Name: Développement dun Quantitative recombinase polymérase Lamplification Assay avec un contrôle positif interne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez le protocole d'amplification par polymérase recombinase quantitative pour quantifier l'ADN avec un contrôle positif interne. Cette méthode isotherme offre une alternative accessible au PCR en temps réel.

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Cette recherche a été financée par une subvention de la Fondation Bill &amp; Melinda Gates à travers les initiative Grands défis en santé mondiale.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
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<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Afin d&#39;obtenir des données de quantification significatives en utilisant l&#39;algorithme MATLAB, l&#39;utilisateur doit sélectionner des valeurs d&#39;entrée appropriées lorsque vous êtes invité. Après l&#39;ouverture de chaque script dans les sections 5 et 6, toutes les variables d&#39;entrée sont automatiquement sollicités dans la fenêtre de commande et sorties sont générés automatiquement. Dans la section 5.7 l&#39;utilisateur est invité à sélectionner un seuil de pente. La valeur du seuil de pente affecte le ca...

Quantitative amplification d&#39;acide nucléique est une technique importante pour la détection de l&#39;environnement, d&#39;origine alimentaire, et des agents pathogènes d&#39;origine hydrique ainsi que pour les diagnostics cliniques. PCR quantitative quantitative (qPCR) est la méthode de l&#39;étalon-or pour une détection sensible, spécifique et quantitative d&#39;acides nucléiques, par exemple pour le VIH-1 des tests de la charge virale, la détection des bactéries pathogènes, et le criblage pour de nombreux autres organismes 1 - 3. Au cours de qPCR en temps réel, des amorces amplifient l&#39;ADN de l&#39;agent pathogène dans les cycles, et un signal fluorescent est généré qui est proportionnel à la quantité d&#39;ADN amplifié dans l&#39;échantillon à chaque cycle. Un échantillon contenant une concentration inconnue de l&#39;ADN de l&#39;agent pathogène peut être quantifiée en utilisant une courbe standard qui concerne la concentration de l&#39;ADN initial des échantillons étalons et l&#39;heure à laquelle le signal fluorescent atteint un certain seuil (par exemple, le seuil de cycle ou CT). <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Parce que en temps réel qPCR nécessite un équipement de cyclage thermique coûteuse et plusieurs heures pour recevoir les résultats, les techniques d&#39;amplification isothermes alternatives, telles que l&#39;amplification recombinase polymérase (RPA), ont été développés 4. Ces plates-formes fournissent généralement des résultats plus rapidement et à amplifier des acides nucléiques, une seule température inférieure, ce qui peut être accompli avec moins coûteux, plus simple équipement. RPA, ce qui est particulièrement intéressant pour les applications de point de soins, amplifie l&#39;ADN en quelques minutes, nécessite une température amplification des basses (37 ° C), et reste actif en présence d&#39;impuretés 5,6. dosages de l&#39;APR ont été développés pour une large gamme d&#39;applications, y compris l&#39;analyse des aliments, la détection de pathogènes, le criblage de médicaments contre le cancer, et la détection des agents de bioterrorisme 7-12. Cependant, l&#39;utilisation de l&#39;APR pour la quantification d&#39;acides nucléiques a été limitée 13,14. Dans des travaux antérieurs, il était shoWN que temps réel RPA quantitative (QRPA) est réalisable 15. Ici, un protocole plus détaillé est fourni pour l&#39;utilisation en temps réel RPA quantitative de quantifier des échantillons inconnus en utilisant une courbe standard, une méthode qui est analogue à la quantification en utilisant qPCR. Ce protocole décrit comment effectuer une réaction de RPA sur un cycleur thermique pour détecter l&#39;ADN du VIH-1 comme une preuve de concept, ainsi que la façon de développer un contrôle positif interne (IPC) pour assurer que le système fonctionne correctement. La collecte de données en utilisant un cycleur thermique ou d&#39;un microscope et d&#39;analyse de données pour construire une courbe standard en utilisant des données de formation est également détaillée. Enfin, la méthode de quantification des échantillons inconnus en utilisant la courbe standard avec un script personnalisé est démontrée. Cette technique permet la quantification QRPA d&#39;échantillons avec des concentrations inconnues et a de nombreux avantages par rapport en temps réel traditionnelle qPCR.