Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Kimberley A. Beaumont; Andrea Anfosso; Farzana Ahmed; Wolfgang Weninger; Nikolas K. Haass

doi:10.3791/53486

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulair...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

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10:44 min

December 28, 2015

DOI: 10.3791/53486-v

Kimberley A. Beaumont^1,2, Andrea Anfosso^1,2, Farzana Ahmed³, Wolfgang Weninger*^1,4,5, Nikolas K. Haass*^1,3,5

¹The Centenary Institute, ²Sydney Medical School,University of Sydney, ³The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute,The University of Queensland, ⁴Department of Dermatology,Royal Prince Alfred Hospital, ⁵Discipline of Dermatology,University of Sydney

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents two complementary methods utilizing the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) alongside image analysis and flow cytometry. These techniques are designed to identify and isolate cells based on their cell cycle status within 3D spheroids.

Key Study Components

Area of Science

Cell Biology
Cancer Research
3D Cell Culture

Background

3D spheroids mimic tumor architecture and microenvironment.
Understanding cell cycle status is crucial for cancer research.
Traditional 2D cultures do not accurately represent in vivo conditions.
Flow cytometry and imaging techniques enhance analysis capabilities.

Purpose of Study

To identify and characterize cells in different cell cycle phases.
To isolate specific cell populations from 3D spheroids.
To investigate the impact of the tumor microenvironment on cell behavior.

Methods Used

Fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) for visualization.
Image analysis to assess cell cycle status.
Flow cytometry for cell isolation.
Preparation of 3D spheroids using aros in tissue culture plates.

Main Results

Successful identification of inner G1 arrested and outer proliferating cells.
Real-time visualization of cell cycle dynamics achieved.
Isolation of live cells from specific regions of spheroids demonstrated.
Insights into how the tumor microenvironment affects drug sensitivity and proliferation.

Conclusions

The methods provide a robust approach to studying cancer biology.
Real-time analysis enhances understanding of cell behavior in 3D models.
These techniques can inform therapeutic strategies in cancer treatment.

Frequently Asked Questions

What is the significance of using 3D spheroids?

3D spheroids better mimic the in vivo tumor environment compared to 2D cultures, providing more relevant biological insights.

How does FUCCI work in this study?

FUCCI allows for the visualization of cells in different phases of the cell cycle, enabling precise identification and isolation.

What are the advantages of flow cytometry in this research?

Flow cytometry enables the rapid isolation of specific cell populations based on their fluorescence characteristics.

Can this method be applied to other types of cells?

Yes, the techniques can be adapted for various cell types beyond cancer cells.

What are the implications of this research?

The findings can lead to improved understanding of tumor biology and potential therapeutic interventions.

Nous décrivons deux méthodes complémentaires utilisant l’indicateur de cycle cellulaire d’ubiquitination de fluorescence (FUCCI) et l’analyse d’images ou la cytométrie en flux pour identifier et isoler les cellules dans les régions internes G1 arrêtées et externes proliférantes des sphéroïdes 3D.

L’objectif global de cette méthode est d’identifier, de caractériser et d’isoler des cellules d’un stéroïde multicellulaire en ce qui concerne l’état de leur cycle cellulaire et leur position dans le stéroïde par rapport à la culture cellulaire 2D. Le modèle OID 3D récapitule la biologie du cancer in vivo en imitant l’architecture tumorale et son microenvironnement en associant des spheros à des techniques de cytométrie en flux et d’imagerie. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la façon dont le microenvironnement tumoral modifie la sensibilité aux médicaments, la motilité cellulaire et la prolifération.

Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet de visualiser en temps réel le cycle cellulaire et de purifier les cellules vivantes d’une région spécifique du stéroïde, démontrant ainsi que la procédure sera effectuée. Commencez à vous préparer à la formation de stéroïdes 3D en passant au micro-ondes 1,5 % aros dans 100 millilitres de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS ou pendant trois à cinq minutes, faites tourner le ballon par intermittence pour vous assurer que l’AROS est complètement dissous. Ensuite, pipetez immédiatement 100 microlitres de la solution aros dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure pour permettre à l’aros de se solidifier.

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