La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs

L'objectif général de cette vidéo est de décrire la méthodologie de conception et de test des capteurs fluorescents basés sur des cellules pour les neurotransmetteurs, ou CNiFERs, qui peuvent être utilisés pour surveiller optiquement la libération de neurotransmetteurs spécifiques in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant le moment et la libération de neuromodulateurs dans le cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être adaptée à tout type de neurotransmetteur ou de neuromodulateur signalant par l'intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G (GPCS).

La démonstration régionale de cette méthode est utile. L'injection in vivo et l'imagerie ultérieure des CNiFERs sont techniquement difficiles. Pour commencer cette procédure, observez les cellules HEK293 contenant le détecteur de calcium de type front et la protéine G chimérique dans un flacon T-25.

Ensuite, cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2, jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 50 %. Ensuite, aspirer le milieu du flacon T-25. Ajouter deux millilitres du mélange de milieu viral lent, puis incuber le flacon T-25 à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2.

Le lendemain, récolter les cellules HEK293 infectées en ajoutant un millilitre de trypsine. Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu de croissance pour HEK293. Ensemencer un millilitre de cellules dans un flacon T-75 pour la congélation et le stockage, et 1,5 millilitre de cellules dans un flacon T-25 pour l'analyse FACS.

Pour la courbe d'agoniste à 10 points, afin de tester les cellules infectées, ensemencer les deux premières rangées d'une plaque de 96 puits revêtue de fibronectine avec 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits. Ensuite, incuber les cellules HEK293 cultivées dans un flacon T-25, un flacon T-75 et une plaque de 96 puits jusqu'à une confluence d'environ 90 % à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant un à deux jours. Avant l'analyse FACS, déterminer l'expression fonctionnelle du RCPG en préparant une plaque de médicament avec 10 concentrations différentes d'agoniste encadrant la CE 50 prédite.

Préparez différentes concentrations d'agoniste en utilisant une méthode de dilution sérielle et créez un modèle pour suivre les concentrations du médicament. Ensuite, réglez la température du lecteur de plaques à 37 degrés Celsius. Puis, programmez le lecteur de plaques fluorométrique à 96 puits pour mesurer le fret et effectuer les transferts de solution.

Pour mesurer le FRET à l’aide d’un capteur génétiquement codé de calcium basé sur le FRET, TNXXL, réglez la longueur d’onde d’excitation à 436 nanomètres plus ou moins 4,5. Ensuite, réglez les filtres d’émission et les filtres de coupure pour l’ECFP et la citrine. Puis, programmez le lecteur de plaques pour mesurer les émissions toutes les quatre secondes, pendant un total de 180 secondes.

Choisissez les options pour un volume de plaque de 100 micro litres, une hauteur de pipette de 150 microlitres et une délivrance de 50 microlitres de produit chimique à partir de la plaque à composés triple. Réglez le point temporel de délivrance du produit à 30 secondes. Ensuite, aspirez le milieu des rangées A et B, puis ajoutez 100 microlitres de ACSF dans la plaque-sniffer de 96 puits, qui est environ à 90 % confluente.

Ensuite, chargez la plaque à trois concentrations de médicament et la plaque sniffer à 96 puits dans le lecteur de plaques. Laissez les plaques s'équilibrer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avant de démarrer le programme. Après l'analyse avec le lecteur de plaques, exportez les valeurs de fluorescence vers un fichier texte.

Ensuite, importer ce fichier dans un modèle de feuille de calcul préalablement créé qui normalise les intensités de fluorescence aux lignes de base pré-stimulus, calcule le rapport pic de FRET pour chaque concentration d'agoniste et génère une courbe dose-réponse. Préparer la pipette d'injection de CNiFER en plaçant une capillarité en verre sur un tire-électrode vertical. Utiliser une paire de forceps pour briser l'extrémité de l'électrode afin d'obtenir un diamètre d'environ 40 micromètres.

Placer une éponge imprégnée de ACSF sur une fenêtre crânienne mince de deux sur trois millimètres déjà réalisée chez une souris anesthésiée, afin de maintenir l'humidité pendant la préparation des cellules pour injection. Ensuite, récolter le clone CNiFER cultivé dans un flacon T-75 jusqu'à une confluence d'environ 80 %. Aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS stérile.

Éliminer le PBS et utiliser 10 millilitres de SCAF pour détacher les cellules du fond du flacon. Ensuite, triturer les cellules afin de dissocier les agrégats cellulaires. Centrifuger pendant deux minutes dans une centrifugeuse de culture cellulaire.

Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 100 microlitres de SCA. Ensuite, centrifuger pendant 30 secondes à 1400 × g et éliminer le surnageant, en laissant un culot recouvert de SCA. Par la suite, remplir la pipette d'injection avec de l'huile minérale.

