Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

L’objectif global de cette méthode est de localiser et de suivre la migration, l’expansion et la survie des cellules souches et des cellules progénitrices dans l’épithélium cornéen. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules épithéliales cornéennes concernant l’homéostasie, la réparation des tissus, le vieillissement et la pathologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à établir et qu’elle permet un traçage non invasif de la lignée cellulaire de manière clonale.

Pour commencer, il faut d’abord sélectionner une souche de souris transgénique crie avec un promoteur tissulaire spécifique inductible pour marquer les cellules progénitrices de l’épithélium limbique et cornéen et les cellules souches. La gamme Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT est utilisée. Ensuite, choisissez la cassette brainbow appropriée en fonction de la question de recherche et de la ligne cri disponible.

Dans ce cas, la ligne Brainbow 2.1 est utilisée. Croisez la souche homozygote de confettis R 26 R avec la souche homozygote K 14 Cree ERT pour générer des souris avec quatre cellules K 14 positives pour induire la recombinaison chez les souris transgéniques. Pesez d’abord 80 milligrammes de tamoxifène et dissolvez-le dans un millilitre d’huile de maïs par vortexing.

Placez la solution dans un bain-marie agitant, maintenue à 65 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle se dissolve complètement, et laissez-la dans le bain jusqu’à la prochaine anesthésie. Une souris hétérozygote Brainbow 2.1 Cree ERT âgée de huit semaines, et vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec le pincement des orteils, appliquez soigneusement 100 microlitres de la solution de tamoxifène sur chaque surface oculaire de la souris. L’application directe de tamoxifène permet d’obtenir une efficacité élevée de l’induction Cree Conservez toute solution résiduelle de tamoxifène à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine.

Réchauffez la solution avant l’application, qui est répétée pendant trois jours consécutifs pour chaque souris. Dissoudre d’abord un gramme de poudre de tamoxifène dans cinq millilitres de diméthylsulfoxyde stérile. Pour produire une solution de 200 milligrammes par millilitre, placez la solution dans un bain-marie agitant, maintenez ses 65 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle devienne claire et laissez-la dans le bain jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

Ensuite, anesthésie la souris et vérifie la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un pincement des orteils, appliquez une pommade oculaire sur l’œil non traité de la souris pour le protéger de la déshydratation pendant la procédure et administrez des analgésiques adéquats. Ensuite, prélevez 200 microlitres de la solution de tamoxifène dans une seringue sans aucune aiguille attachée, et appliquez-la localement sur toute la cornée de l’œil. Le liquide se solidifie sur le tissu à température ambiante.

Occupez-vous de la souris jusqu’à ce qu’elle maintienne le sternal couché et ne la renvoyez à la compagnie des autres que lorsqu’elle est pleinement consciente. Après avoir sacrifié des souris à des moments appropriés après l’induction, une blessure à l’œil comme décrit dans le protocole de texte. Nucléez l’œil en appuyant d’abord sur la paupière pour faire sortir le globe oculaire de l’orbite.

Faites glisser la pince incurvée derrière le globe oculaire pour maintenir le nerf optique et tirez le globe oculaire vers le haut pour le détacher. Placez chaque globe oculaire dans une boîte de 60 millimètres contenant du PBS. Placez la plaque contenant l’œil sous un stéréomicroscope chirurgical.

Assurez-vous de reconnaître la structure de base de l’œil, de la cornée, du limbe et du nerf optique. Retirez le nerf optique, le muscle et le tissu conjonctif autour de l’œil. Tenez l’œil au niveau de la partie postérieure avec la cornée vers le bas et faites une incision dans la sclérotique à l’arrière du globe oculaire à l’aide de ciseaux à ressort.

Agrandissez la coupe pour permettre à la lentille de sortir et retirez l’iris avec une pince. Ensuite, faites quatre à cinq incisions radiales en coupant du centre vers la périphérie pour aplatir la cornée, puis retirez toutes les parties restantes de l’iris avec une fine spatule plate. Enfin, coupez l’excès de tissu périphérique entourant le limbe pour fixer la cornée.

Transférez le tissu disséqué dans une boîte à 12 puits et incubez-le dans 4 % de formaldéhyde pendant 10 minutes. Ensuite, lavez brièvement le tissu dans du PBS pour colorer les noyaux cellulaires. Incuber la cornée dans deux microgrammes par millilitre de solution DPI pendant 10 minutes, suivie d’un bref lavage au PBS.

Ensuite, placez la cornée sur une lame de verre avec le côté épithélial vers le haut. Placez ensuite une goutte de support de montage sur la cornée et couvrez-la d’une lamelle. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Pour l’imagerie cornéenne, utilisez un système confocal spectral qui permet de séparer les émissions R-F-P-Y-F-P-G-F-P et CFP. Réglez d’abord les longueurs d’onde de fluorescence, d’excitation et d’émission en fonction des protéines fluorescentes du cerveau. Bo, en prenant soin d’éviter l’excitation croisée ou le chevauchement des signaux d’émission.

Ensuite, acquérez des images en mosaïque pour visualiser l’ensemble de la cornée en haute résolution. Ici, obtenez un réseau d’images 12 par 12 dans les quatre canaux fluorescents. Enfin, fusionnez les images pour créer une lignée composite.

Des expériences de traçage à l’aide de souris confettis R 26 R ont été réalisées pour suivre le devenir des cellules progénitrices épithéliales limbiques et cornéennes. Dans des conditions d’état stationnaire, de petits groupes de cellules fluorescentes ont été observés 10 jours après l’induction, comme prévu. Après quatre mois, des traînées du limbe au centre de la cornée se sont développées, suggérant que les cellules migrent du limbe pour régénérer la cornée après une lésion cornéenne.

La migration à partir du limbe s’est produite rapidement, avec de longues et épaisses bandes limbiques se développant en sept jours. Ce modèle est précieux pour le suivi et l’étude des cellules souches et progénitrices cornéennes dans différentes circonstances. Il permettra d’étudier l’expansion, la survie et la migration des cellules clonales à l’état d’équilibre et dans des conditions de stress telles que les blessures, les mutations chimiques, etc.

Ce modèle peut également être utilisé pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération cornéenne normale et pathologique. Cette technique peut contribuer à notre compréhension de différentes conditions pathologiques telles que les dystrophies cornéennes, les brûlures et les traumatismes cornéens, et en plus de l’évaluation de l’impact de différents traitements sur la régénération cornéenne, l’expansion cellulaire et la migration.