Name: Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse du cycle cellulaire et de la position des cellules dans des sphéroïdes de mélanome 3D en utilisant FUCCI, cytométrie et imagerie. Cette méthode permet d'isoler des populations cellulaires spécifiques pour étudier la biologie tumorale.

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Nous remercions Mme Danae Sharp et Mme Sheena Daignault pour leur assistance technique. Nous remercions le Dr Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japon, pour avoir fourni les constructions FUCCI, le Dr Meenhard Herlyn et Mme Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphie, pour avoir fourni des lignées cellulaires, l’installation d’imagerie et de cytométrie en flux du Centenary Institute pour son soutien technique exceptionnel. Nous remercions M. Chris Johnson et le Dr Andrew Barlow pour le support technique du logiciel Volocity. N.K.H. est boursier Cameron de l’Institut de recherche sur le mélanome et le cancer de la peau, en Australie. K.A.B. est membre de l’Institut du cancer de Nouvelle-Galles du Sud (13/ECF/1-39). W.W. est membre de l’Institut du cancer de Nouvelle-Galles du Sud (11/CDF/3-39). Ce travail a été soutenu par les subventions de projet RG 09-08 et RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 et 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales) et APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI transduction et culture cellulaire <ol><li> FUCCI transduction <ol><li> Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) 15 en utilisant la co-transduction lentivirus 7 comme décrit précédemment. Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce. </li><li> Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment 7,16. </li></ol></li><li> Culture de cellules de mélanome <ol><li> C8161 Culture des cellules de mélanome humain tels que décrits précédemment 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formation 3D Spheroid (comme décrit précédemment 3,9) <ol><li> La préparation des plaques d&#39;agarose <ol><li> Dissoudre 1,5% d&#39;agarose (gélose noble ou) dans 100 ml de sel équilibré la solution de Hank (HBSS) ou phosphate Buffèred saline (PBS) par ebullition dans le micro-ondes pendant 3 à 5 min en agitant. Assurez-vous que l&#39;agarose est complètement dissous. </li><li> Répartir immédiatement 100 pi de la solution d&#39;agarose par puits à une plaque de 96 puits de culture de tissu à fond plat avec une pipette multi-canal. Remarque: Agarose peut se solidifier dans les conseils après une courte période de temps, pour surmonter ce problème conseils doivent être changés entre les plaques se faisant plus d&#39;une plaque d&#39;agarose. </li><li> Laissez plaque de 96 puits sur une surface plane à durcir agarose pendant au moins 1 h. </li></ol></li><li> La préparation des cellules et la superposition sur agarose <ol><li> Cultiver les cellules à environ 80% de confluence dans un flacon T75. Laver avec 10 ml de HBSS. </li><li> Détacher les cellules en utilisant 1,5 ml de trypsine à 0,05% d&#39;acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et remettre en suspension dans 10 ml de milieu normal. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 18 ou une autre méthode de comptage automatisé. </li><li> Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 25.000 cellules / ml dans la normemoyen al. </li><li> Superposez puits agarose avec 200 pi de la suspension de cellules pour un nombre final de 5000 cellules par puits. </li><li> Plaques de retour à l&#39;incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2 et 37 ° C) pour former des sphéroïdes plus environ 3 jours. Remarque: Le temps nécessaire pour former un sphéroïde varie entre différentes lignées cellulaires. Certaines lignées cellulaires ne forment pas des sphéroïdes en utilisant cette méthode à tous. </li><li> Image en morphologie sphéroïde avec un microscope inversé en utilisant un objectif de 4X et un filtre à contraste de phase. Une lignée de cellules qui forme avec succès sphéroïdes produiront agrégats cellulaires compacts, plus ou moins sphériques, et il devrait y avoir qu&#39;un seul sphéroïde par puits. Note: Facultatif: Une fois sphéroïdes ont formé, ils peuvent être transplantées dans du collagène ou une autre matrice pour une analyse approfondie de la croissance et de l&#39;invasion 3,7,17. Pour supprimer sphéroïdes à partir de collagène, traiter avec 500 pi de 2 mg / ml de collagénase à 37 ° C jusqu&#39;à ce que le collagène est dissous assez pour le SpherOID à venir librement dans les médias (environ 30 min). Retirez délicatement sphéroïdes utilisant une pipette de 1 ml. </li><li> Pour sectionnement / imagerie sphéroïdes fixes (soit isolés à partir de collagène ou