La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs In Vivo

L’objectif général de cette vidéo est de décrire la méthodologie de construction et de test de Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Reporters, ou CNiFERs, qui peuvent être utilisés pour surveiller optiquement la libération de neurotransmetteurs spécifiques in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant le moment et la libération des neuromodulateurs dans le cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être adaptée à tout type de neurotransmetteur ou de neuromodulateur, qui signale via GPCS.

Une démonstration régionale de cette méthode est utile. Il s’agit de l’injection in vivo, et l’imagerie ultérieure des CNiFER est techniquement difficile. Pour commencer cette procédure, voir les cellules HEK293 qui contiennent le détecteur de calcium basé à l’avant et la protéine g chimérique dans une fiole T-25.

Ensuite, cultivez les cellules dans un incubateur humidifié, à 37 degrés Celsius, avec 5 pour cent de CO2, jusqu’à environ 50 % de confluent. Ensuite, aspirez le support de la fiole T-25. Ajoutez deux millilitres de mélange de milieu de virus lenta et incubez le ballon T-25 à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2.

Le lendemain, récoltez les cellules HEK293 infectées en ajoutant un millilitre de trypsine. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de croissance HEK293. Ensemencez un millilitre de cellules dans une fiole T-75 pour la congélation et le stockage, et 1,5 millilitre de cellules dans une fiole T-25 pour l’analyse FACS.

Pour la courbe agoniste en 10 points, pour tester les cellules infectées, ensemencez les deux premières rangées d’une plaque de 96 puits enrobée de fibronectine avec 100 microlitres de suspension cellulaire par puits. Ensuite, incubez les cellules HEK293 en croissance dans une fiole T-25, une fiole T-75 et une plaque à 96 puits jusqu’à environ 90 % de confluent à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant un à deux jours. Avant l’analyse FACS, déterminez l’expression fonctionnelle du RCPG en préparant une plaque de médicament avec 10 concentrations d’agonistes différentes qui correspondent à l’EC 50 prévue.

Préparez différentes concentrations d’agoniste à l’aide d’une méthode de dilution en série et créez un modèle pour suivre les concentrations du médicament. Ensuite, réglez la température du lecteur de plaques sur 37 degrés Celsius. Ensuite, programmez le lecteur de plaques fluorométriques à 96 puits pour mesurer l’arbre et effectuer des transferts de solution.

Pour mesurer la frette à l’aide d’un capteur de calcium basé sur la frette codé génétiquement, TNXXL, réglez la longueur d’onde d’excitation à 436 plus ou moins 4,5 nanomètres. Ensuite, réglez les filtres d’émission, et les filtres de coupure, pour l’ECFP et la citrine. Ensuite, programmez le lecteur de plaques pour qu’il mesure les émissions toutes les quatre secondes, pour un total de 180 secondes.

Choisissez les options pour un volume de plaque de 100 microleaders, une hauteur de pipette de 150 microlitres et la distribution de 50 microlitres de médicament à partir de la plaque composée à trois volets. Réglez le délai d’administration du médicament à 30 secondes. Après cela, aspirez le milieu des rangées A et B et ajoutez 100 microlitres d’ACSF dans la plaque de reniflage à 96 puits, soit environ 90 % de confluent.

Ensuite, chargez la plaque de médicament à trois volets et la plaque de reniflage à 96 puits dans le lecteur de plaques. Attendez 30 minutes pour équilibrer les plaques à 37 degrés Celsius, avant de commencer le programme. Une fois le lecteur de plaques exécuté, exportez les valeurs du lecteur de fluorescence dans un fichier texte.

Ensuite, importez ce fichier dans un modèle de tableur précédemment créé qui normalise les intensités de fluorescence aux lignes de base pré-stimulus, calcule le rapport de frette maximal pour chaque concentration d’agoniste et génère une courbe dose-réponse. Préparez la pipette d’injection CNiFER en plaçant un capillaire en verre sur un extracteur d’électrode vertical. À l’aide d’une paire de pinces, cassez la pointe de l’électrode pour lui donner un diamètre d’environ 40 micromètres.

Placez une éponge imbibée d’ACSF sur une fenêtre crânienne de deux millimètres sur trois millimètres d’une souris anesthésiée, pour rester humide tout en préparant les cellules pour l’injection. Ensuite, récoltez le clone CNiFER qui a été cultivé dans une fiole T-75 jusqu’à environ 80 % de confluence. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS stérile.

Retirez le PBS et utilisez 10 millilitres d’ACFS pour déloger les cellules du fond du flacon. Ensuite, tritcherez les cellules pour dissocier les amas de cellules. Centrifuger pendant deux minutes dans une centrifugeuse de culture cellulaire.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 100 microlitres d’ACSF. Ensuite, centrifugez pendant 30 secondes à 1400 fois G, et retirez le surnageant, en laissant une pastille, recouverte d’ACSF. Ensuite, remplissez à nouveau la pipette d’injection avec de l’huile minérale.

