Name: Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse et d'imagerie du calcium dans les podocytes de glomérules fraîchement isolés. Cette technique permet de mesurer les changements de concentration calcique intracellulaire en temps réel.

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Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Gregory Blass est reconnu pour la relecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé HL108880 de subvention et American Diabetes Association accorder 1-15-BS-172 (AS), et Ben J. Lipps bourse de recherche de l&#39;American Society of Nephrology (DVI).

L&#39;utilisation et le bien-être des animaux devraient adhérer à la NIH Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire suivant les protocoles examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle (IACUC). 1. Kidney Flush <ol><li> Utiliser 8 à 12 semaines vieux rat mâle (suggéré est une souche Sprague Dawley, mais d&#39;autres souches d&#39;âge et sexe différent peuvent être utilisés avec les modifications appropriées). </li><li> Anesthésier les animaux selon le mode opératoire autorisé par le protocole IACUC; surveiller la profondeur de l&#39;anesthésie et d&#39;inspecter l&#39;animal. La description détaillée de l&#39;opération à effectuer dans 1.3 à 1.8 peuvent être trouvés dans Ilatovskaya 7 et al. </li><li> Après une anesthésie adéquate, placer l&#39;animal sur une table chirurgicale à température contrôlée, faire une incision médiane de l&#39;abdomen (jusqu&#39;à 3 pouces de longueur), et de découvrir la veine cave et l&#39;aorte. </li><li> Insérez ligature autour les cœliaques et mésentériques supérieure artères et les abdominauxceux au-dessus de l&#39;aorte; ne pas ligaturer. </li><li> Blunt disséquer l&#39;aorte abdominale dessous des artères rénales, et placez deux ligatures autour de lui, mais ne ligaturer, puis serrer l&#39;aorte au-dessus des ligatures et attacher le fil inférieur. </li><li> Cathétériser l&#39;aorte avec une tubulure PE50 polyéthylène (attaché à une pompe à seringue remplie de PBS) au-dessous de la pince et fixer le cathéter à la seconde ligature; retirer la pince, tourner sur la pompe, et ligaturer l&#39;aorte et des artères mésentériques avec coeliaques. Vite incision dans la veine rénale pour soulager la pression. </li><li> Infuser l&#39;aorte avec le PBS pré-refroidi pendant 2 ou 3 minutes à une vitesse de 6 ml / min. </li><li> Arrêtez la perfusion, accises et décapsuler 7 les reins, et les mettre sur la glace dans la solution PBS. Euthanasier l&#39;animal selon un protocole approuvé par le IACUC. </li></ol> 2. Isolement des glomérules Rat <ol><li> Préparer 30 ml de solution fraîche de 5% de BSA dans du milieu RPMI 1640. </li><li> En utilisant une lame de rasoir et des ciseaux,isoler le cortex des deux reins, puis émincer jusqu&#39;à homogénéité. Cette procédure a été décrite précédemment 7. </li><li> Appuyez sur le tissu haché lors de l&#39;étape précédente à travers un tamis en acier inoxydable de 100 mesh (pré-trempés dans 5% de BSA en solution / RPMI) à l&#39;aide d&#39;une spatule. Recueillir l&#39;écoulement et par la force de gravité permettent l&#39;écoulement de passer à travers un tamis 140 mesh. </li><li> Filtrer la accréditives recueillies auprès des 140 tamis en utilisant un tamis à mailles de 200 pré-imprégné, jeter le filtrat, et laver le haut du tamis avec 10 - 15 ml de la solution préparée BSA / RPMI pour recueillir les glomérules que les sédiments sur le tamis. </li><li> Mettre la solution de BSA / RPMI contenant glomérules sur de la glace dans un tube de 15 ml et laisser le sédiment de glomérules au fond du tube pour un maximum de 20 min. Le concentré de glomérules sur le fond du tube sera clairement visible. Retirer la solution en excès, en laissant environ 2 ml dans le tube. </li></ol> 