Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les changements de concentration intracellulaire de calcium en réponse à des agents pharmacologiques. Estimer les niveaux basaux de calcium et évaluer l’activité des canaux individuels dans les podocytes dans le cadre de l’ensemble du glomérule fraîchement isolé. Ceci est accompli en éliminant d’abord le sang des reins de rat par rinçage via l’aorte abdominale.

Ensuite, les reins sont prélevés et le cortex rénal est isolé et haché avec une lame de rasoir. Dans la troisième étape, les glomérules corticaux sont isolés par cing différentiel. Par la suite, les glomérules décapités isolés peuvent être soit soumis à des expériences électrophysiologiques, soit chargés de colorants fluorescents et prélevés pour des mesures confocales de concentration de calcium.

En fin de compte, ces procédures permettent aux chercheurs de résoudre des changements aigus dans la manipulation intracellulaire du calcium en réponse à l’application de divers agents et d’évaluer et de manipuler la conductance calcique au niveau des canaux ioniques uniques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle nous permet d’étudier les podocytes dans le cadre de l’ensemble du glomérule isolé. Notre préparation conserve le potentiel fonctionnel des podocytes.

Ils restent attachés aux capillaires et participent à l’homéostasie dans l’environnement qui peut en fait conserver la majeure partie de l’appareil de filtration des glomérules. L’implication de cette technique élargit notre dépistage pharmacologique Dans des états normaux et pathologiques, le mécanisme de manipulation du calcium par les podocytes joue un rôle régulateur essentiel dans le développement et la prévention des complications rénales dans des maladies telles que la néphropathie diabétique, la sclérose oméro-focale du segment focal ou l’hypertension. Il est très important d’observer la réactivité de l’afflux de calcium dans ces cellules aux médicaments, qui peuvent être facilement dépistés.

Dans cette préparation, VLA Hunka montrera comment rincer le rein pour les procédures suivantes. Je montrerai l’isolement des glomérules et l’électrophysiologie de la pince en V, et le Dr GaN vous guidera à travers l’imagerie confocale du calcium. Pour commencer cette procédure, placez un rat anesthésié sur la table d’opération à température contrôlée. Sous le microscope, faites une incision médiane sur l’abdomen pour découvrir la veine CVA et l’aorte.

Ensuite, insérez la ligature autour des artères cœliaque et mésentérique supérieure et de l’aorte abdominale au-dessus d’elles. Émoussée, disséquez l’aorte abdominale sous les artères rénales. Placez ensuite deux ligatures autour de lui, mais ne ligatez pas.

Fixez l’aorte au-dessus des ligatures et attachez le fil inférieur. Après cela, cathétérisez l’aorte avec un tube en polyéthylène qui est fixé à un pousse-seringue rempli de PBS sous la pince et fixez le cathéter avec une deuxième ligature. Retirez ensuite la pince et ligaturez-les.

Moi, les artères entériques et cœliaques. Infusez l’aorte avec du PBS pré-refroidi pendant trois minutes à raison de six millilitres par minute. Dans le même temps, faites une incision dans la veine du cava près des veines rénales pour soulager la pression.

Au bout de trois minutes, arrêtez la perfusion, excisez et encapsulez les reins. Placez-les dans une solution PBS sur de la glace. Préparez maintenant 30 millilitres de BSA frais à 5 % dans un milieu RPMI 1640.

À l’aide d’une lame de rasoir et de ciseaux, isolez le cortex des deux reins, puis MIT-les jusqu’à ce qu’ils soient homogènes. Ensuite, poussez le tissu haché à travers un tamis en acier inoxydable de 100 mailles qui a été pré-trempé dans une solution à 5 % P-S-A-R-P-M-I. Récupérez le flux et laissez-le passer à travers un siv de 140 mailles.

Ensuite, filtrez le flux collecté à partir du tamis de 140 mailles à l’aide d’un tamis de 200 mailles pré-trempé. Jetez le filtrat et lavez le tamis supérieur avec 10 à 15 millilitres de la solution préparée B-S-A-R-P-M-I et récupérez les glomérules du haut du tamis. Ensuite, placez la solution B-S-A-R-P-M-I contenant G Glomeruli dans une glace de 15 millilitres et laissez les glomérules sédimenter au fond du tube pendant 20 minutes maximum.

Dans cette procédure, enduisez des copeaux de verre de couverture de cinq millimètres sur cinq avec un poids moléculaire, de 70 000 à 150 000 polylysine et séchez-les sur une plaque chauffée. Ensuite, réchauffez les solutions expérimentales à température ambiante et remplissez la chambre de la pince à patch et la pipette Mélangez doucement la solution contenant des glomérules. Appliquez ensuite environ 50 microlitres de celui-ci sur chaque éclat de verre de couverture recouvert de polylysine.

