Mécanisme de règlement des numéros adipocytes dans les organismes adultes grâce à la différenciation et l'apoptose homéostasie

Les objectifs généraux de ces expériences sont d’analyser l’homéostasie et la différenciation des adipocytes et d’étudier les mécanismes de l’hypoxie et de l’apoptose des adipocytes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine métabolique telles que l’obésité et le diabète de type II. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit de procédures de base et peu coûteuses, c’est-à-dire l’analyse de la biologie des adipocytes dans votre modèle particulier d’études.

Nicole Hannemann, une étudiante au doctorat de mon laboratoire, fera une démonstration des procédures. Pour quantifier l’hypoxie in vivo, il faut d’abord déterminer le poids corporel de la souris. Injecter ensuite 60 mg par kg de poids corporel d’hyrochlorure de pimonidazole solide par voie intrapéritonéale.

Après 45 minutes, épinglez les membres de l’animal et ouvrez la cavité péritonéale. Prélevez les coussinets adipeux périgonadiques gauche et droit de la cavité et retirez les tissus gonadiques des coussinets. Pesez ensuite le tissu pour déterminer le rapport entre le coussinet adipeux et le poids corporel en grammes.

Pour effectuer une analyse histologique de l’homéostasie des adipocytes, déparaffinisez d’abord les coupes de tissu adipeux avec trois lavages de cinq minutes dans du xylène, suivis de deux réhydratations de deux minutes dans de l’éthanol à 100 % et de deux réhydratations de deux minutes dans de l’éthanol à 96 %. Ensuite, lavez les sections à l’eau distillée pendant cinq minutes et tachez-les avec de l’hématoxyline pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les sections dans l’eau pendant encore cinq minutes, suivies d’une coloration de 30 secondes avec une solution d’éosine.

Lavez les sections comme nous venons de le démontrer. Ensuite, déshydratez les sections dans de l’éthanol à 96 % et à 100 % d’éthanol deux fois chacune pendant deux minutes. Suivi de trois incubations de xylène de cinq minutes.

Montez ensuite les sections avec un agent de montage anhydre. Pour l’analyse immunohistochimique des tissus, déparaffiniser les coupes comme nous venons de le démontrer, suivi d’une digestion de 30 minutes avec une solution de travail de protéinase K à 37 degrés Celsius. À la fin de la digestion, rincez les tissus dans du PBS et bloquez la peroxydase endogène avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % dans du PBS pendant 10 minutes.

Après deux lavages ultérieurs de cinq minutes dans le PBS, bloquez toute liaison d’anticorps non spécifiques avec 10 % de sérum dans le PBS. Ensuite, incubez les tissus et les anticorps d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, rincez les sections avec trois lavages de cinq minutes au PBS.

Ensuite, incubez les tissus avec les anticorps secondaires biotinylés appropriés pendant une heure à température ambiante. Au cours des 30 dernières minutes de la période de marquage secondaire des anticorps, équilibrez 50 microlitres de solution d’avidine avec 50 microlitres de peroxydase H biotinylée par section pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les sections deux fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS et traitez les tissus avec 100 microlitres de complexe avidine biotine ABC à température ambiante.

Après 45 minutes, lavez les sections deux fois dans du PBS et incubez les tissus dans la solution de substrat de peroxydase jusqu’à ce que la coloration atteigne le niveau d’intensité approprié. Maintenant, lavez les sections pendant cinq minutes avec de l’eau distillée et contre-colorez les cellules avec de l’hématoxyline pendant 10 minutes à température ambiante. Après la contre-coloration, lavez à nouveau les mouchoirs à l’eau.

Ensuite, déshydratez les sections et utilisez un agent d’enrobage anhydre pour monter les échantillons avec des lamelles. Les coupes peuvent ensuite être évaluées au microscope à champ clair. Commencez par détacher la peau de la souris mâle adulte du haut de la patte, de la longe et du flanc, en épinglant la peau au fur et à mesure qu’elle est enlevée.

Récoltez ensuite le tissu adipeux sous-cutané postérieur entourant les ganglions lymphatiques inguinaux situés à la base des pattes arrière pour la culture des adipocytes. Pour analyser la différenciation adipogénique, placez la culture de cellules adipeuses différenciées sous une hotte et lavez doucement les cellules avec du PBS. Ensuite, fixez les cellules dans deux ml de formalyn à 10 % pendant 60 minutes.

À la fin de la fixation, lavez les cellules dans de l’eau et traitez la culture avec deux millilitres d’isopropanol à 60 % pendant cinq minutes, suivis de deux millilitres de solution de travail O rouge d’huile. Après cinq minutes, rincez les cellules à l’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire. Et contre-colorer les cellules avec de l’hématoxyline comme cela vient d’être démontré.

Les cellules peuvent ensuite être évaluées à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 100 fois. Les lipides des adipocytes apparaîtront rouges et les noyaux apparaîtront bleus. Ici, des sections du coussinet adipeux de souris diététiques normales et riches en graisses sont montrées.

La quantification de la taille et de l’aire des adipocytes démontre clairement une hypertrophie adipocytaire après six semaines d’un régime riche en graisses, comme en témoigne l’augmentation de la taille des adipocytes chez les animaux traités avec un régime riche en graisses. Chez les souris qui avaient été traitées avec le marqueur hypoxique pimonidazole, l’augmentation de l’état hypoxique du tissu adipeux s’accompagne d’une augmentation des adipocytes HIF1 alpha positifs. De plus, la coloration tunnel des sections adipeuses des compagnons de portée knock-out et de contrôle démontre qu’une augmentation de l’apoptose adipocytaire est corrélée à la présence d’hypoxie et à l’expression du facteur 1 alpha inductible par l’hypoxie.

Comme prévu, l’expression de Hif1a dans les adipocytes augmente après 24 heures d’hypoxie. De plus, la quantification des gènes cibles de Hif par QPCR indique que l’expression accrue de Hif1a dans des conditions hypoxiques entraîne une augmentation de l’expression de l’ARNm d’Inos. Cependant, le silençage de Hif1 ou 2 alpha par l’interférence de l’ARN sauve les adipocytes de l’apoptose dans des conditions hypoxiques, confirmant le rôle régulateur sensoriel de l’hypoxie de Hif alpha dans l’apoptose des adipocytes.

Après ces procédures, tous les tests, tels que la détermination de la résistance au glucose et à l’insuline, peuvent être effectués pour répondre à des questions supplémentaires sur les changements métaboliques et le dysfonctionnement des adipocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse histologique des études d’apoptose et d’hypoxie des adipocytes.