Chargez la pipette sur un nanoinjecteur. Déposez cinq microlitres de suspension de cellules CNiFER sur une bande de film plastique paraffiné près de la préparation du souris. Aspirez les cellules CNiFER dans la pipette étirée.

Maintenant, déplacez la pipette vers les coordonnées cibles x et y. Abaissez les pipettes et percez le crâne aminci préparé précédemment. Poursuivez jusqu'à environ 200 à 400 micromètres sous la surface du crâne, dans les couches deux et trois du cortex.

Injectez 4,6 nanolitres de cellules CNiFER au site le plus profond à l’aide de la nano-injecteur. Observez le mouvement à l’interface entre l’huile et les cellules. Ensuite, attendez cinq minutes pour que les cellules se dispersent.

Retirez la pipette d’environ 100 micromètres et injectez à nouveau 4,6 nanolitres de cellules CNiFER, puis attendez cinq minutes. Ensuite, retirez lentement et délicatement la pipette afin d’éviter un reflux des CNiFER. Dans cette procédure, placez la plateforme d’imagerie avec la souris dont la tête est immobilisée sous un objectif à immersion dans l’eau de 10x sur un microscope d’imagerie à deux photons.

Insérez le cube de filtres pour l'imagerie FRET doté d'un miroir dichroïque à 505 nanomètres et de filtres passe-bande allant de 460 nanomètres à 500 nanomètres pour mesurer l'ECFP et de 520 nanomètres à 560 nanomètres pour mesurer la citrine. Ensuite, ajoutez de l'ACSF dans la cavité contenant la fenêtre de crâne amincie et abaissez l'objectif à immersion dans l'eau de 10x dans l'ACSF. Utilisez l'oculaire en conjonction avec la lampe au mercure et le cube de filtres GFP pour localiser les CNiFERs.

Passer maintenant à l'objectif à immersion dans l'eau 40x. Ensuite, sélectionner le trajet lumineux approprié pour l'imagerie à deux photons. Allumer le laser à impulsions femtosecondes dans le proche infrarouge.

Sélectionnez la longueur d'onde de 820 nanomètres et un réglage de puissance de 5 à 15 %. Réglez la tension du PMT un et du PMT deux à une valeur submaximale, généralement comprise entre 500 et 1000 volts, selon le PMT. Ensuite, réglez le gain à un pour chaque canal, et mettez à zéro la position z de l'objectif. Abaissez l'objectif d'environ 100 à 200 micromètres par rapport à la surface corticale, puis démarrez la numérisation xy.

Réglez la puissance du laser, le gain et la tension du tube photomultiplicateur (PMT) pour chaque canal afin d'optimiser le rapport signal sur bruit de la fluorescence des CNiFER. Ensuite, utilisez le logiciel pour restreindre l’imagerie à une région contenant les cellules CNiFER ainsi qu’une région de fond. Sélectionnez la ligne de Cowman avec une moyenne de deux pour un rapport signal sur bruit approprié, et utilisez une fréquence de balayage de 3 à 1 hertz avec quatre microsecondes par pixel.

Ensuite, dessinez une région d'intérêt (ROI) autour des cellules CNiFER. Entourez environ trois à quatre cellules par plan. Configurez l'analyse en temps réel des intensités moyennes de la ROI.

Ensuite, commencez l'acquisition afin de surveiller la fluorescence des CNiFER au fil du temps et débutez la stimulation électrique ou l'expérience comportementale, tout en surveillant le transfert d'énergie par résonance de type FRET. Dans cet exemple, la réponse FRET des CNiFER D2R a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques équipé d'un système de délivrance de solutions. Ce graphique montre la réponse FRET durant l'application de dopamine sur des CNiFER D2.

Remarquez que l'émission d'ECFP diminue tandis que l'émission de citrine augmente en présence de dopamine. Voici un graphique du rapport FRET correspondant. Sont représentées ici les courbes de réponse dose-dépendante de la réponse des D2 CNiFERs à la dopamine et à la norépinéphrine.

En outre, les CNiFERs de contrôle réactifs dépourvus du D2R sont présentés. Ce diagramme en barres montre la réponse du rapport FRET à d'autres neurotransmetteurs et modulateurs à 50 nanomolaires et à 1 micromolaire. Ici, la stimulation électrique des neurones à DA dans la substance noire induit un changement important du rapport FRET pour les CNiFERs D2.

Remarquez comment l'amplitude de la réponse augmente avec une intensité croissante de la stimulation électrique. Le couplage de la stimulation avec une injection de cocaïne amplifie la réponse du CNiFER. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer, tester et utiliser les CNiFERs pour l'imagerie in vivo.

Au cours du développement des CNiFERs, il est essentiel de maintenir une technique stérile, car ces cellules seront finalement implantées chez des souris vivantes. La mise au point des CNiFERs fournit un outil important pour les recherches en neurosciences, permettant de mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur ou neuromodulateur qui agit via un récepteur couplé à une protéine G. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos expériences.