Après cela, déplacez les éclats de verre avec les glomérules dans la chambre de serrage du patch. Prérempli avec la solution Beth. Perfuser la chambre à un rythme de trois millilitres par minute pendant une minute pour éliminer tout glomérule non attaché avant d’effectuer l’enregistrement conventionnel par pince de patch en mode attaché à la cellule.

Maintenant, placez 500 microlitres de la fraction glomérules dans chaque tube conique de 0,5 millilitre et ajoutez des colorants calciques rouges purs et la grippe oh 4h00 du matin. Ensuite, placez les tubes sur un agitateur rotatif jusqu’à une heure à température ambiante. Préparez ensuite les lamelles en verre avec de la polylysine et laissez-les sécher sur la plaque chauffante à 70 degrés Celsius. Une fois le chargement des matrices de calcium terminé, appliquez 100 microlitres de solution contenant des glomérules sur les lamelles recouvertes de polylysine et laissez-les coller à la surface pendant environ cinq minutes.

Ensuite, montez les lamelles de couverture attachées aux glomérules sur une chambre d’imagerie et perfusez-les avec une solution de bain à raison de trois millilitres par minute pour éliminer les glomérules non attachés et les colorants restants. Ensuite, réglez le microscope confocal à balayage laser sur une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres. Réglez ensuite le logiciel d’imagerie sur la fréquence et la résolution souhaitées.

Ensuite, trouvez les glomérules en fond clair. Activez ensuite la détection du signal de fluorescence. Après cela, sélectionnez le plan focal souhaité et vérifiez l’intensité de la fluorescence sur les canaux flu oh quatre et firo rouge.

Assurez-vous que le glomérule est clairement visible en fond clair. Enregistrez ensuite les changements d’intensité de fluorescence pour les signaux rouges de la grippe et de la fureur. Pour importer la séquence d’images, divisez les canaux et utilisez le mode d’échelle de gris hyper stack.

Dans le logiciel Image J, ouvrez une fenêtre de gestionnaire de ROI en suivant les outils d’analyse, chemin du gestionnaire de ROI. Sélectionnez une ou plusieurs régions d’intérêt à l’aide d’un outil de sélection ovale et de la fonction ajouter T dans le gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez ensuite la zone en arrière-plan et enregistrez les retours sur investissement sélectionnés.

Ensuite, cochez la case une ligne par tranche dans la boîte de dialogue et cliquez sur OK dans les résultats des options de menu. Réglez les mesures. Sélectionnez la valeur de gris moyenne et calculez les valeurs d’intensité des pixels pour chaque retour sur investissement, qui seront affichées dans la fenêtre de résultats dans des colonnes distinctes.

Pour chaque retour sur investissement, copiez les valeurs d’intensité du retour sur investissement mesurées pour chaque canal dans le logiciel d’analyse de données préféré et soustrayez les valeurs d’intensité d’arrière-plan de chaque point de données pour chaque point temporel. Calculez le rapport entre les intensités de la grippe oh quatre et les canaux rouges URA après ce graphique, les changements ponctuels dans le temps du calcium transitoire pour chaque ROI. Cette image montre la pipette patch clamp fixée au corps d’oxyde à la surface du glomérule de rat.

Lors d’un enregistrement électrophysiologique, une partie du glomérule encapsulé est visible dans le coin inférieur droit de l’image. Voici une trace actuelle représentative de l’activité des canaux tripy à partir d’un patch cellulaire fixé sur le podocyte pour mesurer la concentration intracellulaire de calcium. Glomeruli sont chargés de grippe oh 4h00 du matin pour étiqueter le calcium intracellulaire.

Cette vidéo illustre les effets de la CIN et du chlorure de manganèse sur l’afflux de calcium dans les glomérules. Ce graphique quantifie les changements dans l’intensité du signal de la grippe ou quatre enregistrés à partir d’un seul podocyte en réponse à la CIN et au chlorure de manganèse. Comme prévu, le CIN produit le maximum de fluorescence et le chlorure de manganèse éteint le colorant et permet d’obtenir l’intensité de fluorescence la plus faible.

L’application de ces médicaments permet au chercheur de définir plus tard la concentration exacte de calcium dans la cellule. Cette vidéo démontre l’effet de 10 micromoles par TP sur la concentration de calcium dans les glomérules. Notez qu’il y a une augmentation de la fluorescence de la grippe verte O quatre et une baisse de la fluorescence rouge de la grippe rouge, ce qui explique une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire.

Cette technique offre une occasion unique de surveiller les changements dans l’afflux de calcium au niveau du canal ionique unique et des cellules individuelles après des traitements pharmacologiques ou d’autres manipulations. Ainsi, cette approche représente un outil très puissant compte tenu des multiples modèles de rongeurs génétiquement modifiés disponibles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des mesures de l’ation calcique dans les podocytes de l’électrophysiologie, qui serrent les expériences utilisées ensemble tout seul.

Ces techniques fournissent un aperçu approfondi et mécaniste de la régulation de la manipulation du calcium avec des podocytes dans des conditions normales et pathologiques.