Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d'insectes Cultured

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer des protéines d’intérêt marquées par fluorescence dans des cellules d’insectes disponibles dans le commerce pour améliorer l’élucidation de la fonction des protéines et/ou le trafic cellulaire des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés basées sur la biologie cellulaire et la biochimie concernant la fonctionnalité des protéines, les interactions avec les protéines et/ou la localisation des protéines subcellulaires. Le principal avantage de cette technique est que les constructions peuvent être rapidement générées et que les protéines exprimées peuvent être évaluées fonctionnellement dans des cellules vivantes sans effets délétères associés à l’expression du baculovirus, améliorant ainsi le débit.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’étude des protéines d’insectes, elle peut également être appliquée à tout système pour lequel l’étude de la fonction des protéines ou de la localisation cellulaire est souhaitée. La démonstration de la procédure de culture et de transfection de cellules d’insectes sera assurée par Danni LeRoy, un technicien de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, retirez les flacons de cellules SF9 et Tni congelées du congélateur à moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Après décongélation, décontaminez les flacons avec de l’éthanol à 70 % et placez-les sur de la glace. Toutes les manipulations cellulaires nécessitant l’ouverture des flacons et des flacons de culture tissulaire doivent être effectuées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pour maintenir des conditions de stérilité. Ajoutez quatre millilitres de milieu anti-insectes sans sérum dans une nouvelle fiole T25 et quatre millilitres de milieu TNM-FH dans une autre fiole T25.

Transférez un millilitre de cellules Tni décongelées dans le ballon avec un milieu anti-insectes sans sérum et un millilitre de cellules SF9 décongelées dans le ballon avec un milieu TNM-FH. Placez les flacons dans un incubateur non humidifié à 28 degrés Celsius et laissez les cellules se fixer pendant 30 à 45 minutes. Remplacez le substrat de semis par cinq millilitres du substrat approprié.

Et remettez les flacons dans l’incubateur non humidifié à 28 degrés Celsius. Surveillez quotidiennement la confluence des cellules. Passage des cellules lorsqu’elles atteignent 90 % de confluence comme le montrent ces images représentatives.

Inclinez le ballon contenant les cellules confluentes de manière à ce que le milieu s’écoule vers un coin en s’éloignant de la monocouche cellulaire et utilisez une pipette sérologique stérile de cinq millilitres pour retirer soigneusement le milieu sans déranger les cellules. Pour les cellules Tni, utilisez une nouvelle pipette sérologique stérile de cinq millilitres pour ajouter doucement quatre millilitres de milieu d’insecte sans sérum sur la monocouche confluente. Déplacez la pointe de la pipette sur le ballon et irriguez lentement pour retirer les cellules qui sont légèrement fixées au fond du ballon.

Pour vérifier que les cellules sont bien détachées, retirez tous les supports, retournez le ballon et observez que le fond du ballon est dégagé. Pour les cellules SF9, qui adhèrent plus étroitement, ajoutez quatre millilitres de milieu TNM-FH frais et utilisez un grattoir cellulaire pour déloger les cellules attachées. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, on mélange délicatement et on réduit l’agglutination des cellules.

Après avoir détaché les cellules, transférez environ 0,1 millilitre de chaque mélange de cellules et de milieu dans un tube de micro-fuge de 1,5 millilitre. Dans un tube micro-fuge séparé de 0,5 millilitre, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange de cellules et de milieux à 10 microlitres de bleu trypan. Retirez la lame de la chambre de compteur de cellules de son emballage et ajoutez 10 microlitres du mélange de bleu trypan de milieu cellulaire de chaque côté de la lame de comptage.

Insérez la lame dans un compteur de cellules automatisé et déterminez la densité et la viabilité des cellules. Transférez environ un à 1,5 fois 10 dans les 6e cellules dans des flacons T25 avec un milieu frais. Étiquetez les flacons avec la lignée cellulaire, la date, le milieu utilisé, le nombre de cellules ajoutées et le numéro de passage.

Placez les flacons dans un incubateur à 28 degrés Celsius jusqu’à 72 heures. La procédure de transfection de cellules d’insectes doit également être effectuée à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Ensemencez une fiole T25 avec jusqu’à une fois 10 à la 6e cellule Tni ou SF9 dans un milieu cellulaire d’insecte approprié.

Des cellules Tni sont utilisées dans cette démonstration. Faites pousser les cellules jusqu’à la confluence pendant 72 heures à 18 degrés Celsius. 72 heures plus tard, retirez et jetez l’ancien milieu et délogez les cellules Tni avec quatre millilitres de milieu d’insecte frais sans sérum, comme indiqué précédemment.

L’aspect le plus difficile de cette procédure est d’obtenir la densité appropriée de cellules fixées aux plats à fond de verre pendant la transfection. Pas plus de sept fois 10 à la 5ème cellule doivent être ajoutés à chaque plat. Après avoir utilisé un compteur de cellules automatisé pour estimer la densité des cellules, mélangez soigneusement mais doucement la suspension des cellules en inversant le tube et ajoutez environ sept fois 10 aux 5e cellules dans des plats individuels à fond de verre de 35 millimètres.