cultivées pendant 3-5 jours sur agarose) à 10% du formol tamponné neutre (ATTENTION: formol doit être utilisé dans une sorbonne) pendant au moins 2 heures à la température ambiante (RT) , ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Sphéroïdes peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome sectionnement <ol><li> Dissoudre 5 g d&#39;agarose à faible point de fusion dans 100 ml de HBSS dans un flacon en verre de 500 ml dans un four micro-ondes. Utilisez un réglage de feu moyen en remuant. ATTENTION: Gardez le couvercle lâche lors de l&#39;ébullition de la solution ainsi que la pression peut être libérée. Utilisez des gants de protection résistant à la chaleur pour protéger les mains contre les brûlures lors de la manipulation de la bouteille de verre chaud. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose refroidit légèrement - de sorte que la bouteille peut être touché sans brûler les mains. </li><li> Verser approximationron 2 ml d&#39;agarose dans le fond d&#39;un compteur Coulter tasse ou un moule plastique analogue. Aspirer immédiatement un sphéroïde fixe (voir section 2.2.8) en utilisant une pipette de 1 ml dans le plus petit volume de liquide possible. Ajouter à la sphéroïde agarose. Quelques sphéroïdes (jusqu&#39;à 10) peuvent être ajoutés par tasse. </li><li> Couvrir les sphéroïdes avec 2 ml plus d&#39;agarose. Pour ce faire rapidement pour éviter le durcissement agarose avant la deuxième couche est ajouté. </li><li> Laisser la gélose à durcir à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant au moins 3 h. A ce point les tasses peuvent être stockés pendant une courte période à 4 ° C avec 2-3 ml de HBSS superposées pour éviter la déshydratation. </li><li> Retirer agarose de la tasse. Coupez le agarose contenant les sphéroïdes afin qu&#39;il tienne sur le bloc de métal vibratome et sphéroïdes sont à proximité du sommet de la gélose. Sphéroïdes peuvent être considérés comme de petits objets blancs à l&#39;intérieur de l&#39;agarose. Super Glue l&#39;agarose au bloc. </li><li> Remplissez le vibratome avec de l&#39;eau distillée et monter le bloc dans la vibratome. Met levibratome pour couper 100 um sections à vitesse lente (réglage 2) et de fortes vibrations (réglage 8). Réglez l&#39;angle de lame de coupe à 16 °. Tournez sur vibratome, allumer la lumière vibratome et couper des sections du haut de l&#39;agarose jusqu&#39;à 100 um sections sphéroïde sont coupés. Placez sections sphéroïde couper en HBSS dans une plaque de 24 puits. </li><li> Choisissez sections intermédiaires pour l&#39;analyse d&#39;image. Sections de montage sur diapositives en transférant la section à plat sur la diapositive à l&#39;aide des pinces. Remplir une seringue de 10 ml baril avec de la graisse à vide; ajoutez une fine ligne de graisse à vide sur les bords de la section afin d&#39;empêcher les médias de montage de courir sur les bords de la diapositive et aider à sceller la section sous la lamelle. Couvrir la section avec un milieu de montage et une lamelle. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Magasin glisse à 4 ° C avant l&#39;imagerie. </li></ol> 4. confocale Image Acquisition <ol><li> Prenez une image z-tranche d&#39;une section de sphéroïde milieu de FUCCI utilisant un 10Xou un objectif 20X comme décrit précédemment 7. Assurez-vous pas de chevauchement ou de la diaphonie se produit entre les Kusabira Orange2 et Azami vert. Si l&#39;on compare l&#39;analyse d&#39;image entre les sections de sphéroïde multiples, maintenir la puissance du laser et d&#39;autres paramètres de la même entre les échantillons. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Essai de débit Tri <ol><li> Transfert sphéroïdes vivants (3-5 jours après l&#39;ensemencement) d&#39;agarose dans un tube de 15 ml. Soit sphéroïdes gravité se déposent au fond du tube. Plusieurs sphéroïdes peuvent être colorées par tube. Environ 20 sphéroïdes sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant pour cytométrie de flux. </li><li> Retirer moyen excès et ajouter 1 ml de 10 um Hoechst diluées dans le milieu normal. Incuber sphéroïdes à 37 ° C pendant environ 1 heure. Utilisez pichenette douce pour remettre en suspension les sphéroïdes une ou deux fois pendant l&#39;incubation. Remarque: Le temps d&#39;incubation peut être modifiée pour modifier la façon dont loin le colorant Hoechst pénètre dans les sphéroïdes. Cela varie en fonction dela taille de l&#39;ellipsoïde, de la densité et de la lignée cellulaire. Pour certains grands sphéroïdes denses / il peut y avoir une pénétration de colorant maximale qui est inférieure à 100%. </li><li> Laver les sphéroïdes doucement avec 5 ml de HBSS utilisant gravité décantation. <ol><li> Facultatif: Pour l&#39;imagerie de la