Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

L’édition de gènes dans des cellules souches pluripotentes humaines est un défi. Ce protocole fournit la procédure détaillée pour l’édition du génome dans ces cellules à l’aide d’un cas Cas-90 apparié combiné au vecteur cible. Il est fiable et facile à suivre.

Le principal avantage de ce protocole est qu’il s’agit d’une édition génomique transparente. La sélection en deux étapes permet d’augmenter le nombre de cellules ciblées et a rendu le dépistage par génotypage plus efficace. Maintenir des cellules souches pluripotentes humaines sur des surfaces codées par la laminine recombinante 21 dans le milieu mTeSR1.

Les cellules devraient atteindre 70 à 85 % de confluence, 72 heures après un rapport de division de un à trois. Le jour de la transfection, enduire suffisamment de puits d’une plaque de 24 puits avec 300 microlitres de la solution de laminine 521, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Après l’incubation, retirez délicatement la solution d’enrobage et ajoutez immédiatement 300 microlitres de milieu frais mTeSR1, complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK dans chaque puits.

Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur. Sortez les cellules souches pluripotentes humaines de l’incubateur. Retirez le milieu épuisé et lavez les cellules une fois avec un millilitre de DPBS stérile.

Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de dissociation cellulaire doux dans chaque puits et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant six à huit minutes pour dissocier les cellules. Tapotez doucement la plaque pour vous assurer que les cellules peuvent se détacher facilement. Ensuite, utilisez une pointe P1000 pour soulever les cellules en pipetant de haut en bas.

Ajoutez deux millilitres de milieu mTeSR1 avec inhibiteur de ROCK pour terminer la dissociation. Mélangez bien la suspension et transférez-la dans un tube de 50 millilitres. Centrifugez les cellules à 200 G pendant trois minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu mTeSR1 avec inhibiteur de ROCK. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan. Transférez 800 000 à 1 million de cellules dans un tube de 1,5 millilitre pour chaque réaction de nucléofection et centrifugez-les à 200 G pendant trois minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant. Mélangez trois microgrammes de plasmides d’expression d’ARN à guide unique Cas-9n appariés et cinq microgrammes de plasmide de vecteur cible dans 100 microlitres de solution de nucléofection mixte du kit de nucléofection de cellules souches humaines. Préparez également un mélange de plasmides de contrôle GFP.

Remettez en suspension les cellules avec le mélange d’ADN et transférez-les dans une cuvette d’électroporation, en veillant à éviter les bulles d’air. Électroporez les cellules avec le dispositif de nucléofection en utilisant la condition optimisée pour les cellules souches pluripotentes humaines. Ajouter immédiatement 500 microlitres de milieu mTeSR1 frais et chaud complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK dans les cellules électroporées.

Transférez ensuite le mélange dans deux puits de la plaque à 24 puits préalablement préparée. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius alimenté à 5 % de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules de récupérer. Remplacer le milieu d’entretien cellulaire après 12 à 16 heures, en retirant l’inhibiteur de ROCK si les cellules établissent un contact de cellule à cellule.

Après 24 à 48 heures, vérifiez l’efficacité de la nucléofection en examinant l’expression de la GFP dans les cellules témoins. Commencez à sélectionner des cellules en complétant le milieu mTeSR1 avec un microgramme par millilitre de puromycine, 48 heures après la nucléofection. Après 72 heures, complétez le milieu avec 0,5 microgramme par millilitre de puromycine.

Si la confluence cellulaire est inférieure à 30 %, complétez également le milieu avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Quatre à six jours après le passage de la nucléofection, les cellules résistantes à la puromycine à 10 à 15 plaques de 96 puits à la concentration de 0,8 cellules par puits. Assurez-vous de compléter le milieu avec un inhibiteur de ROCK et de la puromycine.

Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 12 jours pour former des colonies dérivées de cellules uniques. Remplissage du milieu sept jours après l’ensemencement. Marquez les puits contenant une seule colonie et remplacez le milieu par du milieu mTeSR1 frais, contenant 0,5 microgramme par millilitre de puromycine, mais aucun inhibiteur de ROCK.

Faites pousser les cellules pendant deux jours de plus à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changez ensuite de milieu pour les puits contenant des colonies indifférenciées. Grattez doucement les colonies et transférez la suspension cellulaire d’une colonie dans deux nouveaux puits sur des plaques séparées de 96 puits.

L’un pour le génotypage et l’autre pour l’entretien. Une fois que la confluence des cellules de génotypage atteint 50 % ou plus, jetez le milieu épuisé et lavez les cellules une fois avec du DPBS. Lysez les cellules avec le tampon de lyse Bradley et isolez l’ADN génomique de chaque puits.

Après avoir effectué trois PCR de jonction d’amorce et séquencé les produits, conservez les colonies avec le bon génotype et jetez le reste. Développez les colonies correctes sous sélection continue de puromycine et congelez-les le plus tôt possible. Ce protocole a été utilisé pour introduire deux mutations ponctuelles dans l’exon8 du gène alpha du facteur nucléaire quatre de l’hépatocyte.

Une méthode de PCR basée sur trois amorces a été utilisée pour dépister les cellules correctement ciblées, et un séquençage de Sanger a été effectué pour confirmer les résultats de la PCR. Après le retrait de la cassette de sélection, la région modifiée a été séquencée à nouveau pour confirmer l’introduction correcte des mutations ponctuelles souhaitées. Les colonies ayant le bon génotype ont été sélectionnées et les cellules ont été caractérisées avant une analyse plus approfondie.

Les cellules modifiées possèdent la même morphologie que les cellules parentales et expriment des marqueurs représentatifs de cellules souches pluripotentes humaines, notamment les facteurs de transcription Nanog et Oct4, ainsi que des marqueurs de surface cellulaire, SSEA-4 et TRA-160. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier la confluence cellulaire après la sélection de la puromycine au cours des premières 24 heures. Il est essentiel de compléter la médiane avec un inhibiteur de ROCK.

Si la confluence cellulaire est inférieure à 30 %pour maintenir les cellules en activité. Une fois que les lignées de cellules souches pluripotentes modifiées par le génome ont été établies, elles peuvent être utilisées pour étudier la fonction des gènes ou la différenciation dirigée. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier différentes questions, telles que la fonction spécifique des gènes ou la correction génique ciblée des maladies génétiques.