification de la lignée 1-4. Ces processus biologiques sont également impliqués dans le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire adulte, qui nécessite endiguer la régénération cellulaire. Le traçage de Lineage, l&#39;identification et le suivi de la descendance d&#39;un type spécifique de la population de la cellule, fournit un outil important pour l&#39;étude de l&#39;embryogenèse et l&#39;homéostasie des cellules souches. En effet, il est de plus en plus utilisé dans de nombreux domaines de la recherche. En particulier, la lignée traçage est devenu un outil essentiel dans identifier l&#39;origine et le destin des cellules souches dans l&#39;homéostasie et le développement du cancer. En effet, il peut fournir des informations sur la façon essentielle la cellule se comporte dans le cadre de l&#39;organisme ou tissu intact, avec intervention minimale d&#39;expérimentation, à la différence de l&#39;isolement des cellules en culture et in vitro ou transplantatisur risquant d&#39;entraîner polarisation indésirable. Traditionnellement, les colorants tels que liposoluble carbocyanine, qui intègrent dans la membrane plasmique des cellules, ont été utilisées pour la lignée de traçage. Bien que ces types d&#39;expériences ont conduit à des découvertes majeures avec succès et de concepts séminales façonnés dans la biologie du développement 5,6, ils présentent certaines limites, notamment la difficulté de contrôler la spécificité des cellules cibles, l&#39;effet indésirable du colorant sur ​​le comportement des cellules et la dilution de l&#39;étiquette dans le temps. Nucléotidiques approches d&#39;étiquetage analogique ont permis de documenter l&#39;existence de slow-vélo &quot;label conservant cellules&quot; qui correspondent vraisemblablement à quiescent cellules souches 7,8. Toutefois, bien que cette technique pourrait démontrer la présence de cellules de cyclisme lente basé sur la cinétique de prolifération sur une période de temps limité, il ne pouvait pas fournir des indications importantes en ce qui concerne la fonctionnalité des cellules souches. Un optimale meth lignée de traçagedologie devrait minimiser l&#39;effet de l&#39;étiquetage sur les propriétés de la cellule marquée, ses descendants ou ses voisins. En outre, il serait bénéfique d&#39;avoir le contrôle sur l&#39;induction de l&#39;étiquetage, à savoir, d&#39;avoir la possibilité de marquer la population de cellules d&#39;intérêt à un stade et d&#39;une manière dépendant du temps ainsi que dans une seule cellule (clonale) manière. Procédé de marquage irréversible et stable qui est transmis à toute la descendance de la cellule fondateur est important de sorte que l&#39;étiquette serait maintenue dans le temps, et pas transféré aux cellules voisines. Plus récemment, des approches génétiques de marquage des cellules ont été développées. Dans ces systèmes, des promoteurs spécifiques de cellules peuvent être utilisés pour déclencher la recombinase Cre expression afin d&#39;éliminer un barrage-loxP flanquée et permettre l&#39;expression des gènes rapporteurs tels que la protéine fluorescente verte ou Β-galactosidase gènes rapporteurs 9-13. Cette approche permet non seulement le suivi des cellules et de leur progéniture, mais permet également de cellule estolation et caractérisation moléculaire. Suivi de cellule au niveau de la cellule unique est devenu possible grâce à l&#39;induction de l&#39;expression d&#39;un seul gène rapporteur fluorescent. Une limitation importante de ce système est le fait que lorsque seulement une très faible pourcentage de cellules est marqué, il est possible de séparer et de tracer des clones individuels. Pour surmonter cette limitation reporters multicolores peuvent être utilisés. Lors de l&#39;utilisation étiquetage multicolore, le suivi du sort différentielle des cellules voisines dans le même créneau peut être réalisé efficacement 14-17. Récemment, une variété de Brainbow (Br) allèles ont été développés pour les expériences de la lignée de traçage, ce qui permet une expression de multiples gènes stochastiques reporter fluorescentes en utilisant le / lox système Cre. Le système Cre / lox comprend la recombinase Cre enzyme, qui reconnaît et se lie à des séquences d&#39;ADN spécifiques tels que des sites loxP. Après la liaison de la recombinase Cre, recombinaison site spécifique se produit, ce qui provoque l&#39;élimination des séquences loxP flanquée resulting dans l&#39;expression aléatoire des différentes protéines fluorescentes (le mécanisme est décrit ci-dessous). Une variété de lignes Br sont disponibles pour l&#39;utilisation (voir les commentaires 16,18,19). Les principales différences entre les souches Br comprennent (i) des différences dans le nombre de gènes