3. Single-channel patch-clamp Electrophysiology <ol><li> Préparer 5 x 5 mm éclats de verre de couverture en les enduisant d&#39;MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysine, et laisser sécher. Utilisez environ 30 pi de 0,01% solution filtrée stérile dans l&#39;eau par verre de couverture. </li><li> Réchauffez les solutions expérimentales à RT et remplir la chambre de patch-clamp et la pipette. Pour les canaux de TRPC surveillance, utiliser une solution de bain, en mm: 126 NaCl, CaCl2 1, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 glucose, pH 7,4; pipette: 126 NaCl, CaCl2 1,5, HEPES 10, 10 glucose; pH 7,4. <ol><li> Ajouter inhibiteurs à la solution de la pipette pour bloquer l&#39;activité de canaux endogènes, qui ne sont pas pertinentes pour les études (recommandées sont les suivantes: 100 uM acide niflumique ou DIDS (pour bloquer Ca 2+ activés par canaux Cl -), 10 mM TEA (pour inhiber la grande conductance Ca 2 + - K + dépendante canal), 10 nM ibériotoxine (pour bloquer les Ca2 + canaux K + activés par), 10 uM nicardipine (pour bloquer Ca de type N2+ canaux)) directement avant l&#39;expérience de patch-clamp. </li></ol></li><li> Mélanger doucement la solution contenant glomérules, et ensuite appliquer environ 50 pi de celui-ci à la couverture enduite éclats de verre poly-ʟ-lysine. Laissez les glomérules attachent pendant environ 5 min. </li><li> Déplacer les éclats de verre avec glomérules à la chambre de patch-clamp pré-remplies avec la solution de bain; perfuser la chambre à un débit de 3 ml / min pendant 1 min à assurer l&#39;élimination des glomérules seules. </li><li> Mener une expérience de patch-clamp conventionnel dans un mode cellule attachée 7. Avec une pipette en verre (7 à 10 MQ de résistance à la pipette) forment un joint d&#39;étanchéité à haute résistance entre une pipette et une membrane de podocytes par application d&#39;une aspiration douce (une pipette fixée à un podocytes sur la surface du glomérule isolé est représenté sur la figure 2, sur la gauche). </li><li> Pour les mesures ci-joint cellules passe-bas, les courants à 300 Hz par un filtre à huit pôles Bessel. </li><li> Usoi isolé glomérules dans les expériences de patch-clamp pour un maximum de 4 - 6 h. Gardez la fraction stock glomérules sur la glace. </li></ol> 4. Ratiométrique confocale de fluorescence mesures de la concentration intracellulaire de calcium dans les podocytes <ol><li> Placez 500 pi de la fraction de glomérules (décrit à 2,5) dans 0,5 ml tube conique et ajouter des colorants de calcium Fura rouges, AM et Fluo-4, AM. Utilisez 2 mm et 1 mm actions concentrations de Fura-Rouge, AM et Fluo-4, AM, respectivement (conserver à -20 ° C, dissous dans du DMSO) et utiliser 2,5 pi de chaque colorant pendant 500 pi de fraction de glomérules. Immédiatement après l&#39;ajout des colorants couvrir le tube de papier d&#39;aluminium. </li><li> Placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant au moins 20 minutes jusqu&#39;à une heure à température ambiante. Remarque: Les agents pharmacologiques peuvent être ajoutés au cours de cette étape. </li><li> Préparer des lamelles de verre, les couvrir avec de la poly-ʟ-lysine et de permettre un séchage en utilisant ensemble de plaque chauffée à 70 ° C. </li><li> Une fois le chargement des colorants de calcium est complete, applique 100 pl de solution contenant les glomérules des lamelles couvre-objet enduites de poly-lysine-ʟ et qu&#39;ils adhèrent à la surface pendant environ 5 min. Monter les lamelles de glomérules inscrits dans une chambre de formation d&#39;image, et perfuser avec la solution de bain (contenant (en mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) à un débit de 3 ml / min pour supprimer les glomérules seules et les colorants restants. </li><li> Régler la confocal