Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les variations de la concentration intracellulaire de calcium en réponse à des agents pharmacologiques. Estimer les niveaux basaux de calcium et évaluer l'activité individuelle des canaux dans les podocytes dans le cadre du glomérule fraîchement isolé entier. Ceci est réalisé en éliminant d'abord le sang des reins de rat par lavage via l'aorte abdominale.

Ensuite, les reins sont prélevés et le cortex rénal est isolé et haché à l’aide d’un rasoir. Dans la troisième étape, les glomérules corticaux sont isolés par centrifugation différentielle. Par la suite, les glomérules décapités isolés peuvent soit être soumis à des expériences électrophysiologiques, soit chargés avec des colorants fluorescents et utilisés pour des mesures de concentration calcique en microscopie confocale.

En fin de compte, ces procédures permettent aux chercheurs de résoudre les changements aigus du traitement intracellulaire du calcium en réponse à l'application de divers agents, et d'évaluer ainsi que de manipuler la conductance calcique au niveau de canaux ioniques individuels. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à étudier les podocytes en tant que partie intégrante du glomérule isolé entier. Notre préparation conserve le potentiel fonctionnel des podocytes.

Ils restent attachés aux capillaires et participent à l'homéostasie dans l'environnement qui peut effectivement conserver les parties majeures de l'appareil de filtration glomérulaire. Les implications de cette technique élargissent notre criblage pharmacologique. Dans les états normaux et pathologiques, le mécanisme de gestion du calcium par les podocytes joue un rôle régulateur essentiel dans le développement et la prévention des complications rénales dans des maladies telles que la néphropathie diabétique, la sclérose segmentaire focale ou l'hypertension. Il est très important d'observer la réponse de l'influx de calcium dans ces cellules aux médicaments, ce qui peut être facilement analysé.

Dans cette préparation, VLA Hunka démontrera comment perfuser le rein en vue des procédures suivantes. Je montrerai l'isolement des glomérules et la technique de microélectrode en clampage de voltage, et le Dr. GaN vous guidera à travers l'imagerie confocale du calcium. Pour commencer cette procédure, placez un rat anesthésié sur la table chirurgicale à température contrôlée. Sous le microscope, pratiquez une incision médiane sur l'abdomen afin de découvrir la veine CVA et l'aorte.

Ensuite, insérez une ligature autour des artères cœliaque et mésentérique supérieure et de l'aorte abdominale au-dessus de celles-ci. Disséquez par méthode contondante l'aorte abdominale en dessous des artères rénales. Placez ensuite deux ligatures autour de celle-ci, mais ne serrez pas.

Clipser l'aorte au-dessus des ligatures et nouer le fil inférieur. Ensuite, cathétériser l'aorte à l'aide d'un tube en polyéthylène raccordé à une pompe à seringue remplie de PBS en aval du clip, puis fixer le cathéter à l'aide d'une seconde ligature. Puis retirer le clip et effectuer la ligature.

Me artères mésentérique et cœliaque. Perfusionner l'aorte avec du PBS prérefroidi pendant trois minutes à un débit de six millilitres par minute. Simultanément, pratiquer une incision dans la veine cave près des veines rénales pour soulager la pression.

Après trois minutes, arrêter la perfusion, exciser et encapsuler les reins. Les placer dans une solution de PBS sur de la glace. Préparer maintenant 30 millilitres de solution fraîche de RPMI 1640 contenant 5 % de BSA.

À l’aide d’un rasoir et de ciseaux, isoler le cortex des deux reins, puis les hacher jusqu’à homogénéité. Ensuite, faire passer le tissu haché à travers un tamis en acier inoxydable de 100 mailles, préalablement imbibé de solution P-S-A-R-P-M-I à 5 %. Recueillir le filtrat et laisser passer celui-ci à travers un tamis de 140 mailles.

Ensuite, filtrez le flux recueilli provenant du tamis de 140 mailles à l’aide d’un tamis de 200 mailles préalablement imbibé. Jetez le filtrat et lavez le tamis supérieur avec 10 à 15 millilitres de la solution B-S-A-R-P-M-I préparée, puis récupérez les glomérules situés sur le dessus du tamis. Placez ensuite la solution B-S-A-R-P-M-I contenant les glomérules G dans un tube de 15 millilitres placé sur de la glace pilée et laissez les glomérules se sédimenter au fond du tube pendant un maximum de 20 minutes.

Dans cette procédure, recouvrez des lamelles de verre de cinq millimètres sur cinq millimètres de polylysine de masse moléculaire comprise entre 70 000 et 150 000, puis faites-les sécher sur un bloc chauffant. Ensuite, portez les solutions expérimentales à température ambiante, remplissez la chambre de mesure pour enregistrement en configuration patch et la pipette, puis mélangez délicatement la solution contenant les glomérules. Appliquez ensuite environ 50 microlitres de cette solution sur chaque lamelle recouverte de polylysine.