pénétration de colorant: Fix sphéroïdes avec 10% du formol tamponné neutre pendant au moins 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Préparer vibratome sections, monter sur des lames et de l&#39;image sur le confocale comme décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus. </li></ol></li><li> Pour préparer les cellules pour cytométrie de flux, Trypsiniser sphéroïdes avec 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA à 37 ° C pendant environ 30 min avec effleurant toutes les 10 min pour briser les sphéroïdes de l&#39;autre. Remarque: Sphéroïdes sont difficiles à obtenir en suspension de cellule unique, les conditions peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé. Viabilité de C8161 4 jours anciens sphéroïdes après ce processus est d&#39;environ 95%. </li><li> Cellules tache avec une tache de vivre proche infrarouge / morts selon le protocole des fabricants. Laver avec de l&#39;HBSS puis fixer avec 1ml de 10% de formaline tamponnée neutre pendant environ 30 min. Les cellules peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant l&#39;analyse de flux. </li></ol> 6. cytométrie de flux de Hoechst Stained FUCCI Sphéroïdes <ol><li> Assurer cellules ne sont pas agglutinés en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Reprendre le Hoechst tachée sphéroïdes FUCCI dans la glace froide lavage de FACS (PBS avec 5% de sérum de veau foetal) à une concentration de 1-5 x 10 6 cellules / ml. Transférer 200 ul d&#39;échantillon de 5 ml rondes tubes inférieurs. </li><li> Préparer les échantillons uniques de contrôle des couleurs suivantes comme décrit dans 6.1: cellules de mélanome de l&#39;ONU teinté; les cellules de mélanome adhérentes colorées avec 10 uM Hoechst pendant 1 h; Azami Vert exprimant seulement des cellules de mélanome; Kusabira orange et exprimant uniquement des cellules de mélanome. Remarque: simples contrôles de couleur peuvent être fixés dans du formol et entreposés dans FACS laver avec 0,1% d&#39;azoture de sodium à 4 ° C pendant des semaines, voire des mois. </li><li> Suspensions cellulaires seul passage ona cytométrie en flux analyseur avec des lasers appropriés et couleur unique / contrôles non colorées comme décrit précédemment 7,16. </li><li> Utilisez un logiciel de cytométrie commercial comme FlowJo d&#39;analyser l&#39;intérieure vs cellules sphéroïdes extérieures comme suit: <ol><li> Enlever les débris gating sur la principale population de cellules dans l&#39;avenir lumière diffusée (FSC) vs. Side lumière diffusée (SSC). </li><li> Retirer doublets par gating des cellules uniques en utilisant FSC (Région) vs. FSC (Hauteur) </li><li> Porte pour les cellules vivantes par fenêtrage morts la population en direct / faible. </li><li> Définir Hoechst cellules élevés, gated sur la base du signal positif à partir des cellules adhérentes colorés avec Hoechst, que les cellules «extérieur». </li><li> Définir Hoechst cellules faibles ou négatifs, gated basé sur le signal de la commande de non souillé, que les cellules «internes». </li><li> Après déclenchement pour les populations intérieures et extérieures, les cellules peuvent en outre être déclenchés pour FUCCI rouge (G1), jaune (début S), vert (S / G2 / M) ou négative (G1 début). Remarque: CÉMUNÉRATION en utilisant les commandes d&#39;une seule couleur peut être nécessaire de bien définir les populations rouges, jaunes, verts et négatifs FUCCI. </li></ol></li><li> Une fois que le test a été optimisé et la pénétration Hoechst validé par microscopie confocale, les cellules de fonctionner sans fixer sur un trieur de cellules de flux comme décrit précédemment 7,16 pour une analyse approfondie des sous-populations de cellules vivantes. </li></ol> Analyse 7. Image FUCCI sphéroïdes Sections <ol><li> Ouvrir le logiciel, par exemple. Volocity, choisir la configuration SEULEMENT quantification. </li><li> Créer une nouvelle bibliothèque. Importez le FUCCI sphéroïde fichier image confocale dans le logiciel en faisant glisser le fichier de données brutes du confocale dans la bibliothèque. Sinon, utilisez la commande Fichier&gt; Importer. </li><li> Allez à l&#39;onglet des mesures pour construire un protocole d&#39;analyse d&#39;image. Le Protocole est construit en faisant glisser les commandes appropriées dans le bon ordre comme suit dans la fenêtre de protocole. </li><li> Trouver objECTS dans le canal vert: Faites glisser le trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) dans la fenêtre de protocole, sélectionner le canal correct dans les objets de trouvaille protocol.Add une commande d&#39;ouverture (qui se trouve dans le «traitement»), puis un toucher les objets séparés commande (trouvé dans &quot;transformation&quot; - cela va séparer les cellules). Exclure