Name: La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Découvrez la construction de CNiFERs utilisant des cellules HEK293 pour la détection optique des neurotransmetteurs in vivo. Cette méthode permet de surveiller en temps réel la libération de neuromodulateurs dans le cerveau.

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Nous remercions B. Conklin (Université de Californie, San Francisco) pour fournir les qi5 G et G QS5 cDNA, A. Schweitzer pour l&#39; assistance à l&#39;électronique, N. Taylor pour l&#39; aide au dépistage des clones, Ian Glaaser et Robert Rifkin pour la relecture et Olivier Griesbeck pour TN-XXL. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche par le biais de l&#39;Institut national américain sur l&#39;abus des drogues (NIDA) (DA029706; DA037170), l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) et le &quot;Neuroscience liés à la drogue de subvention de formation des abus »par NIDA (DA007315).

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<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La création de CNiFERs offre une stratégie innovante et unique pour mesurer optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. CNiFERs sont parfaitement adaptés pour la mesure de libération extrasynaptique, à savoir, le volume de conduction, pour les neurotransmetteurs. Surtout, chacun CNiFER possède les propriétés du RCPG natif, fournissant une mesure optique physiologique des changements dans les niveaux de neurotransmetteurs dans le cerveau. À ce jour, CNiFERs ont été créés pou...