à balayage laser à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm et de filtres d&#39;émission (525/25 et 650/25 nm pour Fluo-4 et Fura-Rouge, respectivement). Réglez le logiciel d&#39;imagerie à une fréquence et la résolution souhaitée. </li><li> Trouver les glomérules en clair et puis tourner sur la détection du signal de fluorescence. Ajuster l&#39;intensité du laser pour chaque colorant pour éviter la saturation du signal. Choisir le plan focal avec les podocytes qui sont directement attachés à la vitre. Ceci minimise l&#39;effet provoqué par la contraction d&#39;un glomérule en réponse à médicamentapplication. Double-vérifier que le glomérule de choix est bien fixé à la vitre; </li><li> Lancer l&#39;imagerie du plan focal de choix (prendre 512 x 512 images avec la fréquence fixée à 4 secondes de visualiser Ca 2+ rapide des changements transitoires. Utilisez un / NA 1.4 ou objectif 60X similaire image haute résolution pour), appliquer médicaments d&#39;intérêt, et enregistrer la réponse. <ol><li> Sélectionner un plan focal souhaité (le plus près de la surface du verre, donc, pour assurer l&#39;imagerie de podocytes sur la surface du glomérule). Vérifiez l&#39;intensité de fluorescence sur le Fluo4 et canaux FuraRed, et assurez-vous que le glomérule est clairement visible dans fond clair. </li><li> Lancer imagerie. Avant l&#39;application de toutes les drogues, fiche d&#39;au moins 1 min de fluorescence de base pour vous assurer que le signal est stable (il n&#39;y a pas de pointes soudaines ou évanouissement du signal). </li><li> Appliquer médicaments souhaités à l&#39;aide d&#39;une micro-pipette; soyez prudent et veiller à la drogue était capable de bien diffuser et atteindre le glomerUlus. Mélanger la solution de bain en douceur si nécessaire, suivre le plan focal choisi et vérifier qu&#39;il ne bougeait pas de mise au point en raison de la demande de drogue. </li><li> Enregistrer les variations de l&#39;intensité de fluorescence pour les signaux Fluo4 et FuraRed. Assurez-vous que l&#39;enregistrement est assez long, en attendant que le signal atteint le niveau du plateau ou atteint un pic, puis retourne à la ligne de base. Effectuer le changement de la solution ou l&#39;addition de tous les autres médicaments si nécessaire. </li><li> Arrêtez l&#39;enregistrement, et enregistrer le fichier dans le format natif du logiciel. </li></ol></li></ol> 5. Analyse d&#39;image pour les mesures de calcium <ol><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;image avec le logiciel ImageJ ouverte équipée avec le plugin utilitaire ND qui permet d&#39;importer des images dans le format natif ND2. </li><li> Importez la séquence d&#39;images; assurez-vous de séparer les canaux et utiliser un mode HyperStack en niveaux de gris. </li><li> Suivez l&#39;→ Outils → ROI chemin Analyser de gestionnaire dans le logiciel ImageJ à oStylo une fenêtre du gestionnaire de ROI. Sélectionnez plusieurs régions d&#39;intérêt (podocytes) en utilisant un outil de sélection ovale et le &quot;(t) Ajouter&quot; fonction dans le Gestionnaire de ROI. Comme la dernière ROI, sélectionnez la zone à l&#39;arrière-plan; enregistrer les ROI sélectionnés (Plus → Enregistrer). </li><li> Mettez en surbrillance la fenêtre contenant le canal sélectionné pour analyses. Utilisez la fonction multi More → Mesurer dans le Gestionnaire de ROI, cochez la case &quot;une ligne par tranche» dans le dialogue qui sort, puis cliquez sur OK. Les résultats seront affichés dans le format qui peut être mis en place dans la fenêtre des résultats: entrer dans les options de menu Résultats → Set Mesures, sélectionnez &quot;Valeur moyenne grise» et de calculer les valeurs d&#39;intensité de pixel pour chaque ROI, qui sera affiché dans la fenêtre Résultats dans des colonnes distinctes pour chaque