les objets de taille &lt;50 pm (trouvé dans «filtrage» - cela va exclure les petits objets non-cellulaires). Remarque: Les variables telles que le seuil trouver des objets, ouvertes nombre d&#39;itérations, la taille des objets à séparer et la taille des objets à exclure doit être optimisé manuellement jusqu&#39;à ce que les masques d&#39;objet correspondant à l&#39;image. </li><li> Trouvez des objets dans le canal rouge: Répétez trouver des objets comme ci-dessus pour le canal rouge. Peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée séparément protocoles verts et rouges. Remarque: En raison de noyaux étant en G2, noyaux verts sont souvent légèrement plus grande. </li><li> Confirmez objets trouvés sont exacts: Confirmation du rouge et objets verts correspondent à lanoyaux rouges et verts dans l&#39;image en éteignant et sur les canaux vert et rouge (en utilisant le masquer ou afficher la commande de canal) tout en affichant les masques rouges et verts trouvés par le protocole. Options de rétroaction (Mesures&gt; options de retour) peuvent être utilisés pour modifier l&#39;apparence des masques d&#39;objets. </li><li> Trouvez des objets jaunes (cellules en phase S précoce): Pour trouver des cellules jaunes, ajouter une intersection rouge avec cellules vertes commande (dans «La combinaison &#39;). Exclure les objets par taille (&lt;50 um, trouvés dans «filtrage») d&#39;exclure les petits objets non-cellulaires. </li><li> Trouvez des objets exclusivement rouges (cellules en phase G1): Pour trouver noyaux exclusivement rouges, soustraire les cellules jaunes de globules rouges (trouvés dans &#39;La combinaison&#39;). Exclure les objets par taille &lt;50 um, (qui se trouve dans «filtrage») pour enlever tous les petits objets non-cellulaires créées. </li><li> Trouvez des objets exclusivement vertes (cellules en phase S / G2 / M): Répétez l&#39;opération pour le canal vert pour trouver exclusivement verte. Nonte: Si il ya encore des objets non-cellulaires restants, une commande de la population de filtre peut être ajouté à des protocoles rouges ou verts Exclusif (trouvés dans «filtrage») pour ne retenir que les objets avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Cela permettra d&#39;éliminer les objets non-circulaires. </li><li> Trouver le contour sphéroïde: Trouver le contour de l&#39;aide d&#39;un sphéroïde trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) avec le canal vert ou rouge (selon celui qui a plus de cellules sur le bord du sphéroïde). Un seuil beaucoup plus bas (qui se trouve dans le Trouvez des objets de variables) devra être utilisé pour trouver le contour sphéroïde par rapport à des cellules individuelles. <ol><li> Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d&#39;objets. Enfin, exclure des objets de la taille d&#39;enlever des objets plus petits &lt;30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde). Note: Ce protocole devra être optimisée manuellement jusqu&#39;à ce que le contour sphéroïde est exacte. Une image en fond clair peut également être utilisé - mais cela est généralement moins précis avec une section sphéroïde, et une commande Inverser (trouvé dans &#39;La combinaison&#39;) devra être utilisé. </li></ol></li><li> Mesurer les distances de noyaux d&#39;esquisser sphéroïde: Mesurer les distances (trouvés dans «relative») des populations jaunes, exclusivement vertes et exclusivement rouges du centre de gravité de la cellule au bord du sphéroïde outline.To visualiser les distances minimales, qui devrait être de la cellule au bord sphéroïde plus proche, activer l&#39;option Afficher les distances dans l&#39;onglet relations dans les options de rétroaction (Mesures&gt; Options&gt; Rapports de rétroaction). </li><li> Enregistrez le protocole. Ce protocole peut être ré-appliquer à d&#39;autres images en utilisant les mesures&gt; Restaurer commande de protocole. </li><li> Créer un élément de mesure (Mesures&gt; Faire Mesure Point). Les données peuvent être analysées en utilisant l&#39;analysefonctions. <ol><li> Allez à l&#39;onglet d&#39;analyse par le produit des mesures. Allez dans le menu Analyse (Analyse&gt; Analyser) et d&#39;analyser la distance minimale entre le centre de gravité de la cellule (rouge, vert ou jaune) au bord sphéroïde, résumée par le comte et organisée par la population. </li><li> Pour compter le nombre de cellules qui se trouvent à une certaine distance du bord créer un filtre (Analyse&gt; Filtre). Le filtre de distance minimale à la figure 2 est basé sur la pénétration Hoechst (par exemple, la distance minimale est inférieure à 80 donne la population «externe»). Alternativement, l&#39;exportation des données brutes vers un tableur pour une analyse ultérieure. </li></ol></li></ol>

