Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

L'objectif général de cette méthode est d'identifier, de caractériser et d'isoler des cellules issues d'un stéroïde multicellulaire en fonction de leur statut du cycle cellulaire et de leur position au sein du stéroïde, par rapport à une culture cellulaire en 2D. Le modèle 3D OID reproduit la biologie du cancer in vivo, car il imite l'architecture tumorale et son microenvironnement, en associant des sphéroïdes à la cytométrie en flux et à des techniques d'imagerie. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la manière dont le microenvironnement tumoral modifie la sensibilité aux médicaments, la motilité cellulaire et la prolifération.

L'avantage principal de cette méthode est qu'elle permet une visualisation en temps réel du cycle cellulaire et qu'elle autorise la purification de cellules vivantes à partir d'une région stéroïdienne spécifique, démontrant ainsi que la procédure sera réalisée. A sharp, une assistante de recherche de notre laboratoire, commence à préparer la formation stéroïdienne en 3D en faisant fondre au micro-ondes 1,5 % d'aros dans 100 millilitres de solution saline tamponnée de Hank (HBSS) pendant trois à cinq minutes, en agitant intermittemment le flacon pour s'assurer que l'aros est complètement dissous. Ensuite, pipeter immédiatement 100 microlitres de la solution d'aros dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits à fond plat. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure afin de permettre à l'aros de durcir.

Ensuite, retirez une culture cellulaire de cellules de mélanome exprimant les constructions FCI présentant une confluence de 80 % de l'incubateur de culture cellulaire. Lavez les cellules avec 10 millilitres de HBSS. Ajoutez 1,5 millilitre de 0,05 % dans du EDTA, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ deux minutes.

Une fois que les cellules se sont détachées, resuspendez-les dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire. Comptez manuellement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope inversé, puis diluez-les à 25 000 cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire. Ensuite, pipetez 200 microlitres de la suspension cellulaire pour recouvrir chaque puits de la plaque 96 puits aros.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ trois jours afin de former des sphéroïdes cellulaires. Après l'incubation, observer les sphéroïdes au microscope inversé en utilisant un objectif Forex et un filtre de contraste de phase. Les sphéroïdes doivent apparaître comme des agrégats cellulaires compacts et approximativement sphériques, prêts à être préparés pour la coupe et l'imagerie.

Utilisez une pipette de un millilitre pour les transférer dans un tube Falcon. Ensuite, laissez le stéroïde se déposer au fond du tube conique. Puis, retirez le milieu par aspiration et fixez les sphéroïdes en les incubant dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant au moins deux heures à température ambiante.

Les SP peuvent ensuite être conservés dans du HBSS à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours après la sectionnement et l'imagerie de la cellule. Ouvrez le logiciel d'analyse d'image et sélectionnez la configuration de quantification uniquement. Créez ensuite une nouvelle bibliothèque et importez le fichier d'image confocale du sphéroïde en faisant glisser le fichier de données brutes dans la bibliothèque.

Ensuite, accédez à l'onglet des mesures pour créer un protocole d'analyse d'image en faisant glisser et en déposant les commandes dans l'ordre correct dans la fenêtre de protocole. Pour détecter les objets dans le canal vert, faites glisser et déposez la commande « trouver les objets » provenant de la section de détection dans la fenêtre de protocole, puis sélectionnez le canal approprié. Ajoutez une commande « ouvrir » située sous le traitement, puis ajoutez une commande distincte « objets en contact » afin de séparer les cellules.

Enfin, à partir de la section de filtrage, ajoutez et excluez les objets selon leur taille. Commandez d'exclure les objets inférieurs à 50 micromètres afin d'éliminer les petits objets non cellulaires. Ensuite, faites glisser et déposez une nouvelle commande de recherche d'objets dans la fenêtre du protocole.

En suivant les mêmes étapes, sélectionnez le canal rouge et appliquez toutes les commandes suivantes. Une fois les objets détectés, utilisez les commandes masquer le canal ou afficher le canal pour vérifier visuellement que les objets rouges et verts correspondent respectivement aux noyaux rouges et verts. Si nécessaire, cliquez sur mesures, puis sur options de rétroaction pour modifier l'apparence des masques d'objets.

