Méthodes de transfert localisé précisément de cellules ou de l'ADN dans des embryons de souris après l'implantation précoce

Nous démontrons une méthode pour greffer des cellules cultivées dans des sites définis d’embryons de souris précoces afin de déterminer leur potentiel in vivo. Nous introduisons également une méthode d’électroporation optimisée qui utilise des capillaires en verre de diamètre connu, permettant l’administration précise d’ADN exogène dans quelques cellules des embryons.

L’objectif global de ces procédures est de démontrer comment transférer avec précision des cellules ou de l’ADN dans des embryons de souris post-implantation. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que l’analyse du potentiel in vivo de cellules cultivées in vitro et des fonctions de certains gènes à des stades embryonnaires spécifiques. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’elles ne nécessitent aucun équipement spécialisé et rendent possibles des manipulations expérimentales de souris de plantation de pose précoce après avoir sacrifié une femelle enceinte le jour E 7.5 ou E 8.5 selon le protocole de texte, utilisez des ciseaux et des pinces pour isoler l’utérus et placez-le dans une boîte de 30 millimètres remplie de M deux milieu avec deux paires de pinces fines.

Déchirez soigneusement le myomètre, puis retirez la décidule, en faisant attention de ne pas percer les cavités embryonnaires supplémentaires. Retirez la membrane du riker à l’aide d’une pince pour la pincer et la séparer lentement de l’embryon. Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection stéréoscopique, vérifiez les embryons pour vous assurer que le sac vitellin, l’amnios et le cône placentaire sont intacts. À l’aide d’une pipette, transférez les embryons dans une boîte propre de M deux et placez-les sur un couvercle de boîte de Pétri en plastique de 30 millimètres sur de la glace ou une plate-forme à glace pour refroidir partiellement les embryons.

Préparez le milieu de culture et cultivez les embryons selon le protocole textuel pour greffer des cellules cultivées dans des embryons de souris. Commencez par utiliser une pointe de pipette de 200 microlitres pour gratter physiquement les cellules souches eblast, qui expriment de manière omniprésente la GFP à partir d’une plaque de culture à six puits. Transférez les cellules dans la boîte contenant les embryons.

Fixez un capillaire de greffe tiré à la main au tube de l’aspirateur pour qu’une pipette buccale aspire doucement la pipette buccale pour aspirer un ou plusieurs amas de cellules de plus de 20 cellules dans le capillaire de greffe. Ensuite, soufflez doucement les cellules pour disperser de gros amas. Sélectionnez un amas contenant environ 10 à 20 cellules et aspirez-le dans le capillaire de greffe.

Encore une fois, en gardant la touffe près de l’ouverture du capillaire avec une paire de pinces. Tenez l’embryon sans serrer en place et insérez le capillaire greffeur dans la région d’intérêt. Pour créer une ouverture.

Expulsez doucement la masse hors du capillaire greffé, en laissant la courte chaîne de 10 à 20 cellules logées dans l’embryon. Laissez les embryons dans la même boîte de milieu M deux et utilisez un microscope de dissection de composé de fluorescence et une caméra pour imager les embryons greffés. Limitez le temps d’imagerie au minimum pour éviter d’exposer les embryons à une lumière et à une chaleur excessives.

Immédiatement après l’imagerie à l’aide d’une pâte, transférez les embryons avec un volume minimal de M deux milieux dans un milieu de culture pré-équilibré et cultivez selon les directives du protocole textuel avant de réaliser des expériences d’électroporation, utilisez une micro pipette polaire horizontale pour tirer des pipettes d’injection d’ADN avec une pointe fine et une ouverture de moins de 10 micromètres Pour éviter d’endommager les tissus. Pour l’électroporation capillaire en verre, utilisez une micro-forge pour couper l’ouverture des pipettes d’injection d’ADN à un diamètre interne de 20 ou 30 micromètres avec une pointe propre et sans bords cassés. Fixez chaque électrode de platine à un mince fil isolé et insérez-la dans un porte-aiguille de micro-injection recouvert de ruban isolant.