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</ol>

PerkinElmer a contribué aux frais de publication.

Semi-automatisé d&#39;analyse d&#39;image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d&#39;un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d&#39;identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l&#39;expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cellulaire dans les dif...

Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu&#39;ils sont venus dans l&#39;usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D 1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d&#39;imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides 6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde 7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l&#39;ellipsoïde 12. Il a été émis l&#39;hypothèse que l&#39;hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement 13,14. Par conséquent, la capacité d&#39;analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales. Le système d&#39;indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d&#39;ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange - KO) et vert (Azami Vert - AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire 15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l&#39;aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;imagerie ou d&#39;un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose à bas point de fusion</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>Pour le tronçonnage de</td></tr><tr><td>gélose noble.</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>Pour la fabrication de sphéroïdes</td></tr><tr><td>agarose pour sphéroïdes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Pour la fabrication de sphéroïdes</td></tr><tr><td>0,05 % trypsine/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10 % de formol</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>ATTENTION : Nocif, corrosif. Utilisez un équipement de protection individuelle, faites &nbsp ; ne pas respirer les fumées (ouvrir dans une sorbonne).</td></tr><tr><td>vivant/mort près d’IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coupelle coulture</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Moule pour la coupe des sphéroïdes</td></tr><tr><td>hémocytomètre</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>plaque de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>collagénase</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cytomètre en flux</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocité</td><td>PerkinLogiciel</td><td>d’imagerie</td>Elmer <td></td> Logiciel de</tr><tr>cytométrie<td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Logiciel de cytométrie en flux Graisse</td></tr><tr><td>sous vide</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Média de montage</td><td>Vecteur Laboratoires</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (constructions commerciales)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transfection transitoire uniquement</td></tr><tr><td>Crépine de cellule 70 &#956 ; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 5 ml à fond rond (stériles)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 5 ml (non stériles)</td><td>FAL352008</td><td></td> in <td>vitro</td></tr></tbody></table>

analyse fondée cytométrie imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3d mélanome sphéroïdes