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 amorce directe</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp ;</td></tr><tr><td>HIV-1 amorce inverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G-3' &nbsp ;</td></tr><tr><td>Sonde VIH-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp ;</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp ;</td></tr><tr><td>Sonde IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp ;</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>Réactifs RPA exo (granulés, tampon de réhydratation, acétate de magnésium</td><td>TwistDx TwistAmp</td><td>exo</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes de tubes PCR</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>bandelettes de tubes à capuchon plat</td><td>PCR BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif micro-scellé</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>VIH-1 (pHIV-IRES-eYFP&Delta ; Env&Delta ; Vif et Delta ; Vpr)</td><td></td><td></td><td>plasmide personnalisé, voir : Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caractérisation et détection de lentivirus compétent pour la réplication artificielle de la gamme d’hôtes altérée. Thérapie moléculaire 8, 118&ndash ; 129, doi :10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>ADN génomique humain mâle</td><td>Applied Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 puits bloc froid</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Tris 1,0 M, pH 8,0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Développement IPC</td> Cryptosporidium <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>parvum Modèle IPC</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Il est également possible de commander une cible synthétique double brin auprès d’IDT si l’utilisateur n’est pas équipé pour travailler avec C. parvum (un agent infectieux BSL-2). Les amorces PCR et RPA pour C. parvum ont été conçues à l’aide du numéro d’accession GenBank AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR amorce longue avance</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>PCR longue amorce inverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>oligos d’ADN personnalisés</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X tampon</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à fluorescence vertical</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de scène</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température haute stabilité de précision à 1 canal</td><td>Outils Bioscience</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre FAM/GFP Jeu</td><td>de filtres Zeiss</td><td>38 (000000-1031-346)</td><td>excitation BP 470/40 nm, émission BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>Cube de filtre HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitation BP 530/30 nm, émission BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Découpeuse laser</td> Réseau <td>de graveur</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" acrylique noir</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm acrylique transparent</td><td>McMaster Carr</td><td>-72268940&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Super colle</td><td>Office Depot</td><td>Duro super glue&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale de qualité PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Analyse</td><td></td><td></td><td></td>des données</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Script : « JoVE_qRPA_standard_curve.m »</td><td>Inclus dans le script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB : « JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m »</td><td>Inclus dans le script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB : « JoVE_real_time_intensity_to_excel.m »</td><td>Inclus dans SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Inclus dans SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Inclus dans SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision logiciel</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Inclus dans SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un quantitative recombinase polymérase l&#39;amplification assay avec un contrôle positif interne

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Il a récemment été démontré que l’amplification par polymérase recombinase (RPA), une plate-forme d’amplification isotherme pour la détection d’agents pathogènes, peut être utilisée pour quantifier la concentration d’un échantillon d’ADN à l’aide d’une courbe standard. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour le développement et la mise en œuvre d’un test d’amplification de la recombinase polymérase quantitative en temps réel (test qRPA) est fourni. En utilisant la quantification de l’ADN du VIH-1 comme exemple, l’assemblage des réactions RPA en temps réel, la conception d’une séquence de contrôle positif interne (IPC) et la co-amplification de l’IPC et de la cible d’intérêt sont tous décrits. Des instructions et des scripts de traitement de données pour la construction d’une courbe standard à l’aide de données provenant de plusieurs expériences sont fournis, qui peuvent être utilisés pour prédire la concentration d’échantillons inconnus ou évaluer la performance du test. Enfin, une autre méthode de collecte de données de fluorescence en temps réel à l’aide d’un microscope et d’un appareil de chauffage de platine en tant qu’étape vers le développement d’un test qRPA au point de service est décrite. Le protocole et les scripts fournis peuvent être utilisés pour le développement d’un test qRPA pour toute cible d’ADN d’intérêt.

Avant de sélectionner une séquence de servir de la CIB dans les expériences QRPA avec la cible (VIH-1) de l&#39;ADN, le contrôle positif interne (IPC) candidats sont générés et criblés pour leur capacité à amplifier dans les réactions QRPA sans le VIH-1 ADN présent. IPC candidats sont plus longues que la cible (VIH-1) de l&#39;ADN pour empêcher la formation de l&#39;IPC hors compétition VIH-1 formation de amplicon. Comme le montre la figure 2A, la génération de deux C. candidats parvum...