fluorescents inclus dans la cassette, allant de 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) à 4 (Br1.1, Br2.1) gènes fluorescents , (ii) la présence de sites lox réciproquement orientés pour permettre l&#39;inversion de gène (Br2.0-2.1), (iii) le type de sites lox utilisées, et (iv) l&#39;expression ou de silence de l&#39;expression du gène fluorescent avant l&#39;activation Cre. Le Br3 récemment établi propose un procédé amélioré de formation d&#39;image multicolore des neurones. Une des principales caractéristiques de cette transcription est qu&#39;il contient un nouvel ensemble de protéines photostables farnésylées fluorescentes, qui permettent à une coloration, même de la plus belle neuronal traite 20. Surtout, les différentes versions de cassettes Br peuvent contenir spécifique neuronale Thy1 promoter ou exprimée de manière ubiquitaire CAG (CMV). Enfin, alors que certains des souris transgéniques Br peut contenir un seul transgène Br, d&#39;autres peuvent consister en de multiples copies du transgène, ce qui permet la production d&#39;un nombre immense de possibilités de combinaisons de couleurs pour être exprimé dans chaque cellule (voir par exemple 16). Dans notre étude, nous avons utilisé la souris R26R-Confetti qui contient la cassette de 21 Br 2.1. Br2.1 est spécialement conçu pour permettre à des inversions de l&#39;ADN Cre-médiation et non seulement des excisions en raison de l&#39;orientation réciproque des sites loxP (Figure 1). Ainsi, ces événements inversion / excision qui conduisent à changement de couleur peuvent continuer aussi longtemps que Cre est présente 16. Pour cette raison, un système d&#39;expression inductible Cre temporelle est essentielle pour le suivi cellulaire fiable à l&#39;aide Br2.1. Comme le montre la Figure. 1, le Br2.1 contient un promoteur CAG omniprésente suivie par loxP flanquée Neo R -casseTTE, qui agit comme un barrage routier de la transcription, qui est suivie par 4 gènes rapporteurs fluorescents, l&#39;encodage pour verte (GFP), jaune (YFP), rouge (RFP) et cyan (CFP) des protéines fluorescentes, positionnés dans deux tandems. Pas de fluorescence est exprimé avant l&#39;activation Cre. L&#39;induction de la recombinase Cre provoque le retrait de la cassette néo-R permettant l&#39;expression statistique de l&#39;une des protéines fluorescentes 4 dans une cellule donnée. Le premier segment contient GFP-loxP flanquée et une YFP inversée, tandis que le second segment contient DP-loxP flanquée et un PCP inversée. Ces segments d&#39;ADN peuvent être inversés en continu (en utilisant loxP qui est en orientation inverse), ou excisés, aussi longtemps que la recombinase Cre est présente. Par conséquent, un transgène Cre transitoire et contrôlée doit être utilisé. La cassette Br2.1 fournit un excellent système pour distinguer entre les émissions se chevauchent sur l&#39;emplacement de signal: l&#39;expression de la YFP et RFP est cytoplasmique, la GFP est nucléaire et la PCP est lié à la membrane cellulaire. GFPet les émissions DP sont facilement séparés par microscopie à fluorescence conventionnelle. Afin de séparer les émissions YFP / GFP / PCP, un système d&#39;imagerie confocale spectrale est nécessaire. Au total, la cassette Br2.1 permet l&#39;expression spécifique aléatoire, inductible, et le tissu d&#39;un sur quatre gènes fluorescents distincts dans chaque cellule ciblée. En fait, quand un plus grand nombre de combinaisons de couleurs est nécessaire, on peut générer des souris homozygotes contenant 2 allèles de Br2.1, conduisant ainsi à l&#39;expression de 2 étiquettes de couleur pour chaque cellule et dans l&#39;augmentation du nombre de combinaisons possibles de couleurs à 10 22. Certaines des souches de souris Br permettre l&#39;expression d&#39;un plus grand nombre de combinaisons possibles de couleurs depuis de multiples copies de la cassette ont été intégrées dans leur génome 16. Cependant, dans la plupart des cas, les quatre combinaisons de couleurs fournis par un seul allèle Br2.1 sont suffisantes. Après le protocole fourni ici, on peut établir cette méthode en utilisant une configuration relativement simple de spectral microscopie avec peu ou pas de nécessité d&#39;un étalonnage. Ici, nous fournissons un protocole adaptable pour l&#39;utilisation de la souris R26R-confettis qui contiennent un seul allèle Br2.1, de la lignée de traçage expériences de l&#39;épithélium cornéen. Cette souche de souris transgénique a été utilisé pour étudier l&#39;origine et le devenir du côlon 21,23 et des cellules souches epitheliales cornéennes 22,24, la présence d&#39;une activité de cellules souches dans le cancer intestinal 25, et pour la caractérisation de rein podocytes dans glomérulosclérose segmentaire et focale (FSGS) 17.