Chargez la pipette sur un nano-injecteur. Mettez cinq microlitres de suspension cellulaire CNiFER sur une bande de film de paraffine plastique près de la préparation de souris. Aspirez les cellules CNiFER dans la pipette tirée.

Maintenant, déplacez la pipette jusqu’aux coordonnées x et y cibles. Abaissez les pipettes, et percez le crâne aminci, préparé au préalable. Continuez jusqu’à environ 200 à 400 micromètres sous la surface du crâne, dans les couches deux et trois du cortex.

Injectez 4,6 nanolitres de cellules CNiFER au site le plus profond avec le nano-injecteur. Notez le mouvement dans l’interface entre l’huile et la cellule. Et puis, attendez cinq minutes que les cellules se distribuent.

Retirez la pipette d’environ 100 micromètres et injectez 4,6 nanolitres supplémentaires de cellules CNiFER et attendez à nouveau cinq minutes. Ensuite, retirez la pipette lentement et doucement pour éviter le reflux des CNiFERs. Dans cette procédure, placez la plate-forme d’imagerie avec la souris retenue par la tête sous un objectif d’immersion dans l’eau 10x dans un microscope imageur à deux photons.

Insérez le cube de filtre pour l’imagerie à frettes doté d’un miroir dichroïque à 505 nanomètres et de filtres passe-bande qui s’étendent sur 460 nanomètres à 500 nanomètres pour mesurer l’ECFP et de 520 nanomètres à 560 nanomètres pour mesurer la citrine. Ensuite, ajoutez l’ACSF dans le puits, contenant la fenêtre du crâne amincie et abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau 10x dans l’ACSF. Utilisez l’oculaire en conjonction avec une lampe au mercure et le cube de filtre GFP pour localiser les CNiFERs.

Maintenant, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 40x. Ensuite, sélectionnez le chemin lumineux approprié pour l’imagerie à deux photons. Activez le laser à impulsions femtosecondes dans le proche infrarouge.

Sélectionnez la longueur d’onde de 820 nanomètres et un réglage de puissance de cinq à 15 %Réglez la tension pmt un et pmt deux à une valeur sous-maximale, généralement 500-1000 volts, selon le pmt. Ensuite, réglez le gain sur un pour chaque canal et mettez à zéro la position z pour l’objectif. Abaissez l’objectif d’environ 100 à 200 micromètres de la surface corticale et lancez le balayage xy.

Ajustez la puissance laser, le gain et la tension pmt pour chaque canal afin d’optimiser le rapport signal/bruit de la fluorescence du CNiFER. Ensuite, utilisez le logiciel pour restreindre l’imagerie à une région contenant les cellules CNiFER, ainsi qu’une région d’arrière-plan. Sélectionnez la ligne cowman, avec une moyenne de deux, pour un rapport signal/bruit approprié, et utilisez une fréquence de balayage de 3 à un hertz à quatre microsecondes par pixel.

Ensuite, dessinez un retour sur investissement autour des cellules CNiFER. Entourant environ trois à quatre cellules par plan. Mettez en place une analyse en temps réel des intensités moyennes du ROI.

Ensuite, commencez l’acquisition pour surveiller la florescence de CNiFER au fil du temps et commencez la stimulation électrique ou l’expérience comportementale, tout en surveillant l’agitation. Dans cet exemple, la réponse de D2R CNiFER fret a été mesurée sur un lecteur de plaques avec un système de distribution de solution. Ce graphique montre la réponse de Fret lors de l’application de dopamine aux CNiFER D2.

Notez que l’émission d’ECFP diminue tandis que l’émission de citrine augmente avec la dopamine. Et voici un graphique du rapport des frettes correspondant. Voici les courbes dose-réponse pour la réponse des CNiFER D2 à la dopamine et à la noradrénaline.

De plus, le contrôle réactif des CNiFER dépourvus du D2R est présenté. Ce graphique à barres montre la réponse du rapport de frette pour d’autres neurotransmetteurs et modulateurs à 50 nanomolaires et une micromolaire. Ici, la stimulation électrique des neurones DA dans la substance noire provoque un grand changement dans le rapport des frettes pour les CNiFER D2.

Notez comment l’amplitude de la réponse augmente avec l’intensité croissante de la stimulation électrique. Le couplage de la stimulation avec l’injection de cocaïne augmente la réponse CNiFER. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la création, du test et de l’utilisation des CNiFER pour l’imagerie in vivo.

Tout au long du développement des CNiFERs, il est essentiel de maintenir une technique stérile, car ces cellules seront finalement implantées dans des souris vivantes. La réalisation des CNiFER fournit un outil important pour les recherches dans le domaine des neurosciences afin de mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur, ou neuromodulateur, qui signale par le biais d’un récepteur couplé à la protéine G. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.