ROI. </li><li> Copiez les valeurs d&#39;intensité de ROI mesurées pour chaque canal (Fluo-4 et Fura-Rouge) dans le logiciel d&#39;analyse de données pratique; valeurs d&#39;intensité de fond Soustraire de chaque datun point. </li><li> Pour chaque point de temps de calculer le rapport des intensités du Fluo-4 à canaux Fura rouges. Terrain scatter / ligne change de point de temps de la Ca transitoire pour chaque ROI. Calculer les valeurs moyennes / SE pour glomérules sélectionnés. Remarque: la colonne de temps devrait être fixé en fonction de la fréquence d&#39;imagerie sélectionné à 4,5. </li></ol> 6. Calculs intracellulaires de calcium de concentration en utilisant Fluo-4 Fluorescence Signal <ol><li> Prélever un échantillon des glomérules et exécuter le protocole expérimental jusqu&#39;à l&#39;étape 4.7. Après l&#39;enregistrement de la fluorescence de fond ajouter ionomycine (concentration finale dans la chambre de bain doit être de 10 uM) à la solution de bain, et de l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence fiche. Une fois l&#39;intensité atteint son maximum et la décroissance commence, ajouter MnCl2 (concentration finale doit être de 5 mm) pour étancher la fluorescence 8. </li><li> Analyser les données obtenues en 6.1. Copier les valeurs d&#39;intensité de ROI Fluo-4 signal obtenues selonle protocole décrit à 5/1 à 5/5 par un logiciel d&#39;analyse préféré. </li><li> Calculer la concentration en calcium intracellulaire (en nM) dans le podocyte correspondant à la ROI en utilisant une formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> où K d est une dissociation prédéterminée constante de Fluo-4 (345 nM), F est l&#39;intensité au point de temps que vous êtes le calcul de la concentration en calcium de (niveau de référence), et F min et F max sont les valeurs d&#39;intensité au point de charge maximale de calcium (après application ionomycine) et après extinction de la fluorescence (avec MnCl 2), respectivement (voir Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+nephrotic+syndrome%3A+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li>
<li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li>
<li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li>
<li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li>
<li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li>
<li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+%28Carlton%29%22%5BJournal%5D)">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li>
<li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771(2009).</li>
<li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li>
<li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li>
<li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li>
<li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin%3A+a+multiphoton+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li>
<li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li>
<li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT%281%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li>
<li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li>
<li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels%3A+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li>
<li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

L&#39;approche décrite ici permet l&#39;analyse de manipulation de calcium par les podocytes des glomérules chez les rongeurs. Cette technique permet l&#39;application de patch-clamp électrophysiologie à canal unique et imagerie confocale à fluorescence ratiométrique. Cependant, les deux approches peuvent être utilisés séparément, sur leur propre. Le protocole proposé comporte plusieurs étapes relativement simples, y compris 1) Kidney Flush; 2) l&#39;isolement des glomérules par tamisage différentiel; 3) exécuter des pa...