Laissez les cellules se fixer pendant 20 à 25 minutes à 28 degrés Celsius. Pour chaque transfection, ajoutez deux microgrammes d’ADN plasmidique à 0,1 millilitre de milieu d’insecte sans sérum sans FBS dans un tube micro-fuge stérile de 1,5 millilitre. Dans un tube séparé, mélangez huit microlitres de réactif de transfection avec 0,1 millilitre de milieu d’insecte sans sérum.

Transférez ensuite la solution dans le tube contenant l’ADN plasmidique d’intérêt. Agiter légèrement et incuber à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, diluez le mélange de transfection plasmidique avec 0,8 millilitre de milieu d’insecte sans sérum, ce qui porte le volume total à un millilitre.

Retirez délicatement le support de la boîte en verre contenant les cellules attachées. Superposez les cellules attachées avec le milieu de transfection plasmidique dilué. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius pendant cinq heures.

Après cinq heures, retirez et jetez le milieu de transfection et lavez doucement les cellules avec un millilitre de milieu d’insecte sans sérum, en prenant soin de ne pas déloger les cellules. Ajoutez deux millilitres de milieu cellulaire d’insecte frais sans sérum et incubez à 28 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures. 48 à 72 heures après la transfection des cellules d’insectes, laver les cellules une fois avec un millilitre de milieu d’insecte IPL-41, puis couvrir avec deux millilitres d’IPL-41 pour l’imagerie.

Ajoutez quatre gouttes de réactif de coloration des cellules vivantes Hoechst au milieu et incubez à 28 degrés Celsius pendant 20 à 25 minutes. Placez l’antenne parabolique de 35 millimètres dans le microscope confocal à balayage laser auto-fermé. Bien que de nombreuses boîtes en verre soient disponibles dans le commerce, il est important qu’elles s’adaptent à la platine du microscope et il peut être nécessaire de déterminer empiriquement quelle verrerie est la plus compatible avec la fixation de cellules.

Ajustez le microscope pour les conditions d’observation de Hoechst, EGFP et mCherry. 359 nanomètres et 461 nanomètres pour l’excitation et l’émission de Hoechst. 489 nanomètres et 510 nanomètres pour l’excitation et l’émission de l’EGFP.

Et 580 nanomètres et 610 nanomètres pour l’excitation et l’émission de cerises métalliques. À l’aide d’un objectif 10X, effectuez un premier balayage pour confirmer l’expression fluorescente. Après cela, passez en mode balayage à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau à contraste de phase 60X.

Ajustez la puissance laser, la sensibilité du détecteur, la vitesse de balayage, la profondeur de l’axe Z et le zoom numérique pour optimiser le contraste et la résolution de l’image. Imagez les cellules avec un zoom numérique de 1,5X pour donner une amplification totale de 90X. Enregistrez et exportez les données brutes sous forme de fichiers image TIFF pour une analyse ultérieure.

Les cellules Tni ont été transfectées avec les plasmides indiqués et l’expression des protéines recombinantes a été visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence confocale. La transfection et l’expression réussies de BtDrip1-EGFP recombinant sont évidentes par la présence d’une fluorescence verte à la surface de la cellule. Les cellules transfectées avec BtDrip2 version 1 EGFP montrent une fluorescence verte à l’intérieur, indiquant l’expression intracellulaire de BtDrip2 version 1.

De même, les cellules transfectées avec PIB DmSPR-mCherry ou PIB PLA2G15-mCherry présentent une fluorescence rouge indiquant l’expression des chimères respectives. Dans les images fusionnées, les zones orange ou jaune indiquent l’expression d’EGFP et de mCherry, ce qui suggère que les protéines sont co-localisées au sein des mêmes structures subcellulaires. Une superposition de cellules doublement transfectées avec PIB BtDrip1-EGFP et PIB DmSPR-mCherry suggère une co-localisation de BtDrip1-EGFP et DmSPR-mCherry à la surface de la cellule.

Les cellules doublement transfectées avec BtDrip2 version 1 EGFP et PIB DmSPR-mCherry montrent peu de co-localisation des signaux de fluorescence vert et rouge, confirmant l’expression intracellulaire de BtDrip2 version 1. En revanche, la co-expression de PIB BtDrip2 version un EGFP et du marqueur lysosomal PIB PLA2G15-mCherry a entraîné un chevauchement significatif des signaux fluorescents cytoplasmiques verts et rouges. Cela suggère fortement que BtDrip2 est un trafic vers les lysosomes intercellulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer les chimères de protéines fluorescentes dans des cellules d’insectes en culture. Ce système offre une construction vectorielle rapide dans la synthèse des protéines, évite les défis des systèmes d’expression basés sur des virus et fournit un moyen robuste d’observer les protéines de trafic cellulaire.