<table><tbody><tr><td>R26R-Confetti souris transgéniques homozygotes pour la cassette Brainbow 2.1</td><td></td><td>Jackson souche #013731</td><td></td></tr><tr><td>K14-CreERT souris</td><td>Jackson</td><td>souche #005107</td><td></td></tr><tr><td>tamoxifène</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprieve 30</td><td>b.wt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>utilisé à une concentration de 4&#160 ; et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Monture Immu</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 Système confocal à balayage laser Meta relié à un microscope motorisé inversé (Axiovert 200M) équipé d’une platine motorisée</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Le chevauchement spectral entre GFP, YFP et CFG nécessite l’utilisation d’une imagerie spectrale qui permet la séparation des spectres d’émission des protéines fluorescentes. Ici, nous utilisons le microscope confocal spectral Zeiss LSM 510 Meta. Le détecteur Meta inclus dans ce système comporte 32 éléments de détection, chacun collectant des émissions à partir d’une bande d’ondes de 10 nanomètres. Cette technique, appelée « empreinte spectrale », permet à l’utilisateur de fixer les limites les plus adéquates pour le filtrage en bande d’ondes. Il existe une variété de systèmes confocaux spectraux qui peuvent être utilisés, notamment Leica SP5 (ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td></tr><tr><td>Zen 2009 Logiciel d’imagerie</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duratears-pommade pour les yeux</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour lineage tracing de cellules de la cornée utilisation du multi-couleurs souris rapporteur fluorescent

