Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d'insectes Cultured

L'objectif général de cette procédure est d'exprimer des protéines d'intérêt marquées par un fluorophore dans des cellules d'insectes disponibles commercialement, afin de mieux élucider la fonction des protéines et/ou leur trafic cellulaire. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles en biologie cellulaire et en biochimie concernant la fonctionnalité des protéines, leurs interactions et/ou leur localisation subcellulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les constructions peuvent être rapidement générées et que les protéines exprimées peuvent être évaluées fonctionnellement dans des cellules vivantes, sans les effets délétères associés à l'expression par baculovirus, améliorant ainsi le débit expérimental.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations utiles pour l'étude des protéines d'insectes, elle peut également être appliquée à tout système pour lequel l'étude de la fonction protéique ou de la localisation cellulaire est souhaitée. La procédure de culture cellulaire d'insectes et de transfection sera démontrée par Danni LeRoy, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, retirez les flacons stock de cellules SF9 et Tni congelées du congélateur à moins 80 degrés Celsius et laissez-les dégeler dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius.

Après décongélation, désinfecter les flacons avec de l'éthanol à 70 % et les placer sur de la glace. Toutes les manipulations cellulaires nécessitant l'ouverture de flacons et de flacons de culture tissulaire doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions stériles. Ajouter quatre millilitres de milieu pour insectes sans sérum dans un nouveau flacon T25 et quatre millilitres de milieu TNM-FH dans un autre flacon T25.

Transférez un millilitre de cellules Tni décongelées dans le flacon contenant le milieu pour insectes sans sérum et un millilitre de cellules SF9 décongelées dans le flacon contenant le milieu TNM-FH. Placez les flacons dans une étuve à 28 degrés Celsius non humidifiée et laissez les cellules s’attacher pendant 30 à 45 minutes. Remplacez le milieu d’ensemencement par cinq millilitres du milieu approprié.

Et remettez les flacons dans l’incubateur non humidifié à 28 degrés Celsius. Surveillez quotidiennement la confluence cellulaire. Repiquez les cellules lorsqu’elles atteignent une confluence de 90 %, comme indiqué par ces images représentatives.

Inclinez le flacon contenant les cellules confluentes de manière à ce que le milieu s’écoule vers un coin, à l’opposé de la monocouche cellulaire, et utilisez une pipette sérologique stérile de cinq millilitres pour retirer soigneusement le milieu sans perturber les cellules. Pour les cellules Tni, utilisez une nouvelle pipette sérologique stérile de cinq millilitres pour ajouter délicatement quatre millilitres de milieu pour insectes sans sérum sur la monocouche confluente. Déplacez la pointe de la pipette à travers le flacon et irriguez lentement afin d’éliminer les cellules faiblement attachées au fond du flacon.

Pour vérifier un détachement adéquat des cellules, retirez tout le milieu, retournez le flacon et observez que le fond du flacon est dégagé. Pour les cellules SF9, qui adhèrent plus fortement, ajoutez quatre millilitres de milieu TNM-FH frais et utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules fixées. Utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour mélanger délicatement et réduire l'agglutination cellulaire.

Après avoir détaché les cellules, transférez environ 0,1 millilitre de chaque mélange cellules-milieu dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre. Dans un tube micro-centrifuge distinct de 0,5 millilitre, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange cellules-milieu à 10 microlitres de bleu de trypan. Retirez la lame de comptage de sa pochette et ajoutez 10 microlitres du mélange milieu cellulaire-bleu de trypan sur chaque côté de la lame de comptage.

Insérez la lame dans un compteur cellulaire automatisé et déterminez la densité cellulaire et la viabilité. Transférez environ un à 1,5 × 10⁶ cellules dans des flacons T25 contenant du milieu frais. Étiquetez les flacons avec la lignée cellulaire, la date, le milieu utilisé, le nombre de cellules ajoutées et le numéro de passage.

Placer les flacons dans une étuve à 28 degrés Celsius pendant jusqu'à 72 heures. La procédure de transfection des cellules d'insectes doit également être réalisée dans une hotte à flux laminaire. Ensemencer un flacon T25 avec jusqu'à un fois 10 à la puissance 6 cellules Tni ou SF9 dans un milieu approprié pour cellules d'insectes.

Les cellules Tni sont utilisées dans cette démonstration. Faites croître les cellules jusqu'à confluence pendant 72 heures à 18 degrés Celsius. Soixante-douze heures plus tard, retirez et jetez l'ancien milieu, puis détachez les cellules Tni avec quatre millilitres de milieu pour insectes frais sans sérum, comme indiqué précédemment.

L'aspect le plus délicat de cette procédure consiste à obtenir une densité cellulaire appropriée des cellules attachées aux boîtes à fond en verre pendant la transfection. Ne pas ajouter plus de sept fois 10 à la puissance 5 cellules à chaque boîte. Après avoir utilisé un compteur cellulaire automatisé pour estimer la densité cellulaire, mélanger soigneusement mais doucement la suspension cellulaire en retournant le tube et ajouter environ sept fois 10 à la puissance 5 cellules à des boîtes individuelles de 35 millimètres à fond en verre.

