Développement d'un Quantitative recombinase polymérase L'amplification Assay avec un contrôle positif interne

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser la simplification quantitative de la polymérase recombinase pour quantifier la concentration d’ADN d’échantillons inconnus. Ceci est réalisé en ajoutant d’abord le contrôle positif interne de l’ADN cible, des amorces d’ADN et des sondes marquées par fluorescence à la réaction. Dans un deuxième temps, les réactions sont placées dans la machine PCR en temps réel, qui chauffe les réactions pour activer les enzymes et surveille la fluorescence des sondes pour détecter la génération d’amplicons cibles et de contrôle.

Ensuite, les données fluorescentes sont analysées à l’aide d’un script pour générer la courbe standard et valider le dosage. Les résultats montrent que les échantillons d’ADN peuvent être quantifiés avec précision à un ordre de grandeur de la concentration correcte sur la base des expériences de validation utilisées pour quantifier un ADN cible du VIH. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative en temps réel, est que la RPA est isotherme, de sorte qu’un thermocycleur coûteux n’est pas nécessaire.

La RPA nécessite également une amplification plus faible à la température, est tolérante aux échantillons sales, amplifie la cible à des niveaux détectables en quelques minutes et utilise des enzymes légères pour permettre un transport et un stockage faciles à température ambiante. Pour commencer à nettoyer toutes les surfaces de la paillasse et de l’équipement avec une solution d’eau de Javel à 50 % afin de créer un espace de travail propre avant l’amplification, retirez la solution d’acétate de magnésium de 280 millimolaires, le tampon de réhydratation et les pastilles de réaction du congélateur à moins 20 degrés Celsius et décongelez les solutions à température ambiante. Ensuite, assemblez un mélange principal en transférant 383,5 microlitres de tampon de réhydratation dans un nouveau tube de micro-fuge à 41,6 microlitres d’eau sans nucléase dans le tampon et vortex pour mélanger à 35 microlitres d’acétate de magnésium dans un tube séparé.

Remettez l’acétate de magnésium dans les solutions de bouillon tampon de réhydratation au congélateur. Ensuite, procurez-vous l’amorce et les prob quas du réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Placez-les dans l’espace de préamplification et éteignez les lumières pour minimiser l’exposition à la lumière à 27,3 microlitres de chacune des 10 amorces micromolaires avant et arrière du mélange principal.

Ensuite, à 7,8 microlitres de l’hexagone de 10 micromolaires étiqueté HIV 1D NA. Sondez le mélange principal et vortex le tube. Ensuite, retournez l’amorce et les solutions mères de la sonde dans le stockage, des réactifs pour le contrôle positif interne peuvent être ajoutés ici, comme indiqué dans le protocole texte, pour assembler les réactions QRPA. Placez d’abord les pastilles d’enzymes lyophilisées dans des tubes individuels de deux bandelettes de tubes PCR de faible hauteur à huit puits, pipetez 37,5 microlitres du mélange principal dans un tube contenant une pastille.

Mélangez doucement le contenu du tube avec la pointe de la pipette pour dissoudre la pastille sans créer de bulles. Retirez soigneusement l’embout de la réaction pour éviter une perte de volume et pour vous assurer de changer les pointes de pipette entre chaque tube. Transférez les tubes dans un bloc froid réfrigéré à 96 puits pendant au moins cinq minutes pour refroidir le mélange principal.

Entre-temps, chargez le logiciel du thermocycleur avec le protocole et la disposition de la plaque est indiquée dans le protocole texte. Ensuite, coupez deux bandes d’adhésifs micros seal en plastique transparent de manière à ce qu’elles soient légèrement plus larges que les tubes PCR. Et obtenez également deux couvercles plats de tube PCR, aliquote le VIH un modèle plasmidique comme indiqué dans le protocole de texte.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres du modèle dans le tube PCR approprié. Encore une fois, remuez doucement le mélange avec la pointe de la pipette. Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres d’acétate de magnésium dans chaque bouchon de tube, puis placez doucement les bouchons sur les tubes de réaction afin qu’ils ne soient pas complètement scellés.