Les reins maintiennent l&#39;équilibre homéostatique pour diverses substances et de réguler le volume sanguin d&#39;une manière qui détermine la pression sanguine totale. Des perturbations dans la filtration rénale, la réabsorption ou la sécrétion d&#39;entraîner ou d&#39;accompagner des états pathologiques, allant de l&#39;hyper ou hypotension pour mettre fin à l&#39;insuffisance rénale qui nécessite éventuellement une transplantation rénale. L&#39;unité de filtration rénale (glomérule) se compose de trois couches - l&#39;endothélium capillaire, la membrane basale et une couche mono-cellulaire des cellules épithéliales - podocytes, qui jouent un rôle majeur dans le maintien de l&#39;intégrité et de la fonction 1 fente diaphragme. Dysfonction dans le filtre glomérulaire provoque une perte urinaire à perméabilité sélective de macromolécules, telles que la protéinurie. Différents agents peuvent affecter la structure des podocytes et leurs procédés de pied, qui déterminent l&#39;intégrité de la barrière de filtration de glomérules. Les podocytes sont impliqués dans le maintien de la glomfonction de filtration Eruli. Il a été établi que la manipulation de calcium impropre à l&#39;podocytes conduit à une lésion de la cellule et joue un rôle important dans la progression de diverses formes de néphropathies 2,3. Par conséquent, le développement d&#39;un modèle qui permet de mesure directe des changements de concentration de calcium intracellulaire sera déterminante pour les études de la fonction des podocytes. Glomérules isolés ont été précédemment utilisés dans de nombreuses études, y compris une mesure du coefficient de réflexion albumine change 4 et l&#39;évaluation des courants cellulaires intégraux dans les cellules entières électrophysiologiques mesures de patch-clamp 5,6. Dans le présent article, nous décrivons le protocole qui permet au chercheur de mesurer intracellulaires changements de concentration de calcium en réponse aux demandes d&#39;agents pharmacologiques, estimer les niveaux de calcium dans les cellules basales, et d&#39;évaluer l&#39;activité des particuliers canaux calciques. Mesures de la concentration de calcium Ratometric et patch-clamp electrophysiology ont été utilisés pour déterminer respectivement des changements dans la concentration de calcium intracellulaire au sein de l&#39;activité de canal et podocytes.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l dans du DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Acide Pluronic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>solution</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tubes</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Allemagne</td></tr><tr><td>Microscope confocal Nikon (inversé)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Excitation laser à 488 nm. Filtres d'émission 500-550 nm et 570-620 nm</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle en verre</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Graisse à vide élevé</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Composé au silicone</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d'enregistrement/perfusion</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de patch-clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Système d'acquisition de données</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Système Axon Digidata&amp;reg;</td></tr><tr><td>Filtre passe-bas</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>Bessel à 8 pôles</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Tireuse de micropipettes de type Flaming/Brown</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japon</td></tr><tr><td>Micro-manipulateur motorisé</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Table d'isolation des microvibrations</td><td>TMC</td><td></td><td>équipée d'une cage de Faraday</td></tr><tr><td>Système de perfusion multivoies à valve</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d'enregistrement/perfusion</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Ibério-toxine</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Acide niflumique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de TEA</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>sans antibiotiques</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>solution d'albumine à 30 %</td></tr><tr><td>Table chirurgicale contrôlée en température</td><td>MCW core</td><td></td><td>pour rongeurs</td></tr><tr><td>Tamis en acier :</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>Maille 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>écran pour CD-1</td></tr><tr><td>Microscope binoculaire</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Microscope binoculaire</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion basé sur une pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuyau en polyéthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Anesthésie à l'isoflurane</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Autres réactifs de base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-channel analyse et imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Les podocytes (cellules épithéliales glomérulaires rénales) sont connus pour réguler la perméabilité glomérulaire et maintenir la structure glomérulaire ; un rôle clé de ces cellules dans la pathogenèse de diverses maladies rénales a été établi puisque les lésions des podocytes entraînent une protéinurie et un effacement du processus du pied. Il a déjà été rapporté que divers agents endogènes peuvent provoquer une surcharge spectaculaire de la concentration intracellulaire de Ca2+ dans les podocytes, conduisant probablement à l’albuminurie, et cela se produit probablement via les canaux ioniques conducteurs de calcium. Par conséquent, il est apparu important d’étudier la manipulation du calcium dans les podocytes à la fois dans des conditions normales et dans divers états pathologiques. Cependant, les approches expérimentales disponibles sont restées quelque peu limitées aux cellules cultivées et transfectées. Bien qu’ils représentent un bon modèle de base pour de telles études, ils sont essentiellement extraits de l’environnement d’origine du glomérule. Nous décrivons ici la méthodologie d’étude des podocytes en tant que partie du glomérule entier fraîchement isolé. Cette préparation conserve le potentiel fonctionnel des podocytes, qui sont toujours attachés aux capillaires ; Par conséquent, les podocytes restent dans l’environnement qui conserve la majeure partie de l’appareil de filtration des glomérules. Le présent manuscrit développe deux approches expérimentales qui permettent 1) la détection en temps réel des changements de concentration en calcium à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence ratiométrique, et 2) l’enregistrement de l’activité des canaux ioniques uniques dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés. Ces méthodologies utilisent les avantages de l’environnement natif du glomérule qui permettent aux chercheurs de résoudre les changements aigus dans la manipulation intracellulaire du calcium en réponse à l’application de divers agents, de mesurer la concentration basale de calcium dans les cellules (par exemple, pour évaluer la progression de la maladie) et d’évaluer et de manipuler la conductance calcique au niveau des canaux ioniques uniques.