Pour bien comprendre comment les neurones communiquent dans le cerveau, il est nécessaire d&#39;avoir une méthode pour mesurer la libération de neurotransmetteurs in vivo. Il existe plusieurs techniques bien établies pour la mesure in vivo des neurotransmetteurs. Une technique couramment utilisée est microdialyse, dans laquelle une canule est insérée dans le cerveau et un faible volume de liquide céphalorachidien est recueillie et analysée par chromatographie en phase liquide à haute performance et détection électrochimique 1. Microdialyse a une résolution spatiale de l&#39;ordre de quelques diamètres de la sonde, par exemple environ 0,5 mm pour un diamètre microsonde 200 um. La résolution temporelle de cette technique, cependant, est lente en raison des intervalles d&#39; échantillonnage qui durent généralement environ 5 minutes ou plus 1. En outre, les analyses ne sont pas faites en temps réel. Une autre technique consiste à balayage rapide voltamétrie cyclique (FSCV), qui utilise une sonde en fibre de carbone qui est insérée dans le cerveau. FSCV a une excellente températurerésolution orale (subsecond), haute sensibilité (nanomolaire), et la résolution spatiale avec des diamètres de sonde de 5 à 30 um. Cependant, FSCV est limitée aux émetteurs qui produisent une oxydation caractéristique et le profil de réduction avec la tension sur une sonde potentiométrique de carbone 2. Une troisième technique pour mesurer les neurotransmetteurs est directement à travers neurotransmetteurs génétiquement codés (NT) biocapteurs 3. Avec cette méthode, une protéine de fusion est créée qui contient un domaine de liaison de ligand pour un émetteur couplé à un transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET) paire à base de fluorophores 4 ou 5 permuté une GFP. Contrairement aux deux procédés précédents, ces biocapteurs sont génétiquement codées et exprimées sur la surface d&#39;une cellule hôte, telle qu&#39;un neurone, grâce à la production d&#39;animaux transgéniques ou aiguë avec l&#39;utilisation d&#39;agents viraux pour infecter des cellules. À ce jour, les biocapteurs génétiquement codés ont été seulement développé pour detecting de glutamate et de GABA 05/03. Limitations avec ces techniques ont été la faible sensibilité, dans la gamme nM, et l&#39;incapacité à élargir la détection du grand nombre d&#39;émetteurs, par exemple, les neurotransmetteurs classiques, neuropeptides et neuromodulateurs, qui signalent par G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). En fait, il y a près de 800 GPCR dans le génome humain. Pour combler ces lacunes, nous avons développé un outil innovant pour mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur qui signale par un GPCR. CNiFERs (fluorescente neurotransmetteur à base de cellules rapporteurs modifiés) sont des cellules HEK293 clonales modifiées pour exprimer un GPCR spécifique qui, lorsqu&#39;il est stimulé, provoque une augmentation intracellulaire [Ca 2+] , qui est détecté par un capteur à base de Ca 2+ FRET codé génétiquement, TN-XXL. Ainsi, CNiFERs transformer la liaison en un changement de fluorescence, en fournissant un r optique en temps réel directe et récepteur neurotransmetteuread-out de l&#39;activité des neurotransmetteurs local. En utilisant le récepteur natif pour un neurotransmetteur donné, CNiFERs conserver la spécificité chimique, l&#39; affinité et la dynamique temporelle des récepteurs endogènes exprimés. À ce jour, nous avons créé trois types de CNiFERs, un pour la détection de l&#39; acétylcholine en utilisant le récepteur M1, un pour la détection de la dopamine en utilisant le récepteur D2 et une pour la détection de la norépinéphrine à l&#39; aide du 6,7 récepteur α1a. La technologie CNiFER est facilement extensible et évolutive, ce qui rend prête à tout type de GPCR. Dans cet article JoVE, nous décrivons et illustrons la méthodologie pour concevoir, réaliser et test CNiFERs in vivo pour toute application.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp ;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Clonage : pour la génération de lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Tube à essai à fond rond en polypropylène haute clarté</td><td>BD Biosciences 352063</td><td></td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon strainers</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine EDTA&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Plaque à puits, fond plat, transparent&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 96 puits&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux fond noir transparent&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>3603</td><td>Flexstation Pointes</td></tr><tr><td>de pipette Flexstation</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Chlorure d’acétylcholine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinephrine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Chlorhydrate de dopamine Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamate&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Épinéphrine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatine&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp ;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>12-P-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substance &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adénosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Mélatonine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques de fluorescence & logiciel</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp ; DMEM (hyperglycémie) avec Glutamax&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Culture tissulaire</td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Culture tissulaire</td></tr><tr><td>&nbsp ; Stylo/Streptocoque&nbsp ; antibiotiques</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Culture tissulaire</td></tr><tr><td>&nbsp ; Puromycine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Culture tissulaire</td></tr><tr><td>&nbsp ; Fibronectine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Culture</td></tr><tr><td>tissulaire CoolCell LX Boîte de congélation cellulaire sans alcool à débit contrôlé</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>Culture tissulaire</td></tr><tr><td>colle cyanoacrylate&nbsp ;</td><td>Loctite</td><td>Loctite n° 495</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>film de paraffine plastique.</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg ;</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Nanoinjecteur</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Électrodes en verre</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Foret à main</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>Chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Meules pour foret</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05 ; 19007-07)</td><td>chirurgie et injection</td></tr> <tr><td>stéréotaxiqueBain de stérilisation</td><td>FST</td><td>18000-45, Stérilisateur à billes chaudes</td><td>pour la chirurgie et l’injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Chambre/masque isoflurane</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Machine d’anesthésie de table avec vaporisateur d’isoflurane, débitmètre O2, vanne gang ; 564-0852, Chambre d’induction 16X7X7.5cm</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>3D scope avec bras</td><td>Chirurgie Zeiss</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>chirurgie de la lumière</td><td></td><td></td> par fibre optique <td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Bétadine&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>70 % (v/v) alcool isopropylique</td><td></td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pads</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>NaCl 0,9 % (injection, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td><td></td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Buprenex (injection) buprénorphine (0,03 &mu ; g par g rongeur)</td><td>Chirurgie Sigma-Aldrich</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique&nbsp ;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Chirurgie Ethicon</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Grip ciment dentaire</td><td>Dentsply</td><td>#675571,</td><td>chirurgie 675572 et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp ;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>n° 0 verre de couverture Chirurgie</td><td>Fisher</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>cadre stéréotaxique&nbsp ;</td>Chirurgie <td>Kopf</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Sonde rectale et coussin chauffant</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, Régulateur de température DC, 40-90-2-06, Coussin chauffant 6,5X9,5cm40-90-5D-02, Sonde à thermistance rectale</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Plaque d’essai optique pour l’imagerie</td><td>Chirurgie Thorlabs</td><td></td><td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (élastomère de silicone)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Suture&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11252-30 ; #55, 11295-51 ; Grafe, 11050-10</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Kit de cautérisation des petits vaisseaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18000-00</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Stérilisateurs à billes chaudes</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18000-45</td><td>chirurgie et injection</td></tr> <tr><td>stéréotaxiqueBoîtier d’instrument avec tapis en silicone</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>20311-21</td> chirurgie <td>et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Récipients de stérilisation en plastique avec tapis en silicone</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>20810-01</td><td>chirurgie et injection stéréotaxique</td></tr><tr><td>Lunette de fluorescence à platification fixe 2P pour l’imagerie in vivo</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Laser</td> <td>multiphotonSpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>xy base translationnelle</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Cube de filtre FRET pour YFP et CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>Objectifs d’immersion dans l’eau 10x et 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imagerie in vivo</td></tr><tr><td>table d’air</td><td>Imagerie in vivo</td> <td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>cage étanche à la lumière construite sur mesure</td><td>Imagerie in vivo</td> <td>Thorlab</td><td></td></tr></tbody></table>

la construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur engineered reporters (cnifers) pour la détection optique des neurotransmetteurs<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Reporters base de cellules fluorescentes neurotransmetteur d&#39; ingénierie (CNiFERs) fournissent un nouvel outil pour les neuroscientifiques pour détecter optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. Un CNiFER spécifique est créé à partir d&#39; une cellule de rein embryonnaire humain qui exprime de manière stable un récepteur spécifique G couplé à la protéine, qui couple à G q / 11 protéines G, et un Ca 2+ -detector à base de FRET, TN-XXL. L&#39;activation du récepteur conduit à une augmentation du signal FRET. CNiFERs ont une sensibilité nM et une réponse temporelle de secondes parce qu&#39;un clone CNiFER utilise le récepteur natif pour un neurotransmetteur particulier, par exemple, D2R pour la dopamine. CNiFERs sont directement implantés dans le cerveau, ce qui leur permet de détecter la libération des neurotransmetteurs avec une résolution spatiale inférieure à cent um, ce qui les rend idéales pour mesurer la transmission de volume in vivo. CNiFERs peut également être utilisé pour dépister d&#39; autres médicaments pour la réactivité croisée potentielle dans vivo. Nous avons récemment élargi la famille de CNiFERs pour inclure GPCR ce couple à G i / o protéines G. CNiFERs sont disponibles pour la détection de l&#39;acétylcholine (Ach), la dopamine (DA) et la norepinephrine (NE). Étant donné que toute GPCR peut être utilisé pour créer un roman CNiFER et qu&#39;il ya environ 800 GPCR dans le génome humain, nous décrivons ici la procédure générale pour concevoir, réaliser et tester tout type de CNiFER.

Un CNiFER est dérivé d&#39;un rein embryonnaire (HEK293) cellule humaine qui est modifiée pour exprimer de façon stable au moins deux protéines: une protéine G spécifique des récepteurs couplés (GPCR) et une [Ca2 +] capteur codé génétiquement, TN-TTG. TN-XXL subit un transfert de résonance de fluorescence d&#39;énergie (FRET) entre cyan et jaune fluorescent protéines, ECFP et Citrine, respectivement, en réponse à des ions Ca 2+ 6,15. L&#39; activation de ...

Nous présentons un protocole pour créer journalistes neurotransmetteur fluorescents à base de cellules modifiées (CNiFERs) pour la détection optique de la libération de neurotransmetteurs volumétrique.