L’acétate de magnésium doit être clairement visible à travers le capuchon. Placez les bandelettes de tubes PCR dans une micro-centrifugeuse et centrifugez les tubes pendant 10 secondes pour recueillir tout le liquide au fond du tube et éliminer les bulles. La combinaison de la solution d’acétate de magnésium avec le mélange maître déclenche la réaction QRPA.

Retirez rapidement les tubes PCR dans le bloc froid pour arrêter la réaction. Ensuite, retirez lentement les couvercles pour éviter de contaminer les réactions et scellez les tubes avec un film d’étanchéité micros transparent. Transférez les tubes dans le thermocycleur en fonction des emplacements dans la disposition des plaques.

Fermez le couvercle du thermocycleur et cliquez sur Démarrer l’exécution. Veillez à désigner un nom de fichier pour l’expérience une fois l’exécution terminée. Visualisez les données brutes de fluorescence et exportez-les vers une feuille de calcul qui créera un fichier appelé résultats d’amplification de quantification.

Pour construire la courbe standard. Tout d’abord, téléchargez le script de courbe standard, puis ouvrez MATLAB ou un programme d’analyse de données similaire. Ouvrez le script et appuyez sur exécuter pour l’exécuter.

Saisissez le nombre de fichiers de données à analyser lorsque vous y êtes invité. Ensuite, tapez le nombre d’échantillons et le nombre de répétitions dans chaque fichier d’apprentissage. Dans la fenêtre de commande.

Tapez la concentration d’ADN la plus faible en 10 copies logarithmiques qui a été utilisée pour construire la courbe standard et appuyez sur Entrée. Dans l’exemple ici. La concentration la plus faible est d’un log basé sur 10 copies.

Tapez ensuite la différence de concentration entre chaque étalon d’ADN dans l’invite de commande et appuyez sur Entrée ici. L’intervalle de concentration est d’un log basé sur 10 copies. Ensuite, entrez la valeur du seuil de pente dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.

Cette valeur est généralement comprise entre trois et cinq. Tapez le nombre d’écarts-types au-dessus de l’arrière-plan pour le seuil positif, également appelé Z, puis appuyez sur entrer la plage de valeurs Z typiques de un à cinq. Ensuite, spécifiez l’équipement qui a été utilisé pour collecter les données dans ce cas.

Tapez un pour le thermocycleur, puis appuyez sur Entrée. S’il existe un contrôle positif interne, sélectionnez la valeur par défaut ou une nouvelle valeur pour le seuil en tapant Y ou N selon qu’un nouveau seuil est nécessaire ou non. Enfin, sélectionnez tous les fichiers de feuille de calcul qui seront utilisés pour construire la courbe standard.

Le script importera et analysera ensuite automatiquement toutes les données. Une QRPA en temps réel a été réalisée sur des échantillons en double contenant différents numéros de copie de HIV 1D NA. Le début de l’amplification détectable indiquée par une augmentation de la fluorescence se produit plus tôt pour les échantillons avec un nombre de copies d’ADN plus élevé que pour les échantillons avec un nombre de copies plus faible. Les données brutes de fluorescence ont été utilisées pour générer une courbe standard à partir de l’amplification des concentrations connues de VIH 1D NA. Ces données ont été ajustées à une courbe exponentielle, et la valeur R au carré indique une qualité élevée de l’ajustement.

La courbe standard a été utilisée pour prédire les concentrations d’échantillons d’ADN supplémentaires de concentration connue. L’ajustement de la valeur de Z à un permet de prédire avec précision de faibles concentrations d’ADN. En revanche, les concentrations élevées d’ADN sont mieux prédites avec une valeur Z de cinq.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que la RPA manque de cycles réels pour limiter le taux d’amplification de l’ADN. Le taux d’amplification doit donc être contrôlé avec précision. La cohérence entre les expériences est cruciale, alors assurez-vous d’utiliser les mêmes aliquotes d’amorce pour toutes les expériences.

Protégez les composants de réaction de la chaleur et de la lumière. Ajoutez de l’acétate de magnésium immédiatement avant le début de la collecte des données et conservez les réactions dans le bloc froid jusqu’au début. L’expérience.