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Les expériences de traçage de lignées définissent l’origine, le destin et le comportement des cellules d’un tissu ou d’un organisme spécifique. Cette technique a été appliquée avec succès pendant de nombreuses décennies, révélant des découvertes fondamentales en biologie du développement. Plus récemment, il a été adopté par les biologistes des cellules souches pour identifier et suivre différentes populations de cellules souches avec une intervention expérimentale minimale. Les développements récents de la génétique de la souris, la disponibilité d’un grand nombre de souches de souris et les progrès de la microscopie fluorescente permettent de concevoir facilement de puissants systèmes de traçage de lignées pour divers tissus avec une expertise de base, à l’aide d’outils disponibles dans le commerce. Nous avons récemment tiré parti de cette puissante méthodologie pour explorer l’origine et le devenir des cellules souches à la surface de l’œil à l’aide de souris R26R-Confetti. Ce modèle propose un système génétique multicolore, pour l’expression de 4 gènes fluorescents de manière aléatoire. Nous décrivons ici les principes de cette méthodologie et fournissons un protocole adaptable pour la conception d’expériences de traçage de lignées ; spécifiquement pour l’épithélium cornéen ainsi que pour d’autres tissus.

Récemment, nous avons cherché à identifier l&#39;origine, la survie et la migration des cellules souches et les cellules progénitrices de l&#39;épithélium cornéen 24. L&#39;accumulation des données prend en charge le dogme que l&#39;épithélium cornéen est régénéré par cellules souches situées exclusivement dans la niche limbique, une zone en forme d&#39;anneau à la périphérie de la cornée. Cette théorie est soutenue par in vitro et in vivo de données, et par des preuves cliniques qui a fourni la base de pionnier qui a réussi souches limbiques thérapie cellulaire 27-29. Toutefois, ce sujet est resté très débattue dans les dernières années en raison d&#39;une étude basée sur les expériences de greffage limbiques qui suggéraient que le limbe de la souris ne participe pas au renouvellement de la cornée 30. Pour tester cette hypothèse intéressante, la lignée de traçage des expériences utilisant des souris R26R-Confetti ont été effectuées, à suivre le destin des cellules épithéliales souches / progénitrices limbiques et de la cornée sous conditions stables jusqu&#39;à 120 jours 24.Les yeux ont été énucléés et plats de montage cornées ont été analysés par fluorescence confocale spectrale de microscopie à balayage laser 10 et 120 jours après l&#39;injection tamoxifène. Comme prévu, les petites grappes sporadiques de cellules fluorescentes ont été observés tout au long de la surface oculaire 10 jours après l&#39;injection, tandis que 1-4 mois plus tard (figure 2B et 24), des stries allongées qui se prolongent à partir du limbe cornéen vers le centre développées lentement. Ce résultat suggère que la cornée est régénéré par des cellules qui migrent à partir du limbe vers le centre de la cornée. Ensuite, la régénération de la cornée dans des conditions blessant a été examiné. Afin de tester le sort de cellules de la cornée / limbiques K14-positifs sous blessant conditions tout en induisant suivi cellulaire efficace, nous a dissous le tamoxifène dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), ce qui provoque des lésions cornéennes lors de l&#39;application topique. De cette façon, nous avons réussi à induire une blessure légère si une application topique unique a été appliquée (figure 2C), mo<html> déclasser blessant si un traitement supplémentaire DMSO seul a été appliqué à la veille de tamoxifène induction ou une blessure grave lorsque DMSO seul a été appliqué par voie topique à 2 jours consécutifs avant le tamoxifène induction. En contraste avec les rayures minces limbiques qui se sont développées lentement et atteint le centre de la cornée dans les 4 mois en vertu de l&#39;état d&#39;équilibre, la migration cellulaire suite à une lésion a été rapide. Remarquablement, rayures limbiques longs et épais ont déjà été développés dans ces conditions, dans les 7 jours. Fait intéressant, la diversité des couleurs est parfois minime (figure 2D). Dans nos mains, parfois, principalement les globules rouges ont été identifiés dans l&#39;ensemble de la cornée, ce qui indique que la diversité de couleur peuvent être biaisées en faveur des fluorophores spécifiques. Ce biais indésirables peut être calibré par des essais de réponse à la dose comme indiqué précédemment dans Br1.0L 31 et 21 Br2.1. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Représentation schématique de la construction R26R-confettis. (A) La construction R26R-confetti contient un promoteur CAG pour les niveaux élevés d&#39;expression, un loxP (triangle noir) -flanked Neo R -roadblock et la cassette Brainbow2.1 au locus Rosa26 16,21. La cassette Brainbow2.1 comprend deux tête-à-queue dimères loxP flanquée. Un dimère se compose de protéine nucléaire localisée vert fluorescent (GFP) et un cytoplasmique protéine fluorescente jaune orientée inverse (YFP, l&#39;orientation inversée est désigné - PFY). Le second dimère contient DP et une membrane cytoplasmique-captif protéine fluorescente cyan orientée inverse (PCP, l&#39;orientation inversée est désigné - PFC) 16. (B - E) Lors de l&#39;activation recombinase Cre, différents excision et d&#39;inversion événements peuvent se produire; résultats possibles sont exemplified in B - E. L&#39;activité Cre induit réarrangement stochastique de la cassette conduisant à des déménagements de gènes et / ou les inversions et entraîne donc l&#39;expression aléatoire de l&#39;une des quatre protéines fluorescentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Figure 2. De la lignée de la cornée traçage dans l&#39;homéostasie et des blessures. R26R-confetti / souris K14-Cre ont été injectés avec 4 mg de tamoxifène comme indiqué dans le protocole. Dans l&#39;heure indiquée de points après l&#39;induction aplati cornées ont été imagées (A - B). La blessure de la cornée couplé avec Cre induction a été réalisée par application topique de tamoxifène dissous dans du DMSO (C - D). Mosaic Images obtenuespar multicanal carrelages microscopie confocale spectrale sont montré (A - D). Dans l&#39;homéostasie, rayures limbiques radiales de cellules migrantes lents étendues entre le limbe et le centre de la cornée. Ces bandes se développe lentement, pour atteindre le centre de la cornée dans les 4-5 mois (B). Des grappes de cellules de la cornée étaient évidents aussi bien (flèches blanches, B). En revanche, les grandes stries limbiques sont apparus dans une seule semaine dans des conditions blessant (C). Un exemple pour le biais de la diversité de couleur vers les globules rouges (D). La frontière de limbique-cornéen est annoté par une ligne pointillée. La barre d&#39;échelle est de 500 um. Abréviations: la PCP, la protéine fluorescente cyan; GFP, protéine fluorescente verte; DP, la protéine fluorescente rouge; YFP, protéine fluorescente jaune. Ce chiffre a été modifié depuis 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de</a>cette figure.