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser la polymérase recombinase quantitative pour quantifier la concentration d'ADN d'échantillons inconnus. Cela est réalisé en ajoutant d'abord l'ADN cible, un contrôle interne positif, des amorces d'ADN et des sondes marquées fluorescentes à la réaction. Dans un deuxième temps, les réactions sont placées dans un thermocycleur en temps réel, qui chauffe les réactions afin d'activer les enzymes et surveille la fluorescence des sondes pour détecter la production d'amplimères cibles et de contrôle.Ensuite, les données fluorescentes sont analysées à l'aide d'un script afin de générer la courbe standard et de valider le test. Les résultats montrent que les échantillons d'ADN peuvent être quantifiés avec précision dans une plage d'un ordre de grandeur par rapport à la concentration correcte, selon les expériences de validation utilisées pour quantifier un ADN cible du VIH-1. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative en temps réel est que la RPA est isotherme, ce qui élimine le besoin d'un thermocycleur coûteux.La RPA nécessite également une température d'amplification plus faible, tolère les échantillons impurs, amplifie la cible jusqu'à des niveaux détectables en quelques minutes et utilise des enzymes lyophilisées permettant un transport et un stockage faciles à température ambiante. Pour commencer, nettoyez toutes les surfaces de la paillasse et des équipements avec une solution d'eau de Javel à 50 % afin de créer un espace de travail propre avant l'amplification, sortez la solution d'acétate de magnésium à 280 millimolaire, le tampon de réhydratation et les pastilles de réaction du congélateur à -20 degrés Celsius, puis laissez décongeler les solutions à température ambiante. Ensuite, préparez un mélange maître en transférant 383,5 microlitres du tampon de réhydratation dans un nouveau tube microfuge, ajoutez 41,6 microlitres d'eau sans nucléase au tampon et vortexez pour mélanger, puis ajoutez 35 microlitres d'acétate de magnésium dans un tube séparé.Remettez l'acétate de magnésium des solutions tampons de réhydratation dans le congélateur. Ensuite, récupérez l'amorce et la sonde quas dans le réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Placez-les dans l'espace de pré-amplification et éteignez les lumières afin de minimiser l'exposition à la lumière. Ajoutez 27,3 microlitres de chacune des amorces directe et inverse à 10 micromolaires au mélange maître.Ensuite, ajoutez 7,8 microlitres de la sonde ADN HIV 1D marquée à l'hex du stock de 10 micromolaire au mélange maître et vortexez le tube. Puis remettez les solutions stock de l'amorce et de la sonde au réfrigérateur. Les réactifs de contrôle interne positif peuvent être ajoutés ici, comme indiqué dans le protocole écrit, afin de préparer les réactions de QRPA. Placez d'abord les pastilles lyophilisées d'enzyme dans des tubes individuels par deux, dans des bandes de huit puits PCR à parois basses, puis pipetez 37,5 microlitres du mélange maître dans un tube contenant une pastille.Agiter doucement le contenu du tube à l’aide de la pointe de pipette pour dissoudre le culot sans créer de bulles. Retirer soigneusement la pointe de la réaction afin d’éviter toute perte de volume et veiller à changer les pointes de pipette entre chaque tube. Placer les tubes dans un bloc froid à 96 puits prérefroidi pendant au moins cinq minutes pour refroidir le mélange maître.Entre-temps, chargez le logiciel du thermocycleur avec le protocole et la disposition de la plaque indiquée dans le protocole écrit. Ensuite, découpez deux bandes d'adhésifs scellants transparents pour microplaque de manière à ce qu'elles soient légèrement plus larges que les tubes de PCR. Procurez-vous également deux couvercles plats pour bande de tubes PCR, et aliquotez le plasmide modèle VIH-1 comme indiqué dans le protocole écrit.Ensuite, ajoutez 10 microlitres du modèle au tube PCR approprié. Mélangez à nouveau délicatement le mélange à l’aide de la pointe de pipette. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’acétate de magnésium sur chaque bouchon de tube, puis placez délicatement les bouchons au-dessus des tubes de réaction de manière à ce qu’ils ne soient pas complètement fermés.L'acétate de magnésium doit être clairement visible à travers le bouchon. Placer les bandes de tubes PCR dans une microcentrifugeuse et centrifuger les tubes pendant 10 secondes afin de rassembler tout le liquide au fond des tubes et d'éliminer les bulles d'air. La combinaison de la solution d'acétate de magnésium avec le mélange maître initie la réaction de QRPA.Retirez rapidement les tubes PCR vers le bloc froid pour arrêter la réaction. Ensuite, retirez lentement les couvercles afin d'éviter de contaminer les réactions, puis scellez les tubes avec un film de scellement microscopique transparent. Transférez les tubes vers le thermocycleur selon les emplacements indiqués sur le schéma de la plaque.Fermez le couvercle du thermocycleur et cliquez sur démarrer l'exécution. Assurez-vous d'attribuer un nom de fichier à l'expérience une fois l'exécution terminée. Consultez les données brutes de fluorescence et exportez-les vers une feuille de calcul, ce qui créera un fichier appelé résultats d'amplification de quantification.Pour construire la courbe standard. Commencez par télécharger le script de la courbe standard, puis ouvrez MATLAB ou un programme d'analyse de données similaire. Ouvrez le script et appuyez sur exécuter pour lancer le script.Saisissez le nombre de fichiers de données à analyser lorsque vous y êtes invité. Ensuite, saisissez le nombre d'échantillons et le nombre de réplicats dans chaque fichier d'apprentissage, dans la fenêtre de commande.Saisissez la concentration d'ADN la plus faible exprimée en copies logarithmiques de base 10 ayant servi à établir la courbe standard, puis appuyez sur Entrée. Dans l'exemple présenté ici, la concentration la plus faible est d'une copie logarithmique de base 10.Ensuite, saisissez la différence de concentration entre chaque standard d'ADN dans l'invite de commande, puis appuyez sur Entrée ici. L'intervalle de concentration correspond à un logarithme de base 10 de copies. Saisissez ensuite la valeur du seuil de pente dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.Cette valeur est généralement comprise entre trois et cinq. Saisissez le nombre d'écarts types au-dessus du fond pour le seuil positif, également appelé Z, puis appuyez sur Entrée. Les valeurs typiques de Z varient de un à cinq. Ensuite, précisez l'équipement utilisé pour recueillir les données dans ce cas.Saisissez un pour le thermocycleur, puis appuyez sur Entrée. S'il existe un contrôle interne positif, sélectionnez la valeur par défaut ou une nouvelle valeur pour le seuil en saisissant O ou N selon qu'un nouveau seuil est nécessaire. Enfin, sélectionnez tous les fichiers de feuille de calcul qui seront utilisés pour établir la courbe standard.Le script importera ensuite automatiquement toutes les données et les analysera. Une PCR-RQ en temps réel a été réalisée sur des échantillons en double contenant différents nombres de copies d'ADN du VIH-1. L'apparition de l'amplification détectable, indiquée par une augmentation de la fluorescence, se produit plus tôt pour les échantillons ayant un nombre élevé de copies d'ADN que pour ceux ayant un nombre faible de copies. Les données brutes de fluorescence ont été utilisées pour générer une courbe standard à partir de l'amplification de concentrations connues d'ADN du VIH-1. Ces données ont été ajustées à une courbe exponentielle, et la valeur de R carré indique un excellent ajustement.La courbe standard a été utilisée pour prédire les concentrations d'échantillons d'ADN supplémentaires de concentration connue. Ajuster la valeur de Z à un permet une prédiction précise des faibles concentrations d'ADN. En revanche, les fortes concentrations d'ADN sont mieux prédites avec une valeur de Z égale à cinq.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la RPA ne possède pas de véritables cycles permettant de limiter la vitesse d'amplification de l'ADN. Par conséquent, la vitesse d'amplification doit être contrôlée avec précision. La reproductibilité entre les expériences est essentielle ; veillez donc à utiliser les mêmes aliquotes d'amorces pour toutes les expériences.Protégez les composants de la réaction contre la chaleur et la lumière. Ajoutez de l'acétate de magnésium immédiatement avant le début de la collecte des données, et maintenez les réactions dans le bloc réfrigéré jusqu'au démarrage. L'expérience.

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