Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

Le but général de cette invention chirurgicale est de produire des microgreffons cutanés autologues prêts à être utilisés immédiatement lors de la même intervention chirurgicale à des fins de cicatrisation des plaies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative et du génie tissulaire cutané, notamment concernant la cicatrisation des plaies chroniques, des brûlures et des ulcères post-traumatiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est très facile à utiliser par un médecin sans technique spécialisée, et qu'elle est rapide et abordable.

Pour commencer, utilisez un punch biopsique pour prélever des échantillons de peau sur un patient. Ensuite, retirez et jetez la couche épithéliale. Combinez chaque échantillon de tissu avec 1 millilitre de solution saline afin de générer des microgreffons autologues.

Pour préparer les biocomplexes à des fins cliniques, transférez 1 millilitre de la solution de microgreffe sur des éponges de collagène. Appliquez immédiatement le biocomplexe sur la zone lésée du patient. Pour tester in vitro la viabilité du biocomplexe.

Après trois jours de culture, versez du formol à 0,3 % directement sur les biocomplexes et fixez pendant 10 minutes à température ambiante. Utilisez un microtome pour découper des sections de 5 micromètres d'épaisseur et montez-les directement sur une lame de verre. Ensuite, placez les sections dans 15 à 20 millilitres de xylène pendant trois minutes.

Ensuite, immergez les tranches dans des concentrations décroissantes d'éthanol pendant une heure chacune, avant de les placer dans de l'eau déionisée pour déparaffiniser et réhydrater les coupes. Utilisez ensuite 1 à 2 millilitres d'hématoxyline à 1 gramme par litre pendant une à deux minutes pour colorer les coupes. Puis transférez-les dans l'eau pour rincer l'excès de colorant.

Maintenant, avec 1 à 2 millilitres d’éosine Y à 1 % et d’éthanol à 70 % dilués dans l’eau, colorer les coupes pendant quatre à cinq minutes. Ensuite, rincer les lames à l’eau courante du robinet. Plonger les coupes dans des concentrations croissantes d’éthanol pendant une heure chacune, avant une incubation d’une heure dans le xylène.

Enfin, appliquer un milieu de montage à base aqueuse sur les échantillons avant d'ajouter une lamelle. Observer ensuite au microscope optique avec un grossissement de 100x. À l’aide d’un dermatome, prélever des échantillons de 0,6 millimètre, 1 millimètre ou 0,2 millimètre d’épaisseur provenant respectivement du derme papillaire, du tissu nécrosé ou du derme, sur les régions du tronc de quatre donneurs multi-tissulaires âgés de 40 à 55 ans, conformément aux règles nationales de prélèvement.

Mettre les échantillons dans du NaCl à 0,9 % et les placer sur un agitateur orbital pendant cinq minutes pour rincer doucement le tissu. À l’aide d’un punch à biopsie de 5 millimètres, prélever des échantillons de diamètre uniforme à partir du tissu cutané, de l’épiderme et du derme, puis peser tous les spécimens tissulaires. Ensuite, insérer huit, trois ou quatre échantillons uniformes de tissu cutané, d’épiderme ou de derme, respectivement, dans le disrupteur tissulaire, et ajouter 1,5 millilitre de solution saline pour la dissociation.

Réalisez la dissociation pour tous les échantillons de tissus comme indiqué dans ce tableau. Utilisez un nombre correspondant de biopsies par emporte-pièce provenant d'échantillons de tissus intacts comme témoins. Après la dissociation mécanique, aspirez la solution saline contenant les microgreffons et placez chaque échantillon séparément dans un puits unique d'une plaque de 12 puits.

Ajouter 1 millilitre de milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de FBS et des antibiotiques à chaque échantillon. Pour évaluer la viabilité cellulaire, ajouter à chaque puits 1 millilitre de milieu contenant 0,5 milligramme par millilitre de solution de MTT, puis incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après l'incubation, retirer le milieu MTT et le remplacer par 1 millilitre de DMSO.

Après une incubation de 10 minutes, transférez chaque échantillon dans du DMSO dans une cuvette et utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 570 nanomètres. Calculez la viabilité cellulaire comme le rapport entre l'absorbance à 570 nanomètres et le poids en grammes du tissu utilisé avant la dissociation. Ensuite, une fois que la solution saline a été aspirée à partir du tissu cutané, placez séparément les échantillons de tissu mort et de derme provenant d'un même donneur dans un puits d'une plaque de 12 puits pour un test de viabilité cellulaire ou dans un flacon de culture pour une analyse morphologique.

Ajouter 1 millilitre de RPMI-1640 contenant 10 % de FCS et des antibiotiques dans la plaque 12 puits ou 5 millilitres dans le flacon de culture, puis cultiver à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures ou sept jours, respectivement. Au bout de 24 heures, effectuer une analyse morphologique par microscopie optique en évaluant la présence de suspension cellulaire. Répéter le septième jour.

Par analyse FACS, analyser les échantillons de derme pour les marqueurs des cellules mésenchymateuses et hématopoïétiques, tels que CD146, CD34 et CD45. Ajouter du milieu aux cellules dissociées, puis incuber à 37 °C pendant trois jours. Évaluer la stérilité du tissu en effectuant une analyse microbiologique comme décrit précédemment.

Comme illustré ici, des microgreffons autologues humains immédiatement chargés sur un support en collagène ont été implantés dans une lésion de la jambe. Une réépithélialisation complète associée à une réparation tissulaire a été observée après 30 jours. De plus, le suivi clinique a montré une bonne texture et une bonne souplesse de la zone lésée après cinq mois.

Comme indiqué dans ce tableau, les seuils de huit, quatre et trois biopsies pouvant être traitées en une seule étape ont été établis, et les tissus ont été dissociés à quatre moments différents afin d'identifier les conditions optimales de dissociation permettant de préserver une bonne viabilité cellulaire. La dissociation mécanique présentée dans cette vidéo maintient une valeur moyenne de 30 % de viabilité cellulaire dans tous les échantillons de peau, épiderme et derme confondus, lorsqu'elle est évaluée à différents moments par rapport au tissu intact. Ce greffon montre qu'après 24 heures ou sept jours en culture, aucune variation significative de la viabilité cellulaire dans les échantillons de tissu cutané n'a été observée au moment de l'homogénéisation en culture par rapport au temps initial.

Cependant, une viabilité réduite des échantillons morts après 24 heures en culture par rapport au temps initial a été observée. Toutefois, la viabilité cellulaire a été restaurée après sept jours en culture. Des résultats similaires ont été observés pour le derme.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de retirer la couche épithéliale de la peau. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la dissociation du tissu osseux, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme le mécanisme de cicatrisation osseuse.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative et du génie tissulaire pour explorer la cicatrisation des tissus chez les patients. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer cette procédure de micro-greffe. N'oubliez pas que le travail avec les tissus peut être extrêmement dangereux.

Et les précautions, comme le port de lunettes de sécurité, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.