Pour préparer une électrode capillaire faite à la main, insérez un fil de platine de 0,2 millimètre de diamètre dans un capillaire en verre d’électroporation avec une ouverture fixe de 20 ou 30 micromètres de diamètre. Pour focaliser le courant électrique et livrer l’ADN plasmatique à une petite région d’intérêt dans l’embryon. Pour fabriquer une électrode en forme de L, pliez un fil de platine de 0,2 millimètre de diamètre, en créant une forme en L avec la partie horizontale du L d’environ un millimètre de longueur.

Montez les porte-aiguilles sur des porte-instruments de micromanipulation standard. Connectez l’électrode capillaire à l’anode de l’alimentation. Connectez l’électrode en forme de L à l’anode du multimètre.

Connectez ensuite la cathode du multimètre à la cathode de l’alimentation. Remplissez le capillaire en verre d’électroporation avec du PBS à un à deux millimètres du haut et insérez l’électrode de platine droite dans le capillaire en verre jusqu’à ce qu’elle atteigne le bas du capillaire. Ancrez l’électrode en forme de L sur la surface de la boîte de Pétri de 30 millimètres remplie de PBS.

Utilisez une pompe pico pneumatique pour l’injection d’ADN. Insérez l’aiguille d’injection de l’eblast latéral dans la cavité amniotique de l’embryon et injectez environ cinq microlitres de solution d’ADN dans la cavité ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement pleine. Veillez à ne pas faire éclater l’embryon.

Ensuite, positionnez soigneusement l’embryon entre les électrodes et déplacez l’électrode capillaire à l’endroit précis où l’ADN doit être délivré. À l’aide de 200 volts en six impulsions de 50 millisecondes chacune, l’embryon a été électroporé avec un intervalle d’une seconde entre chaque impulsion. Transférez immédiatement l’embryon dans un milieu de culture pré-équilibré avant de répéter l’électroporation pour l’embryon suivant.

Détectez les cellules vivantes ou mortes électroporées deux heures après l’électroporation. Selon le protocole textuel montré ici, il s’agit d’un embryon avec des cellules souches épiscopiques exprimant ubiquitement l’EGFP, greffé sur E 7.5 et cultivé ex vivo pendant 24 heures. Lorsque 10 à 16 fsc ont été greffés dans des embryons E 7.5, ils se sont incorporés et ont bien proliféré dans l’embryon hôte.

Cependant, la greffe de plus de cellules n’entraîne pas un meilleur chimérisme et entraîne en fait des amas non incorporés, comme démontré ici. Comme le montre cette électroporation de plasmides exprimant la GFP. Des cellules positives à la GFP ont été détectées une à deux heures après l’électroporation.

Lorsque les cellules distales de l’embryon au stade de stries primitives tardives ont été électroporées, les cellules marquées ont contribué au derme neural après 24 heures de culture, ce qui correspond aux cartes connues du destin des cellules d’eblast dans les embryons au stade gastro. Cette figure montre que, à l’instar de l’utilisation d’autres types d’électrodes pour l’électroporation, l’électrode capillaire provoquait également un certain degré de mort cellulaire dans la région ciblée. Comme cette région apparaissait de couleur plus foncée par rapport aux régions voisines, l’étiquetage des noyaux des cellules mortes avec une membrane imperméable à la puce de fluorescence rouge lointain

Confirmation que la technique d’électroporation capillaire n’aboutit qu’à un petit nombre de cellules mortes à proximité du site d’électroporation. Lors de la tentative de ces procédures, il est important de commencer la culture des embryons dans les deux heures. Après avoir isolé l’utérus des souris à la fin de la culture, les embryons peuvent être fixés.

D’autres méthodes telles que la coloration par section peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la contribution d’un donneur ou de cellules électro-tressées aux embryons hôtes. Après avoir regardé cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la façon de transférer précisément les cellules de notre ADN dans des embryons de souris post-implantation.