Ensuite, transférez les éclats de verre portant les glomérules vers la chambre de patch clamp préremplie avec la solution Beth. Parfuser la chambre à un débit de trois millilitres par minute pendant une minute afin d'éliminer les glomérules non attachés, avant d'effectuer l'enregistrement classique en mode patch clamp en configuration cellule attachée.

Maintenant, placer 500 microlitres de la fraction de glomérules dans chaque tube conique de 0,5 millilitre et ajouter les colorants calciques Pure Red AM et Fluoh 4:00 AM. Ensuite, placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant une heure maximum à température ambiante. Puis préparer les lamelles en verre avec de la polylysine et les laisser sécher sur la plaque chauffante à 70 degrés Celsius. Une fois le chargement des colorants calciques terminé, appliquer 100 microlitres de la solution contenant les glomérules sur les lamelles recouvertes de polylysine et laisser adhérer à la surface pendant environ cinq minutes.

Ensuite, monter les lamelles avec les glomérules fixés sur une chambre d'imagerie et les perfuser avec une solution bain à un débit de trois millilitres par minute afin d'éliminer les glomérules non fixés et les colorants résiduels. Ensuite, régler le microscope à balayage laser confocal sur une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres. Puis configurer le logiciel d'imagerie à la fréquence et à la résolution souhaitées.

Ensuite, localisez les glomérules en champ clair. Activez ensuite la détection du signal de fluorescence. Après cela, sélectionnez un plan focal souhaité et vérifiez l'intensité de la fluorescence sur les canaux flu oh four et firo red.

Veillez à ce que le glomérule soit clairement visible en champ clair. Ensuite, enregistrez les variations d'intensité de fluorescence pour les signaux flu oh four et furor red. Pour importer la séquence d'images, séparez les canaux et utilisez le mode échelle de gris hyper pile.

Dans le logiciel Image J, ouvrez une fenêtre du gestionnaire de zones d'intérêt (ROI) en suivant le chemin outils d'analyse, Gestionnaire ROI. Sélectionnez une ou plusieurs zones d'intérêt à l'aide de l'outil de sélection ovale et de la fonction ajouter T dans le gestionnaire ROI. Ensuite, sélectionnez la zone située en arrière-plan et enregistrez les zones d'intérêt sélectionnées.

Ensuite, cochez la case correspondant à une ligne par tranche dans la boîte de dialogue, puis cliquez sur « OK » dans les options du menu. Définissez les mesures. Sélectionnez la valeur moyenne de gris et calculez les valeurs d'intensité des pixels pour chaque région d'intérêt (ROI), qui seront affichées dans la fenêtre des résultats en colonnes distinctes.

Pour chaque ROI, copiez ensuite les valeurs d'intensité mesurées du ROI pour chaque canal dans le logiciel d'analyse de données choisi, puis soustrayez les valeurs d'intensité du fond pour chaque point de données à chaque point temporel. Calculez le rapport des intensités des canaux flu oh four sur les canaux URA red, puis représentez graphiquement les variations temporelles du transitoire calcique pour chaque ROI. Cette image montre la pipette de patch-clamp attachée au corps oxydé à la surface du glomérule de rat.

Pendant un enregistrement électrophysiologique, une partie du glomérule encapsulé peut être observée dans le coin inférieur droit de l'image. Voici un tracé de courant représentatif de l'activité de canaux de type tripy, obtenu par une configuration « cell attached » réalisée sur le podocyte afin de mesurer la concentration intracellulaire de calcium. Les glomérules sont chargés avec flu oh 4:00 AM pour marquer le calcium intracellulaire.

Ce vidéo illustre les effets du CIN et du chlorure de manganèse sur l'entrée de calcium dans les glomérules. Ce graphique quantifie les variations de l'intensité du signal flu oh four enregistrées à partir d'un seul podocyte en réponse au CIN et au chlorure de manganèse. Comme prévu, le CIN produit le maximum de fluorescence et le chlorure de manganèse éteint le colorant, conduisant à l'intensité de fluorescence la plus faible.

L'application de ces médicaments permet au chercheur de définir ultérieurement la concentration exacte en calcium à l'intérieur de la cellule. Cette vidéo montre l'effet de 10 micromoles de TP sur la concentration en calcium dans les glomérules. Remarquez l'augmentation de la fluorescence verte du flu O quatre et la diminution de la fluorescence rouge du fu rouge, ce qui indique une augmentation de la concentration intracellulaire en calcium.

Cette technique offre une opportunité unique de surveiller les modifications du flux calcique au niveau des canaux ioniques individuels et des cellules isolées, suite à des traitements pharmacologiques ou d'autres manipulations. Ainsi, cette approche constitue un outil très puissant, compte tenu du grand nombre de modèles de rongeurs génétiquement modifiés disponibles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des mesures des ions calcium dans les podocytes, ainsi que des expériences d'enregistrement électrophysiologique, utilisées soit conjointement, soit séparément.

Ces techniques permettent d'obtenir une compréhension approfondie et mécanistique de la régulation du traitement du calcium par les podocytes dans des conditions normales et pathologiques.