Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

L’objectif global de cette invention chirurgicale est de produire des micro-greffes de peau autologues prêtes à être utilisées immédiatement dans la même chirurgie à des fins de cicatrisation des plaies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative et de l’ingénierie des tissus cutanés sur des sujets tels que la cicatrisation chronique des plaies, les brûlures et les ulcères post-traumatiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très facile à utiliser par un médecin sans technique expectisile, et qu’elle est aussi rapide et abordable.

Pour commencer, utilisez un poinçon de biopsie pour prélever des échantillons de peau d’un patient. Retirez et jetez ensuite la couche épithéliale. Combinez chaque échantillon de tissu avec 1 millilitre de solution saline pour générer des micro-greffes autologues.

Pour préparer les biocomplexes à l’application clinique, transférez 1 millilitre de la solution de micro-greffon sur des éponges de collagène. Appliquez immédiatement le biocomplexe sur la zone blessée du patient. Pour in vitro, tester la viabilité du biocomplexe.

Après trois jours de culture, versez 0,3 % de formol directement sur les biocomplexes et fixez pendant 10 minutes à température ambiante. À l’aide d’un microtome, coupez des sections de 5 micromètres d’épaisseur et montez-les directement sur une lame de verre. Placez ensuite des sections dans 15 à 20 millilitres de xylène pendant trois minutes.

Ensuite, plongez les tranches dans des grades décroissants d’éthanol pendant une heure chacune avant de les placer dans de l’eau déminéralisée pour déparaffiniser et réhydrater les sections. Utilisez ensuite 1 à 2 millilitres de 1 gramme par litre d’hématoxyline pendant une à deux minutes pour colorer les sections. Et transférez dans l’eau pour rincer la tache.

Maintenant, avec 1 à 2 millilitres de 1 % d’éosine Y et 70 % d’éthanol et diluez-le dans de l’eau, colorez les sections pendant quatre à cinq minutes. Utilisez ensuite l’eau courante du robinet pour rincer les lames. Immergez les sections dans des concentrations croissantes d’éthanol pendant une heure chacune avant une incubation d’une heure dans du xylène.

Enfin, appliquez un support d’enrobage basé sur les échantillons avant d’ajouter une lamelle. Observez ensuite au microscope optique à un grossissement de 100x. À l’aide d’un dermatome, prélevez des échantillons de papillaire, de derme mort ou de derme de 0,6 millimètre, 1 millimètre ou 0,2 millimètre d’épaisseur, respectivement, dans les zones du tronc de quatre donneurs de tissus multiples âgés de 40 à 55 ans, conformément aux règles nationales de prélèvement.

Mettez les échantillons dans 0,9 % de NaCl et placez-les sur un agitateur orbital pendant cinq minutes pour rincer doucement le tissu. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 5 millimètres, créez des échantillons de diamètre uniforme à partir des tissus cutanés, morts et dermiques, et pesez tous les échantillons de tissus. Ensuite, insérez huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissu cutané, mort ou dermique, respectivement, dans le perturbateur tissulaire, et ajoutez 1,5 millilitre de solution saline pour la désagrégation.

Procéder à la désagrégation de tous les échantillons de tissus comme indiqué dans ce tableau. Utilisez un nombre correspondant de biopsies à l’emporte-pièce dérivées d’échantillons de tissus intacts comme témoins. Après désagrégation mécanique, aspirez la solution saline contenant les micro-greffons et placez chaque échantillon séparément dans un seul puits d’une plaque à 12 puits.

Ajoutez 1 millilitre de milieu RPMI-1640 complété par 10 % de FBS et des antibiotiques à chaque échantillon. Pour évaluer la viabilité cellulaire, ajoutez dans chaque puits 1 millilitre de milieu contenant 0,5 milligramme par millilitre de solution MTT, et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après l’incubation, retirer le milieu MTT et le remplacer par 1 millilitre de DMSO.

Après une incubation de 10 minutes, transférez chaque échantillon de DMSO dans une cuvette et utilisez un spectrophotomètre pour lire la densité optique à 570 nanomètres. Calculez la viabilité cellulaire comme le rapport entre l’absorbance à 570 nanomètres et le poids et les grammes de tissu utilisés avant la désagrégation. Ensuite, une fois que la solution saline a été aspirée à partir des échantillons de tissu cutané, de tissus morts et de derme d’un seul donneur, placez chaque échantillon séparément dans un puits d’une plaque à 12 puits pour un test de viabilité cellulaire ou d’un flacon de culture pour l’analyse morphologique.

Ajoutez 1 millilitre de RPMI-1640 avec 10 % de FBS et des antibiotiques dans la plaque à 12 puits ou 5 millilitres dans le flacon de culture et cultivez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures ou sept jours, respectivement. À 24 heures, utilisez la microscopie optique pour effectuer une analyse morphologique en évaluant la présence de suspension cellulaire. Répétez l’opération le septième jour.

Avec l’analyse FACS, analysez les échantillons de derme à partir de marqueurs cellulaires mésenchymateux et hématopoïétiques, tels que CD146, CD34 et CD45. Ajoutez du milieu dans les cellules désagrégées, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Et évaluer la stérilité du tissu en effectuant une analyse microbiologique comme décrit précédemment.

Comme montré ici, des micro-greffes autologues humaines immédiatement chargées sur un support de collagène ont été implantées dans une lésion de la jambe. Et une réépithélialisation complète associée à la réparation tissulaire a été observée après 30 jours. De plus, le suivi clinique a montré une bonne texture et une bonne douceur de la zone endommagée après cinq mois.

Comme l’indique ce tableau, les seuils de huit, quatre et trois biopsies pouvant être traités en une seule étape ont été établis, et les tissus ont été désagrégés à quatre moments différents afin d’identifier les conditions optimales de désagrégation pour maintenir une bonne viabilité cellulaire. La désagrégation mécanique démontrée dans cette vidéo maintient une valeur moyenne de 30 % de viabilité cellulaire dans tous les échantillons de peau, mortes et dermiques, lorsqu’ils sont évalués à différents moments par rapport aux tissus intacts. Cette greffe montre qu’après 24 heures, soit sept jours de culture, aucune variation substantielle de la viabilité cellulaire dans les échantillons de tissus cutanés n’a été observée au moment de l’homogénéisation en culture par rapport au moment de départ.

Cependant, une viabilité réduite des échantillons morts après 24 heures de culture par rapport à l’heure de début a été observée. Mais la viabilité cellulaire a été restaurée après sept jours de culture. Des résultats similaires ont été observés pour le derme.

Lorsqu’elle est maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq minutes si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’enlever la couche épithéliale de la peau. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la désagrégation du tissu osseux peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions telles que le mécanisme de guérison osseuse.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire pour explorer la cicatrisation tissulaire chez les patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer cette procédure de micro-greffe. N’oubliez pas que travailler avec le tissu peut être extrêmement dangereux.

Et les précautions telles que les lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.