Ici, nous avons abordé le problème de la mesure des changements de courte durée dans les niveaux de calcium dans les podocytes. La figure 1 montre une représentation schématique du protocole expérimental conçu pour effectuer l&#39;imagerie haute résolution fluorescence confocale en temps réel et des enregistrements individuels de l&#39;activité des canaux ioniques dans les podocytes de la fraîchement glomérules isolés de rongeurs. Brièvement, après le rat est anesthésié, les reins doivent être rincés av...

Les changements dans les niveaux de calcium intracellulaire dans les podocytes sont l’un des moyens les plus importants de contrôler la fonction de filtration des glomérules. Nous expliquons ici une approche à haut débit qui permet de détecter en temps réel la manipulation du calcium et l’activité des canaux ioniques uniques dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés.

Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les variations de la concentration intracellulaire de calcium en réponse à des agents pharmacologiques. Estimer les niveaux basaux de calcium et évaluer l'activité individuelle des canaux dans les podocytes dans le cadre du glomérule fraîchement isolé entier. Ceci est réalisé en éliminant d'abord le sang des reins de rat par lavage via l'aorte abdominale.Ensuite, les reins sont prélevés et le cortex rénal est isolé et haché à l’aide d’un rasoir. Dans la troisième étape, les glomérules corticaux sont isolés par centrifugation différentielle. Par la suite, les glomérules décapités isolés peuvent soit être soumis à des expériences électrophysiologiques, soit chargés avec des colorants fluorescents et utilisés pour des mesures de concentration calcique en microscopie confocale.En fin de compte, ces procédures permettent aux chercheurs de résoudre les changements aigus du traitement intracellulaire du calcium en réponse à l'application de divers agents, et d'évaluer ainsi que de manipuler la conductance calcique au niveau de canaux ioniques individuels. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à étudier les podocytes en tant que partie intégrante du glomérule isolé entier. Notre préparation conserve le potentiel fonctionnel des podocytes.Ils restent attachés aux capillaires et participent à l'homéostasie dans l'environnement qui peut effectivement conserver les parties majeures de l'appareil de filtration glomérulaire. Les implications de cette technique élargissent notre criblage pharmacologique. Dans les états normaux et pathologiques, le mécanisme de gestion du calcium par les podocytes joue un rôle régulateur essentiel dans le développement et la prévention des complications rénales dans des maladies telles que la néphropathie diabétique, la sclérose segmentaire focale ou l'hypertension. Il est très important d'observer la réponse de l'influx de calcium dans ces cellules aux médicaments, ce qui peut être facilement analysé.Dans cette préparation, VLA Hunka démontrera comment perfuser le rein en vue des procédures suivantes. Je montrerai l'isolement des glomérules et la technique de microélectrode en clampage de voltage, et le Dr. GaN vous guidera à travers l'imagerie confocale du calcium. Pour commencer cette procédure, placez un rat anesthésié sur la table chirurgicale à température contrôlée. Sous le microscope, pratiquez une incision médiane sur l'abdomen afin de découvrir la veine CVA et l'aorte.Ensuite, insérez une ligature autour des artères cœliaque et mésentérique supérieure et de l'aorte abdominale au-dessus de celles-ci. Disséquez par méthode contondante l'aorte abdominale en dessous des artères rénales. Placez ensuite deux ligatures autour de celle-ci, mais ne serrez pas.Clipser l'aorte au-dessus des ligatures et nouer le fil inférieur. Ensuite, cathétériser l'aorte à l'aide d'un tube en polyéthylène