Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

L’objectif global de cette méthode est d’identifier, de caractériser et d’isoler des cellules d’un stéroïde multicellulaire en ce qui concerne l’état de leur cycle cellulaire et leur position dans le stéroïde par rapport à la culture cellulaire 2D. Le modèle OID 3D récapitule la biologie du cancer in vivo en imitant l’architecture tumorale et son microenvironnement en associant des spheros à des techniques de cytométrie en flux et d’imagerie. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la façon dont le microenvironnement tumoral modifie la sensibilité aux médicaments, la motilité cellulaire et la prolifération.

Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet de visualiser en temps réel le cycle cellulaire et de purifier les cellules vivantes d’une région spécifique du stéroïde, démontrant ainsi que la procédure sera effectuée. Commencez à vous préparer à la formation de stéroïdes 3D en passant au micro-ondes 1,5 % aros dans 100 millilitres de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS ou pendant trois à cinq minutes, faites tourner le ballon par intermittence pour vous assurer que l’AROS est complètement dissous. Ensuite, pipetez immédiatement 100 microlitres de la solution aros dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure pour permettre à l’aros de se solidifier.

Ensuite, retirez de l’incubateur une culture cellulaire de confluence à 80 % de cellules de mélanome exprimant les constructions FCI. Lavez les cellules avec 10 millilitres de HBSS. Ajoutez 1,5 millilitre de 0,05 % d’EDTA, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ deux minutes.

Une fois que les cellules se sont détachées, suspendez-les dans 10 millilitres de culture cellulaire. Douleur moyenne. Comptez manuellement les cellules à l’aide d’un hémomètre, d’un cytomètre et d’un microscope inversé et diluez-les à 25 000 cellules par millilitre dans un milieu de culture cellulaire. Ensuite, pipetez 200 microlitres de la suspension cellulaire pour superposer chaque puits de la plaque aros de 96 puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ trois jours pour former des sphéroïdes cellulaires. Après l’incubation, imagez les sphéroïdes sur un microscope inversé à l’aide d’un objectif Forex et d’un filtre à contraste de phase. Les sphéroïdes doivent apparaître sous forme d’agrégats cellulaires compacts et grossièrement sphériques pour préparer le stéroïde cellulaire pour la section et l’imagerie.

Utilisez une pipette d’un millilitre pour les déplacer vers un tube de faucon. Laissez ensuite le stéroïde se déposer au fond de la conique. Ensuite, retirez la bi-aspiration moyenne, puis fixez les sphéroïdes en les incubant dans de la formine tamponnée neutre à 10 % pendant au moins deux heures à température ambiante.

Le SP peut ensuite être stocké dans HBSS à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours après la coupe et l’imagerie de la cellule. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et choisissez la configuration de quantification uniquement. Créez ensuite une nouvelle bibliothèque et importez le fichier d’image confocale sphéroïde en faisant glisser le fichier de données brutes dans la bibliothèque.

Ensuite, allez dans l’onglet mesures pour créer un protocole d’analyse d’image en glissant et en déposant des commandes dans le bon ordre dans la fenêtre du protocole. Pour rechercher des objets dans le canal vert, faites glisser et déposez la commande rechercher des objets de la section de recherche dans la fenêtre de protocole et sélectionnez le canal approprié. Ajoutez une commande d’ouverture en cours de traitement, puis ajoutez une commande d’objets en contact distincte pour séparer les cellules.

Enfin, depuis la section de filtrage, ajoutez et excluez des objets par taille. Commande pour les objets de moins de 50 micromètres afin d’exclure les petits objets non cellulaires. Ensuite, faites glisser et déposez une nouvelle commande de recherche d’objets dans la fenêtre de protocole.

En suivant les mêmes étapes, sélectionnez le canal rouge et appliquez toutes les commandes suivantes. Une fois les objets trouvés, utilisez les commandes hide channel ou show channel pour vous assurer visuellement que les objets rouges et verts correspondent aux noyaux rouges et verts. Si nécessaire, cliquez sur les mesures puis sur les options de retour d’information pour modifier l’apparence des masques d’objets.