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

L'objectif général de cette méthode est de localiser et de suivre la migration, l'expansion et la survie des cellules souches et des cellules progénitrices dans l'épithélium cornéen. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules épithéliales cornéennes concernant l'homéostasie, la réparation tissulaire, le vieillissement et la pathologie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à mettre en place et qu'elle permet un traçage non invasif des lignées cellulaires de manière clonale.Pour commencer, sélectionnez d'abord une souche de souris transgénique Cree possédant un promoteur spécifique aux tissus et inductible afin de marquer les cellules progénitrices et les cellules souches de l'épithélium limbique et cornéen. La lignée K14 Cree ERT inductible à la tamoxifène est utilisée. Ensuite, choisissez la cassette brainbow appropriée en fonction de la question de recherche et de la lignée Cree disponible.Dans ce cas, la lignée Brainbow 2.1 est utilisée. Croisez la souche R 26 R confetti homozygote avec la souche K 14 Cree ERT homozygote afin de générer des souris possédant quatre couleurs de cellules positives pour K 14. Pour induire la recombinaison chez les souris transgéniques, commencez par peser 80 milligrammes de tamoxifène et dissolvez-les dans un millilitre d'huile de maïs par vortexage.Placer la solution dans un bain-marie agité, maintenu à 65 degrés Celsius jusqu'à dissolution complète, et la laisser dans le bain jusqu'à l'utilisation suivante pour anesthésier. Chez une souris hétérozygote Brainbow 2.1 Cree ERT âgée de huit semaines, vérifier la profondeur de l'anesthésie par une pincée du orteil, puis appliquer soigneusement 100 microlitres de la solution de tamoxifène sur chaque surface oculaire de la souris. L'application directe de tamoxifène assure une forte efficacité d'induction de Cree. Conserver toute solution résiduelle de tamoxifène à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant une semaine au maximum.Réchauffez la solution avant l'application, qui est répétée pendant trois jours consécutifs pour chaque souris. Dissolvez d'abord un gramme de poudre de tamoxifène dans cinq millilitres de diméthylsulfoxyde stérile. Pour obtenir une solution de 200 milligrammes par millilitre, placez la solution dans un bain-marie agité, maintenu à 65 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elle devienne limpide, et laissez-la dans le bain jusqu'à son utilisation.Ensuite, anesthésiez la souris et vérifiez la profondeur de l'anesthésie à l'aide d'une pincée du orteil, appliquez une pommade ophtalmique sur l'œil non traité de la souris pour le protéger de la déshydratation pendant l'intervention et administrez des analgésiques appropriés. Ensuite, aspirez 200 microlitres de la solution de tamoxifène dans une seringue sans aiguille fixée, puis appliquez-la localement sur toute la surface de la cornée de l'œil. Le liquide se solidifie sur le tissu à température ambiante.Surveiller la souris jusqu'à ce qu'elle maintienne une position sterno-abdominale et ne la remettre avec les autres qu'une fois qu'elle est complètement consciente. Après avoir sacrifié les souris aux moments appropriés suivant l'induction, pratiquer une blessure oculaire comme décrite dans le protocole textuel. Extraire l'œil en appuyant d'abord sur la paupière pour faire sortir le globe oculaire de son orbite.Glissez des pinces courbes derrière le globe oculaire pour maintenir le nerf optique et tirez doucement le globe vers le haut afin de le détacher. Placez chaque globe oculaire dans une boîte de 60 millimètres contenant du PBS. Placez la boîte contenant l’œil sous un microscope stéréo chirurgical.Assurez-vous de reconnaître la structure de base de l'œil, la cornée, le limbe et le nerf optique. Retirez le nerf optique, les muscles et les tissus conjonctifs entourant l'œil. Tenez l'œil par la partie postérieure avec la cornée dirigée vers le bas, puis pratiquez une incision dans la sclère à l'arrière du globe oculaire à l'aide de ciseaux à ressort. Agrandissez l'incision pour permettre l'extraction de la lentille et retirez l'iris à l'aide de forceps. Ensuite, effectuez quatre à cinq incisions radiales en coupant du centre vers la périphérie afin d'aplanir la cornée, puis retirez toute partie résiduelle de l'iris à l'aide d'une spatule fine et plate. Enfin, découpez le tissu périphérique excédentaire entourant le limbe pour fixer la cornée.Transférez le tissu disséqué dans une boîte de culture de 12 puits et incubez-le dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes. Lavez ensuite brièvement le tissu dans du PBS pour colorer les noyaux cellulaires. Incubez la cornée dans une solution de DPI à deux microgrammes par millilitre pendant 10 minutes, suivie d'un bref lavage dans du PBS.Ensuite, placez la cornée sur une lame de verre avec le côté épithélial vers le haut. Puis, déposez une goutte de milieu de montage sur la cornée et recouvrez-la d'une lamelle. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante et conservez-les à quatre degrés Celsius.Pour l'imagerie cornéenne, utilisez un système confocal spectral permettant la séparation des émissions de R-F-P-Y-F-P-G-F-P et de CFP. Réglez d'abord les longueurs d'onde de fluorescence, d'excitation et d'émission en fonction des protéines fluorescentes du cerveau. Bo cassette, en prenant soin d'éviter l'excitation croisée ou le recouvrement des signaux d'émission.Ensuite, acquérez des images en mosaïque afin de visualiser l'ensemble de la cornée en haute résolution. Ici, obtenez un ensemble de 12 sur 12 images dans les quatre canaux fluorescents. Enfin, fusionnez les images pour créer un lignage composite.Des expériences de traçage utilisant des souris R 26 R confetti ont été réalisées afin de suivre le destin des cellules progénitrices épithéliales limbiques et cornéennes. En conditions d'homéostasie, de petits groupes de cellules fluorescentes ont été observés 10 jours après l'induction, comme attendu. Après quatre mois, des stries s'étendant du limbe vers le centre de la cornée sont apparues, suggérant que les cellules migrent à partir du limbe pour régénérer la cornée suite à une lésion cornéenne.La migration à partir du limbe s'est produite rapidement, avec le développement de larges bandes épaisses au niveau du limbe en sept jours. Ce modèle est précieux pour suivre et étudier les cellules souches et progénitrices cornéennes dans différentes conditions. Il permettra d'analyser l'expansion clonale des cellules, leur survie et leur migration à l'état d'équilibre ainsi que dans des conditions de stress telles que les lésions, les brûlures chimiques, les mutations, et bien d'autres à l'avenir.Ce modèle peut également être utilisé pour analyser les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération cornéenne normale et pathologique. Cette technique pourrait contribuer à notre compréhension de diverses affections pathologiques telles que les dystrophies cornéennes, les brûlures et les traumatismes cornéens, ainsi qu'à l'évaluation de l'impact de différents traitements sur la régénération cornéenne, l'expansion cellulaire et la migration.