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Les sphéroïdes tumoraux tridimensionnels (3D) sont utilisés dans la recherche sur le cancer en tant que modèle plus précis du microenvironnement tumoral in vivo, par rapport à la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) traditionnelle. Le modèle sphéroïde est capable d’imiter les effets de l’interaction cellule-cellule, de l’hypoxie et de la privation de nutriments, et de la pénétration des médicaments. L’une des caractéristiques de ce modèle est le développement d’un noyau nécrotique, entouré d’un anneau de cellules arrêtées G1, avec des cellules proliférantes sur les couches externes du sphéroïde. Ce qui est intéressant dans le domaine du cancer, c’est la façon dont les différentes régions du sphéroïde réagissent aux thérapies médicamenteuses ainsi qu’aux manipulations génétiques ou environnementales. Nous décrivons ici l’utilisation du système d’indicateur du cycle cellulaire d’ubiquitination en fluorescence (FUCCI) ainsi que la cytométrie et l’analyse d’images à l’aide d’un logiciel commercial pour caractériser l’état du cycle cellulaire des cellules par rapport à leur position à l’intérieur des sphéroïdes de mélanome. Ces méthodes peuvent être utilisées pour suivre les changements dans l’état du cycle cellulaire, l’expression des gènes/protéines ou la viabilité cellulaire dans différentes sous-régions des sphéroïdes tumoraux au fil du temps et dans différentes conditions.

Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose 3,7,9. La figure 1 montre un exemple d&#39;un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D&#39;autres lignées cellulaires de méla...

Nous décrivons deux méthodes complémentaires utilisant l’indicateur de cycle cellulaire d’ubiquitination de fluorescence (FUCCI) et l’analyse d’images ou la cytométrie en flux pour identifier et isoler les cellules dans les régions internes G1 arrêtées et externes proliférantes des sphéroïdes 3D.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