raccordé à une pompe à seringue remplie de PBS en aval du clip, puis fixer le cathéter à l'aide d'une seconde ligature. Puis retirer le clip et effectuer la ligature.Me artères mésentérique et cœliaque. Perfusionner l'aorte avec du PBS prérefroidi pendant trois minutes à un débit de six millilitres par minute. Simultanément, pratiquer une incision dans la veine cave près des veines rénales pour soulager la pression.Après trois minutes, arrêter la perfusion, exciser et encapsuler les reins. Les placer dans une solution de PBS sur de la glace. Préparer maintenant 30 millilitres de solution fraîche de RPMI 1640 contenant 5 % de BSA.À l’aide d’un rasoir et de ciseaux, isoler le cortex des deux reins, puis les hacher jusqu’à homogénéité. Ensuite, faire passer le tissu haché à travers un tamis en acier inoxydable de 100 mailles, préalablement imbibé de solution P-S-A-R-P-M-I à 5 %. Recueillir le filtrat et laisser passer celui-ci à travers un tamis de 140 mailles.Ensuite, filtrez le flux recueilli provenant du tamis de 140 mailles à l’aide d’un tamis de 200 mailles préalablement imbibé. Jetez le filtrat et lavez le tamis supérieur avec 10 à 15 millilitres de la solution B-S-A-R-P-M-I préparée, puis récupérez les glomérules situés sur le dessus du tamis. Placez ensuite la solution B-S-A-R-P-M-I contenant les glomérules G dans un tube de 15 millilitres placé sur de la glace pilée et laissez les glomérules se sédimenter au fond du tube pendant un maximum de 20 minutes.Dans cette procédure, recouvrez des lamelles de verre de cinq millimètres sur cinq millimètres de polylysine de masse moléculaire comprise entre 70 000 et 150 000, puis faites-les sécher sur un bloc chauffant. Ensuite, portez les solutions expérimentales à température ambiante, remplissez la chambre de mesure pour enregistrement en configuration patch et la pipette, puis mélangez délicatement la solution contenant les glomérules. Appliquez ensuite environ 50 microlitres de cette solution sur chaque lamelle recouverte de polylysine.Ensuite, transférez les éclats de verre portant les glomérules vers la chambre de patch clamp préremplie avec la solution Beth. Parfuser la chambre à un débit de trois millilitres par minute pendant une minute afin d'éliminer les glomérules non attachés, avant d'effectuer l'enregistrement classique en mode patch clamp en configuration cellule attachée.Maintenant, placer 500 microlitres de la fraction de glomérules dans chaque tube conique de 0,5 millilitre et ajouter les colorants calciques Pure Red AM et Fluoh 4:00 AM. Ensuite, placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant une heure maximum à température ambiante. Puis préparer les lamelles en verre avec de la polylysine et les laisser sécher sur la plaque chauffante à 70 degrés Celsius. Une fois le chargement des colorants calciques terminé, appliquer 100 microlitres de la solution contenant les glomérules sur les lamelles recouvertes de polylysine et laisser adhérer à la surface pendant environ cinq minutes.Ensuite, monter les lamelles avec les glomérules fixés sur une chambre d'imagerie et les perfuser avec une solution bain à un débit de trois millilitres par minute afin d'éliminer les glomérules non fixés et les colorants résiduels. Ensuite, régler le microscope à balayage laser confocal sur une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres. Puis configurer le logiciel d'imagerie à la fréquence et à la résolution souhaitées.Ensuite, localisez les glomérules en champ clair. Activez ensuite la détection du signal de fluorescence. Après cela, sélectionnez un plan focal souhaité et vérifiez l'intensité de la fluorescence sur les canaux flu oh four et firo red.Veillez à ce que le glomérule soit clairement visible en champ clair. Ensuite, enregistrez les variations d'intensité de fluorescence pour les