La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

L'objectif général de cette vidéo est de décrire la méthodologie de conception et de test des capteurs fluorescents basés sur des cellules pour les neurotransmetteurs, ou CNiFERs, qui peuvent être utilisés pour surveiller optiquement la libération de neurotransmetteurs spécifiques in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant le moment et la libération de neuromodulateurs dans le cerveau. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être adaptée à tout type de neurotransmetteur ou de neuromodulateur signalant par l'intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G (GPCS).La démonstration régionale de cette méthode est utile. L'injection in vivo et l'imagerie ultérieure des CNiFERs sont techniquement difficiles. Pour commencer cette procédure, observez les cellules HEK293 contenant le détecteur de calcium de type front et la protéine G chimérique dans un flacon T-25.Ensuite, cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2, jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 50 %. Ensuite, aspirer le milieu du flacon T-25. Ajouter deux millilitres du mélange de milieu viral lent, puis incuber le flacon T-25 à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2.Le lendemain, récolter les cellules HEK293 infectées en ajoutant un millilitre de trypsine. Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu de croissance pour HEK293. Ensemencer un millilitre de cellules dans un flacon T-75 pour la congélation et le stockage, et 1,5 millilitre de cellules dans un flacon T-25 pour l'analyse FACS.Pour la courbe d'agoniste à 10 points, afin de tester les cellules infectées, ensemencer les deux premières rangées d'une plaque de 96 puits revêtue de fibronectine avec 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits. Ensuite, incuber les cellules HEK293 cultivées dans un flacon T-25, un flacon T-75 et une plaque de 96 puits jusqu'à une confluence d'environ 90 % à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant un à deux jours. Avant l'analyse FACS, déterminer l'expression fonctionnelle du RCPG en préparant une plaque de médicament avec 10 concentrations différentes d'agoniste encadrant la CE 50 prédite.Préparez différentes concentrations d'agoniste en utilisant une méthode de dilution sérielle et créez un modèle pour suivre les concentrations du médicament. Ensuite, réglez la température du lecteur de plaques à 37 degrés Celsius. Puis, programmez le lecteur de plaques fluorométrique à 96 puits pour mesurer le fret et effectuer les transferts de solution.Pour mesurer le FRET à l’aide d’un capteur génétiquement codé de calcium basé sur le FRET, TNXXL, réglez la longueur d’onde d’excitation à 436 nanomètres plus ou moins 4,5. Ensuite, réglez les filtres d’émission et les filtres de coupure pour l’ECFP et la citrine. Puis, programmez le lecteur de plaques pour mesurer les émissions toutes les quatre secondes, pendant un total de 180 secondes.Choisissez les options pour un volume de plaque de 100 micro litres, une hauteur de pipette de 150 microlitres et une délivrance de 50 microlitres de produit chimique à partir de la plaque à composés triple. Réglez le point temporel de délivrance du produit à 30 secondes. Ensuite, aspirez le milieu des rangées A et B, puis ajoutez 100 microlitres de ACSF dans la plaque-sniffer de 96 puits, qui est environ à 90 % confluente.Ensuite, chargez la plaque à trois concentrations de médicament et la plaque sniffer à 96 puits dans le lecteur de plaques. Laissez les plaques s'équilibrer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avant de démarrer le programme. Après l'analyse avec le lecteur de plaques, exportez les valeurs de fluorescence vers un fichier texte.Ensuite, importer ce fichier dans un modèle de feuille de calcul préalablement créé qui normalise les intensités de fluorescence aux lignes de base pré-stimulus, calcule le rapport pic de FRET pour chaque concentration d'agoniste et génère une courbe dose-réponse. Préparer la pipette d'injection de CNiFER en plaçant une capillarité en verre sur un tire-électrode vertical. Utiliser une paire de forceps pour briser l'extrémité de l'électrode afin d'obtenir un diamètre d'environ 40 micromètres.Placer une éponge imprégnée de ACSF sur une fenêtre crânienne mince de deux sur trois millimètres déjà réalisée chez une souris anesthésiée, afin de maintenir l'humidité pendant la préparation des cellules pour injection. Ensuite, récolter le clone CNiFER cultivé dans un flacon T-75 jusqu'à une confluence d'environ 80 %. Aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS stérile.Éliminer le PBS et utiliser 10 millilitres de SCAF pour détacher les cellules du fond du flacon. Ensuite, triturer les cellules afin de dissocier les agrégats cellulaires. Centrifuger pendant deux minutes dans une centrifugeuse de culture cellulaire.Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 100 microlitres de SCA. Ensuite, centrifuger pendant 30 secondes à 1400 × g et éliminer le surnageant, en laissant un culot recouvert de SCA. Par la suite, remplir la pipette d'injection avec de l'huile minérale.Chargez la pipette sur un nanoinjecteur. Déposez cinq microlitres de suspension de cellules CNiFER sur une bande de film plastique paraffiné près de la préparation du souris. Aspirez les cellules CNiFER dans la pipette étirée.Maintenant, déplacez la pipette vers les coordonnées cibles x et y. Abaissez les pipettes et percez le crâne aminci préparé précédemment. Poursuivez jusqu'à environ 200 à 400 micromètres sous la surface du crâne, dans les couches deux et trois du cortex.Injectez 4,6 nanolitres de cellules CNiFER au site le plus profond à l’aide de la nano-injecteur. Observez le mouvement à l’interface entre l’huile et les cellules. Ensuite, attendez cinq minutes pour que les cellules se dispersent.Retirez la pipette d’environ 100 micromètres et injectez à nouveau 4,6 nanolitres de cellules CNiFER, puis attendez cinq minutes. Ensuite, retirez lentement et délicatement la pipette afin d’éviter un reflux des CNiFER. Dans cette procédure, placez la plateforme d’imagerie avec la souris dont la tête est immobilisée sous un objectif à immersion dans l’eau de 10x sur un microscope d’imagerie à deux photons.Insérez le cube de filtres pour l'imagerie FRET doté d'un miroir dichroïque à 505 nanomètres et de filtres passe-bande allant de 460 nanomètres à 500 nanomètres pour mesurer l'ECFP et de 520 nanomètres à 560 nanomètres pour mesurer la citrine. Ensuite, ajoutez de l'ACSF dans la cavité contenant la fenêtre de crâne amincie et abaissez l'objectif à immersion dans l'eau de 10x dans l'ACSF. Utilisez l'oculaire en conjonction avec la lampe au mercure et le cube de filtres GFP pour localiser les CNiFERs.Passer maintenant à l'objectif à immersion dans l'eau 40x. Ensuite, sélectionner le trajet lumineux approprié pour l'imagerie à deux photons. Allumer le laser à impulsions femtosecondes dans le proche infrarouge.Sélectionnez la longueur d'onde de 820 nanomètres et un réglage de puissance de 5 à 15 %. Réglez la tension du PMT un et du PMT deux à une valeur submaximale, généralement comprise entre 500 et 1000 volts, selon le PMT. Ensuite, réglez le gain à un pour chaque canal, et mettez à zéro la position z de l'objectif. Abaissez l'objectif d'environ 100 à 200 micromètres par rapport à la surface corticale, puis démarrez la numérisation xy.Réglez la puissance du laser, le gain et la tension du tube photomultiplicateur (PMT) pour chaque canal afin d'optimiser le rapport signal sur bruit de la fluorescence des CNiFER. Ensuite, utilisez le logiciel pour restreindre l’imagerie à une région contenant les cellules CNiFER ainsi qu’une région de fond. Sélectionnez la ligne de Cowman avec une moyenne de deux pour un rapport signal sur bruit approprié, et utilisez une fréquence de balayage de 3 à 1 hertz avec quatre microsecondes par pixel.Ensuite, dessinez une région d'intérêt (ROI) autour des cellules CNiFER. Entourez environ trois à quatre cellules par plan. Configurez l'analyse en temps réel des intensités moyennes de la ROI.Ensuite, commencez l'acquisition afin de surveiller la fluorescence des CNiFER au fil du temps et débutez la stimulation électrique ou l'expérience comportementale, tout en surveillant le transfert d'énergie par résonance de type FRET. Dans cet exemple, la réponse FRET des CNiFER D2R a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques équipé d'un système de délivrance de solutions. Ce graphique montre la réponse FRET durant l'application de dopamine sur des CNiFER D2.Remarquez que l'émission d'ECFP diminue tandis que l'émission de citrine augmente en présence de dopamine. Voici un graphique du rapport FRET correspondant. Sont représentées ici les courbes de réponse dose-dépendante de la réponse des D2 CNiFERs à la dopamine et à la norépinéphrine.En outre, les CNiFERs de contrôle réactifs dépourvus du D2R sont présentés. Ce diagramme en barres montre la réponse du rapport FRET à d'autres neurotransmetteurs et modulateurs à 50 nanomolaires et à 1 micromolaire. Ici, la stimulation électrique des neurones à DA dans la substance noire induit un changement important du rapport FRET pour les CNiFERs D2.Remarquez comment l'amplitude de la réponse augmente avec une intensité croissante de la stimulation électrique. Le couplage de la stimulation avec une injection de cocaïne amplifie la réponse du CNiFER. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer, tester et utiliser les CNiFERs pour l'imagerie in vivo.Au cours du développement des CNiFERs, il est essentiel de maintenir une technique stérile, car ces cellules seront finalement implantées chez des souris vivantes. La mise au point des CNiFERs fournit un outil important pour les recherches en neurosciences, permettant de mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur ou neuromodulateur qui agit via un récepteur couplé à une protéine G. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos expériences.

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