L'objectif général de cette méthode est d'identifier, de caractériser et d'isoler des cellules issues d'un stéroïde multicellulaire en fonction de leur statut du cycle cellulaire et de leur position au sein du stéroïde, par rapport à une culture cellulaire en 2D. Le modèle 3D OID reproduit la biologie du cancer in vivo, car il imite l'architecture tumorale et son microenvironnement, en associant des sphéroïdes à la cytométrie en flux et à des techniques d'imagerie. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la manière dont le microenvironnement tumoral modifie la sensibilité aux médicaments, la motilité cellulaire et la prolifération.L'avantage principal de cette méthode est qu'elle permet une visualisation en temps réel du cycle cellulaire et qu'elle autorise la purification de cellules vivantes à partir d'une région stéroïdienne spécifique, démontrant ainsi que la procédure sera réalisée. A sharp, une assistante de recherche de notre laboratoire, commence à préparer la formation stéroïdienne en 3D en faisant fondre au micro-ondes 1,5 % d'aros dans 100 millilitres de solution saline tamponnée de Hank (HBSS) pendant trois à cinq minutes, en agitant intermittemment le flacon pour s'assurer que l'aros est complètement dissous. Ensuite, pipeter immédiatement 100 microlitres de la solution d'aros dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits à fond plat. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure afin de permettre à l'aros de durcir.Ensuite, retirez une culture cellulaire de cellules de mélanome exprimant les constructions FCI présentant une confluence de 80 % de l'incubateur de culture cellulaire. Lavez les cellules avec 10 millilitres de HBSS. Ajoutez 1,5 millilitre de 0,05 % dans du EDTA, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ deux minutes.Une fois que les cellules se sont détachées, resuspendez-les dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire. Comptez manuellement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope inversé, puis diluez-les à 25 000 cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire. Ensuite, pipetez 200 microlitres de la suspension cellulaire pour recouvrir chaque puits de la plaque 96 puits aros.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ trois jours afin de former des sphéroïdes cellulaires. Après l'incubation, observer les sphéroïdes au microscope inversé en utilisant un objectif Forex et un filtre de contraste de phase. Les sphéroïdes doivent apparaître comme des agrégats cellulaires compacts et approximativement sphériques, prêts à être préparés pour la coupe et l'imagerie. Utilisez une pipette de un millilitre pour les transférer dans un tube Falcon. Ensuite, laissez le stéroïde se déposer au fond du tube conique. Puis, retirez le milieu par aspiration et fixez les sphéroïdes en les incubant dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant au moins deux heures à température ambiante.Les SP peuvent ensuite être conservés dans du HBSS à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours après la sectionnement et l'imagerie de la cellule. Ouvrez le logiciel d'analyse d'image et sélectionnez la configuration de quantification uniquement. Créez ensuite une nouvelle bibliothèque et importez le fichier d'image confocale du sphéroïde en faisant glisser le fichier de données brutes dans la bibliothèque.Ensuite, accédez à l'onglet des mesures pour créer un protocole d'analyse d'image en faisant glisser et en déposant les commandes dans l'ordre correct dans la fenêtre de protocole. Pour détecter les objets dans le canal vert, faites glisser et déposez la commande « trouver les objets » provenant de la section de détection dans la fenêtre de protocole, puis sélectionnez le canal approprié. Ajoutez une commande « ouvrir » située sous le traitement, puis ajoutez une commande distincte « objets en contact » afin de séparer les cellules.Enfin, à partir de la section de filtrage, ajoutez et excluez les objets selon leur taille. Commandez d'exclure les objets inférieurs à 50 micromètres afin d'éliminer les petits objets non cellulaires. Ensuite, faites glisser et déposez une nouvelle commande de recherche d'objets dans la fenêtre du protocole.En suivant les mêmes étapes, sélectionnez le canal rouge et appliquez toutes les commandes suivantes. Une fois les objets détectés, utilisez les commandes masquer le canal ou afficher le canal pour vérifier visuellement que les objets rouges et verts correspondent respectivement aux noyaux rouges et verts. Si nécessaire, cliquez sur mesures, puis sur options de rétroaction pour modifier l'apparence des masques d'objets.Maintenant, pour trouver les objets jaunes correspondant aux cellules en début de phase S, utilisez la commande d'intersection située dans la section de combinaison, puis choisissez d'intersecter les objets rouges avec les objets verts. Excluez à nouveau les objets dont la taille est inférieure à 50 micromètres. Pour identifier les cellules en phase G1, utilisez la commande de soustraction située dans la section de combinaison, puis choisissez de soustraire les objets jaunes des objets rouges afin de détecter uniquement les objets rouges.De la même manière, soustrayez les objets jaunes des objets verts afin d'identifier exclusivement les objets verts qui correspondent aux cellules en phase SG deux et MPH, tant pour les objets exclusivement rouges que pour les objets exclusivement verts. Supprimez les objets non cellulaires au besoin en appliquant une commande de filtrage de population dans la section de filtrage, avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Ensuite, déterminez le contour du sphéroïde S.Utiliser une commande de recherche d'objets dans la section de recherche, soit dans le canal vert, soit dans le canal rouge. Utiliser une commande de fermeture dans la section de traitement pour regrouper les cellules individuelles en un seul objet. Ensuite, ajouter une commande de remplissage des trous dans les objets afin de combler les trous dans la sphère.Ensuite, utilisez un filtre fin pour éliminer le bruit provenant de l'objet Sphero. Terminez la délimitation du sphéroïde en choisissant l'option d'exclusion d'objets par taille afin de supprimer les objets inférieurs à 30 000 micromètres. Une fois que tous les objets ont été définis, ajoutez la mesure des distances à partir de la section correspondante pour déterminer la distance entre chaque OID et le bord du contour du sphéroïde S.Procédez ainsi pour chacune des populations jaune, rouge exclusive et verte exclusive. Pour visualiser les distances minimales entre la cellule et le bord le plus proche du sphéroïde S, ouvrez l'onglet des mesures et sélectionnez les options de rétroaction, puis les relations. Ensuite, choisissez d'afficher les distances.Enfin, enregistrez le protocole pour sauvegarder les données créées par celui-ci. Sélectionnez l'élément « créer une mesure » dans la section des mesures. Ensuite, pour interpréter les données, sélectionnez l'élément de mesure, accédez à l'onglet d'analyse dans la section des mesures et choisissez « Analyser » dans le menu d'analyse afin de compter les cellules situées à une certaine distance du bord du stéroïde.Créez un filtre en sélectionnant « filtre » dans l'onglet analyse. Par exemple, affichez uniquement les données où la distance par rapport au bord de la sphère est inférieure à 100 microns. Pour exporter les données brutes, sélectionnez « exporter » dans l'onglet fichier, puis enregistrez les données au format texte séparé par des virgules ou par des tabulations.Ces données peuvent être ouvertes dans un programme de feuille de calcul pour une analyse supplémentaire. Les sphéroïdes cellulaires ont été générés à partir de C 8 1 16 1. Des cellules de mélanome humain ayant été transduites avec le système Fuji ont été fixées et sectionnées.Une imagerie confocale pour le vert AZA, qui marque les cellules en phase M du SG deux du cycle cellulaire, et pour l'orange Berra, qui marque les cellules en phase G1, a été réalisée. Lorsque ces images sont superposées, des caractéristiques clés telles qu'un noyau nécrotique peuvent être observées, comme attendu. Les cellules rouges arrêtées en phase G1 prédominent près de ce noyau nécrotique, tandis que les cellules proliférantes rouges et vertes augmentent de manière graduelle vers la périphérie, là où l'accès à l'oxygène et aux nutriments est maximal.Après une analyse d'image semi-automatisée, les masques des cellules fucci et le contour du sphéroïde S peuvent être définis. Un logiciel d'imagerie a été utilisé pour quantifier les cellules rouges et vertes dans la région interne ou externe du sphéroïde S. Cette analyse a montré que les cellules arrêtées en phase G1 sont enrichies dans la région interne, tandis que les cellules en prolifération prédominent près de la périphérie du sphéroïde.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux semaines, un délai qui inclut la culture du tissu, l'acquisition d'images et l'analyse. Après avoir suivi cette procédure, les tissus peuvent être implantés dans une matrice de collagène, puis observés par microscopie temporelle. Ils peuvent ensuite faire l'objet d'une analyse protéique ou d'ARN, ce qui peut nous aider à répondre à des questions telles que savoir si la position dans le tissu et l'accès à l'oxygène et aux nutriments peuvent modifier les phénotypes des cellules cancéreuses.