Maintenant, pour trouver les objets jaunes correspondant aux cellules en début de phase S, utilisez la commande d'intersection située dans la section de combinaison, puis choisissez d'intersecter les objets rouges avec les objets verts. Excluez à nouveau les objets dont la taille est inférieure à 50 micromètres. Pour identifier les cellules en phase G1, utilisez la commande de soustraction située dans la section de combinaison, puis choisissez de soustraire les objets jaunes des objets rouges afin de détecter uniquement les objets rouges.

De la même manière, soustrayez les objets jaunes des objets verts afin d'identifier exclusivement les objets verts qui correspondent aux cellules en phase SG deux et MPH, tant pour les objets exclusivement rouges que pour les objets exclusivement verts. Supprimez les objets non cellulaires au besoin en appliquant une commande de filtrage de population dans la section de filtrage, avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Ensuite, déterminez le contour du sphéroïde S.

Utiliser une commande de recherche d'objets dans la section de recherche, soit dans le canal vert, soit dans le canal rouge. Utiliser une commande de fermeture dans la section de traitement pour regrouper les cellules individuelles en un seul objet. Ensuite, ajouter une commande de remplissage des trous dans les objets afin de combler les trous dans la sphère.

Ensuite, utilisez un filtre fin pour éliminer le bruit provenant de l'objet Sphero. Terminez la délimitation du sphéroïde en choisissant l'option d'exclusion d'objets par taille afin de supprimer les objets inférieurs à 30 000 micromètres. Une fois que tous les objets ont été définis, ajoutez la mesure des distances à partir de la section correspondante pour déterminer la distance entre chaque OID et le bord du contour du sphéroïde S.

Procédez ainsi pour chacune des populations jaune, rouge exclusive et verte exclusive. Pour visualiser les distances minimales entre la cellule et le bord le plus proche du sphéroïde S, ouvrez l'onglet des mesures et sélectionnez les options de rétroaction, puis les relations. Ensuite, choisissez d'afficher les distances.

Enfin, enregistrez le protocole pour sauvegarder les données créées par celui-ci. Sélectionnez l'élément « créer une mesure » dans la section des mesures. Ensuite, pour interpréter les données, sélectionnez l'élément de mesure, accédez à l'onglet d'analyse dans la section des mesures et choisissez « Analyser » dans le menu d'analyse afin de compter les cellules situées à une certaine distance du bord du stéroïde.

Créez un filtre en sélectionnant « filtre » dans l'onglet analyse. Par exemple, affichez uniquement les données où la distance par rapport au bord de la sphère est inférieure à 100 microns. Pour exporter les données brutes, sélectionnez « exporter » dans l'onglet fichier, puis enregistrez les données au format texte séparé par des virgules ou par des tabulations.

Ces données peuvent être ouvertes dans un programme de feuille de calcul pour une analyse supplémentaire. Les sphéroïdes cellulaires ont été générés à partir de C 8 1 16 1. Des cellules de mélanome humain ayant été transduites avec le système Fuji ont été fixées et sectionnées.

Une imagerie confocale pour le vert AZA, qui marque les cellules en phase M du SG deux du cycle cellulaire, et pour l'orange Berra, qui marque les cellules en phase G1, a été réalisée. Lorsque ces images sont superposées, des caractéristiques clés telles qu'un noyau nécrotique peuvent être observées, comme attendu. Les cellules rouges arrêtées en phase G1 prédominent près de ce noyau nécrotique, tandis que les cellules proliférantes rouges et vertes augmentent de manière graduelle vers la périphérie, là où l'accès à l'oxygène et aux nutriments est maximal.

Après une analyse d'image semi-automatisée, les masques des cellules fucci et le contour du sphéroïde S peuvent être définis. Un logiciel d'imagerie a été utilisé pour quantifier les cellules rouges et vertes dans la région interne ou externe du sphéroïde S. Cette analyse a montré que les cellules arrêtées en phase G1 sont enrichies dans la région interne, tandis que les cellules en prolifération prédominent près de la périphérie du sphéroïde.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux semaines, un délai qui inclut la culture du tissu, l'acquisition d'images et l'analyse. Après avoir suivi cette procédure, les tissus peuvent être implantés dans une matrice de collagène, puis observés par microscopie temporelle. Ils peuvent ensuite faire l'objet d'une analyse protéique ou d'ARN, ce qui peut nous aider à répondre à des questions telles que savoir si la position dans le tissu et l'accès à l'oxygène et aux nutriments peuvent modifier les phénotypes des cellules cancéreuses.