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Nous décrivons ici un modèle de souris rapporteure transgénique pour visualiser les cellules productrices d’IL-22 à l’intérieur de différents tissus de souris. Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’emplacement d’autres cytokines ou protéines de secrétaire chez la souris.

Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de marquage mosaïque qui permet la visualisation des neurones dérivées d'une cellule progénitrice commune en deux couleurs distinctes. Ceci facilite l'analyse de la lignée neuronale avec la capacité des neurones individuels naissance à jour et de la fonction du gène à étudier dans les mêmes neurones de différents individus.

Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l&#39;aide Twin-tache marcm

Cette méthode décrit l'utilisation du modèle de souris R26R-Confetti (Confetti) pour étudier les tissus minéralisés, couvrant toutes les étapes de la stratégie de reproduction aux acquisitions d'images. Inclus est un protocole général qui peut être appliqué à tous les tissus mous et un protocole modifié qui peut être appliqué aux tissus minéralisés.

Tracing génétique clonale à l'aide de la souris confettis pour étudier les tissus minéralisés

Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.

Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Un protocole pour effectuer le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau d’une seule cellule à l’aide de l’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) est présenté. L’analyse clonale de MADM fournit un cadre quantitatif pour mesurer le comportement prolifératif, la sortie cellulaire, et la relation de lignée des ancêtres individuels et de leurs cellules de fille.

Traçage de lignée et analyse clonale dans le développement du cortex cérébral à l’aide de l’analyse mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM)

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Découvrez le traçage de lignée multicouleur des cellules épithéliales cornéennes chez la souris R26R-Confetti. Cette méthode permet de suivre la migration et la survie des cellules souches in vivo.

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

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