Laisser les cellules s’attacher pendant 20 à 25 minutes à 28 degrés Celsius. Pour chaque transfection, ajouter deux microgrammes d'ADN plasmidique à 0,1 millilitre de milieu pour insectes sans sérum, sans FBS, dans un tube micro-centrifuge stérile de 1,5 millilitre. Dans un tube séparé, mélanger huit microlitres de réactif de transfection avec 0,1 millilitre de milieu pour insectes sans sérum.

Transférez ensuite la solution dans le tube contenant l'ADN plasmidique d'intérêt. Vortexez doucement et incubez à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, diluez le mélange de transfection plasmidique avec 0,8 millilitre de milieu pour insectes sans sérum, portant le volume total à un millilitre.

Retirer soigneusement le milieu de la boîte en verre contenant les cellules adhérentes. Recouvrir les cellules adhérentes du milieu de transfection de plasmide dilué. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius pendant cinq heures.

Après cinq heures, retirez et jetez le milieu de transfection, puis lavez délicatement les cellules avec un millilitre de milieu pour insectes sans sérum, en prenant soin de ne pas détacher les cellules. Ajoutez deux millilitres de milieu frais sans sérum pour cellules d'insectes et incubez à 28 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures. Entre 48 et 72 heures après la transfection des cellules d'insectes, lavez les cellules une fois avec un millilitre de milieu pour insectes IPL-41, puis recouvrez-les de deux millilitres de milieu IPL-41 pour l'observation microscopique.

Ajouter quatre gouttes de réactif de coloration des cellules vivantes au Hoechst dans le milieu et incuber à 28 degrés Celsius pendant 20 à 25 minutes. Placer la boîte de 35 millimètres dans le microscope confocal à balayage laser auto-enclos. Bien que de nombreux récipients en verre soient disponibles commercialement, il est important qu'ils s'adaptent à la platine du microscope, et il peut être nécessaire de déterminer empiriquement quel matériel en verre est le plus compatible avec l'attachement cellulaire.

Régler le microscope pour les conditions d'observation de Hoechst, d'EGFP et de mCherry. 359 nanomètres et 461 nanomètres pour l'excitation et l'émission de Hoechst. 489 nanomètres et 510 nanomètres pour l'excitation et l'émission de l'EGFP.

Et 580 nanomètres et 610 nanomètres pour l'excitation et l'émission de la mCherry. À l’aide d’un objectif 10X, effectuez un balayage initial afin de confirmer l’expression fluorescente. Ensuite, passez en mode balayage en utilisant un objectif à immersion dans l’eau en contraste de phase 60X.

Réglez la puissance du laser, la sensibilité du détecteur, la vitesse de balayage, la profondeur selon l'axe Z et le zoom numérique afin d'optimiser le contraste et la résolution de l'image. Acquérez les cellules avec un zoom numérique de 1,5X pour obtenir un grossissement total de 90X. Enregistrez et exportez les données brutes sous forme de fichiers image TIFF pour une analyse ultérieure.

Les cellules Tni ont été transfectées avec les plasmides indiqués et l'expression des protéines recombinantes a été visualisée par microscopie à fluorescence confocale. La transfection réussie et l'expression de la protéine recombinante BtDrip1-EGFP sont confirmées par la présence d'une fluorescence verte à la surface des cellules. Les cellules transfectées avec la version un de BtDrip2-EGFP présentent une fluorescence verte intracellulaire, indiquant l'expression intracellulaire de la version un de BtDrip2.

De même, les cellules transfectées avec PIB DmSPR-mCherry ou PIB PLA2G15-mCherry présentent une fluorescence rouge indiquant l'expression des chimères respectives. Sur les images fusionnées, les zones orangées ou jaunes indiquent une expression à la fois d'EGFP et de mCherry, ce qui suggère que les protéines sont co-localisées au sein des mêmes structures subcellulaires. Une superposition des cellules doublement transfectées avec PIB BtDrip1-EGFP et PIB DmSPR-mCherry suggère une co-localisation de BtDrip1-EGFP et de DmSPR-mCherry à la surface cellulaire.

Les cellules doublement transfectées avec la version un de BtDrip2-EGFP et PIB-DmSPR-mCherry montrent peu de co-localisation entre les signaux de fluorescence verte et rouge, confirmant l'expression intracellulaire de la version un de BtDrip2. En revanche, la co-expression de PIB-BtDrip2 version un-EGFP et du marqueur lysosomal PIB-PLA2G15-mCherry a entraîné un important recouvrement des signaux fluorescents verts et rouges dans le cytoplasme. Cela suggère fortement que BtDrip2 est acheminé vers les lysosomes intracellulaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment exprimer des chimères de protéines fluorescentes dans des cellules d'insectes en culture. Ce système permet une construction rapide de vecteurs pour la synthèse protéique, évite les difficultés liées aux systèmes d'expression basés sur les virus et offre un moyen robuste d'observer les protéines impliquées dans le trafic cellulaire.