signaux flu oh four et furor red. Pour importer la séquence d'images, séparez les canaux et utilisez le mode échelle de gris hyper pile.Dans le logiciel Image J, ouvrez une fenêtre du gestionnaire de zones d'intérêt (ROI) en suivant le chemin outils d'analyse, Gestionnaire ROI. Sélectionnez une ou plusieurs zones d'intérêt à l'aide de l'outil de sélection ovale et de la fonction ajouter T dans le gestionnaire ROI. Ensuite, sélectionnez la zone située en arrière-plan et enregistrez les zones d'intérêt sélectionnées.Ensuite, cochez la case correspondant à une ligne par tranche dans la boîte de dialogue, puis cliquez sur « OK » dans les options du menu. Définissez les mesures. Sélectionnez la valeur moyenne de gris et calculez les valeurs d'intensité des pixels pour chaque région d'intérêt (ROI), qui seront affichées dans la fenêtre des résultats en colonnes distinctes.Pour chaque ROI, copiez ensuite les valeurs d'intensité mesurées du ROI pour chaque canal dans le logiciel d'analyse de données choisi, puis soustrayez les valeurs d'intensité du fond pour chaque point de données à chaque point temporel. Calculez le rapport des intensités des canaux flu oh four sur les canaux URA red, puis représentez graphiquement les variations temporelles du transitoire calcique pour chaque ROI. Cette image montre la pipette de patch-clamp attachée au corps oxydé à la surface du glomérule de rat.Pendant un enregistrement électrophysiologique, une partie du glomérule encapsulé peut être observée dans le coin inférieur droit de l'image. Voici un tracé de courant représentatif de l'activité de canaux de type tripy, obtenu par une configuration « cell attached » réalisée sur le podocyte afin de mesurer la concentration intracellulaire de calcium. Les glomérules sont chargés avec flu oh 4:00 AM pour marquer le calcium intracellulaire.Ce vidéo illustre les effets du CIN et du chlorure de manganèse sur l'entrée de calcium dans les glomérules. Ce graphique quantifie les variations de l'intensité du signal flu oh four enregistrées à partir d'un seul podocyte en réponse au CIN et au chlorure de manganèse. Comme prévu, le CIN produit le maximum de fluorescence et le chlorure de manganèse éteint le colorant, conduisant à l'intensité de fluorescence la plus faible.L'application de ces médicaments permet au chercheur de définir ultérieurement la concentration exacte en calcium à l'intérieur de la cellule. Cette vidéo montre l'effet de 10 micromoles de TP sur la concentration en calcium dans les glomérules. Remarquez l'augmentation de la fluorescence verte du flu O quatre et la diminution de la fluorescence rouge du fu rouge, ce qui indique une augmentation de la concentration intracellulaire en calcium.Cette technique offre une opportunité unique de surveiller les modifications du flux calcique au niveau des canaux ioniques individuels et des cellules isolées, suite à des traitements pharmacologiques ou d'autres manipulations. Ainsi, cette approche constitue un outil très puissant, compte tenu du grand nombre de modèles de rongeurs génétiquement modifiés disponibles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des mesures des ions calcium dans les podocytes, ainsi que des expériences d'enregistrement électrophysiologique, utilisées soit conjointement, soit séparément.Ces techniques permettent d'obtenir une compréhension approfondie et mécanistique de la régulation du traitement du calcium par les podocytes dans des conditions normales et pathologiques.

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JoVE Journal

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protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

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Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

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