Maintenant, pour trouver des objets jaunes qui correspondent aux cellules du début de la phase S, utilisez la commande intersect qui se trouve dans la section de combinaison et choisissez intersecter les objets rouges avec les objets verts. Encore une fois, excluez les objets dont la taille est inférieure à 50 micromètres. Pour identifier les cellules G monophasées, utilisez la commande soustraire située dans la section de combinaison et choisissez soustraire l’objet jaune des objets rouges pour rechercher exclusivement des objets rouges.

De même, soustrayez les objets jaunes des objets verts afin d’identifier exclusivement les objets verts qui correspondent aux cellules de phase SG deux et MPH pour les objets exclusivement rouges et exclusivement verts. Supprimez les objets non cellulaires si nécessaire en appliquant une commande de filtrage à partir de la section de filtrage avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Trouvez ensuite le contour du sphéroïde S.

Utilisation d’une commande de recherche d’objets à partir de la section de recherche dans le canal vert ou rouge. Utilisez une commande fermée de la section de traitement pour joindre les cellules individuelles en un seul objet. Ajoutez ensuite une commande de remplissage des trous dans les objets pour remplir les trous dans le sphe.

Ensuite, utilisez un filtre fin pour supprimer le bruit de l’objet Sphero. Terminez la recherche du contour du sphéroïde en choisissant Exclure les objets par taille pour supprimer les objets inférieurs à 30 000 micromètres. Une fois que tous les objets ont été définis, ajoutez les distances de mesure de la section correspondante pour déterminer la distance entre chaque OID et le bord du contour du sphéroïde S.

Faites-le dans chacune des populations jaunes, exclusivement rouges et exclusivement vertes. Pour visualiser les distances minimales entre la cellule et le bord du sphéroïde S le plus proche, ouvrez l’onglet mesures et sélectionnez les options de retour suivies des relations. Choisissez ensuite afficher les distances.

Enfin, enregistrez le protocole pour sauvegarder les données créées par le protocole. Choisissez l’élément de mesure make dans la section mesure. Ensuite, pour interpréter les données, sélectionnez l’élément de mesure, allez dans l’onglet analyse dans la section de mesure et choisissez Analyser dans le menu d’analyse pour compter les cellules trouvées à une certaine distance du bord du stéroïde.

Créez un filtre en sélectionnant filtre dans l’onglet analyse. Par exemple, n’affichez que les données dont la distance par rapport au bord de la sphère est inférieure à 100 microns. Pour exporter les données brutes, sélectionnez exporter dans l’onglet Fichier, puis enregistrez les données en tant que texte séparé par des virgules ou limité par des tabulations.

Ces données peuvent être ouvertes dans un tableur pour une analyse plus approfondie. Sphème de cellules généré à partir de C 8 1 16 1. Les cellules de mélanome humain qui avaient été transduites avec le système Fuji ont été fixées et sectionnées.

Une imagerie confocale pour AZA green, qui marque les cellules dans la phase SG deux M du cycle cellulaire et Berra orange, qui marque les cellules dans la phase G one a été réalisée. Lorsque ces images se superposent, des caractéristiques clés telles qu’un noyau nécrotique peuvent être observées comme prévu. Les cellules rouges G une prédominent plus près de ce noyau nécrotique tandis que les cellules proliférantes rouges et vertes augmentent de manière graduelle vers le bord extérieur du stéroïde ou l’accès à l’oxygène et aux nutriments est le plus important.

Après une analyse d’image semi-automatisée, les masques cellulaires de fucci et le contour du sphéroïde S peuvent être définis. Un logiciel d’imagerie a été utilisé pour quantifier les cellules rouges et vertes dans la région interne ou externe du sphéroïde S. Cette analyse a montré que les cellules G arrêtées en une phase sont enrichies dans la région interne tandis que les cellules proliférantes prédominent plus près du stéroïde Edge.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux semaines, un délai qui comprend la culture du stéroïde, l’imagerie et l’analyse. À la suite de cette procédure, les rads peuvent être implantés dans la matrice de collagène, puis imagés via une microscopie TimeLapse. Ils peuvent ensuite être soumis à une analyse de protéines ou d’ARN, ce qui peut nous aider à répondre à des questions telles que la position dans le stéroïde et l’accès à l’oxygène et aux nutriments peuvent modifier les phénotypes des cellules cancéreuses.