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JoVE Journal

Medicine

Médecine

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle 3D organotypique mélanome sphéroïde de peau qui reprend l’architecture et complexité multicellulaire d’un orgue/tumeurs in vivo , mais en même temps peut accueillir systématique expérimentale intervention.

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

Ici, nous présentons plusieurs méthodes simples pour évaluer la viabilité et la mort dans les sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses, qui imitent les gradients physico-chimiques des tumeurs in vivo beaucoup mieux que la culture 2D. Le modèle sphéroïde permet donc d'évaluer l'efficacité du médicament contre le cancer avec une meilleure traduction aux conditions in vivo.

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Un nouveau modèle sphétroïde tridimensionnel basé sur l’interaction hétérorotypic des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal est établi. Ici, nous présentons la coculture des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal, l’imagerie de time-lapse, et la microscopie confocale pour visualiser la formation des sphéroïdes. Ce modèle tridimensionnel offre une plate-forme pertinente pour étudier les interactions tumeur-stroma et tester la thérapeutique du cancer.

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

Les sphéroïdes tumoraux sont de plus en plus utilisés pour évaluer les interactions cellule tumorale-microenvironnement et la réponse thérapeutique. Le présent protocole décrit une méthode robuste mais simple pour l’imagerie à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux 3D en utilisant un nettoyage optique rapide.

Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’interaction des macrophages primaires dérivés de monocytes humains avec un sphéroïde tumoral dans une matrice tridimensionnelle (3D) de collagène I, avec la possibilité de comparer l’impact des propriétés solubles et physiques du microenvironnement sur l’invasion cellulaire.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Découvrez l'analyse du cycle cellulaire et de la position des cellules dans des sphéroïdes de mélanome 3D en utilisant FUCCI, cytométrie et imagerie. Cette méthode permet d'isoler des populations cellulaires spécifiques pour étudier la biologie tumorale.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

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