Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

L'objectif de cette procédure est de concevoir une élévation de tissus tridimensionnels identiques intégrés dans un gel de collagène, destinés à être utilisés dans de nombreux contextes expérimentaux, comme la détermination de l'influence des contraintes mécaniques sur la morphogenèse ramifiée. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles en morphogenèse tissulaire, telles que l'identification des mécanismes sous-jacents au comportement collectif des cellules. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la géométrie des tissus conçus est contrôlée et reproductible, permettant une manipulation et une mesure précises des facteurs physiques et biochimiques.

Ainsi, la taille de l'échantillon est suffisamment grande pour que des conclusions puissent être établies avec une forte confiance statistique. Commencez par préparer un moule en silicium photodessiné selon le réseau souhaité à l'aide de techniques standard de photolithographie. Le motif utilisé dans cette vidéo est composé de structures rectangulaires espacées de 200 microns.

Ensuite, mélangez 50 grammes de PDMS en combinant le prépolymère et un agent de réticulation dans un récipient jetable selon un rapport de 10:1. Puis, placez le mélange sous vide pendant 15 à 30 minutes afin d'éliminer les bulles d'air introduites lors du mélange. Placez le moule en silicium avec la face texturée vers le haut dans un bateau de pesée en plastique, et versez la solution de PDMS dégazée sur le dessus du moule.

Ensuite, placer la boîte dans un four et polymériser le PDMS à 60 degrés Celsius pendant 12 heures. Une fois la polymérisation terminée, retirer le PDMS et le moule du récipient en plastique. Séparer délicatement le PDMS de la tranche de silicium.

Ensuite, utilisez un rasoir propre pour enlever tout excès de PDMS autour des motifs imprimés. Découpez maintenant le PDMS structuré en tampons rectangulaires individuels à l’aide d’un rasoir. Conservez ces tampons avec la face des motifs vers le haut dans une boîte de Pétri propre de 100 millimètres de diamètre.

Ensuite, préparez une nouvelle préparation de solution de PDMS dégazée en utilisant le même rapport de 10:1 entre le prépolymère et l'agent de réticulation. Déposez par centrifugation deux à trois grammes de cette solution sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre, puis réticulez le PDMS pendant 12 heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour découper la fine couche de PDMS en rectangles qui serviront de supports pour les matrices.

Deux supports sont nécessaires pour chaque cachet. Une fois que tous les supports ont été découpés, stérilisez les cachets en PDMS et les supports en les immergeant dans de l'éthanol à 70 % et en les séchant à l'aide d'un aspirateur dans une cabine de sécurité biologique. Dans une cabine de sécurité biologique, ajoutez 50 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS sur la partie supérieure de chaque cachet.

Placer les tampons recouverts de gouttelettes à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures afin de garantir l'adsorption de l'albumine sérique bovine (BSA) à la surface du tampon. Ensuite, replacer les tampons dans la cabine de sécurité biologique et aspirer la solution de BSA des tampons en PDMS. Puis, laver les surfaces des tampons deux fois avec 50 microlitres de milieu de culture cellulaire.

Aspirez le milieu après chaque lavage. Préparez une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres de diamètre pour chaque poinçon en PDMS. Dans chaque boîte, placez deux supports en PDMS séparés par une distance légèrement inférieure à la longueur des poinçons en PDMS.

Ensuite, utilisez une paire de pinces pour prendre des lamelles en verre de 15 millimètres de diamètre et stérilisez-les à l’aide d’éthanol à 70 %. Aspirez le liquide excédentaire des lamelles tout en les tenant avec les pinces, puis rangez-les dans une boîte de Pétri séparée. Ensuite, déposez 50 microlitres d’un mélange de collagène à quatre milligrammes par millilitre directement sur chaque tampon pour recouvrir uniformément la surface des tampons en PDMS.

À l’aide de la pince, prendre chacun des tampons en PDMS revêtus de collagène et les retourner délicatement. Poser les tampons retournés, côté collagène vers le bas, sur les supports en PDMS dans les boîtes de culture tissulaire. Incuber ensuite les boîtes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, distribuez 50 microlitres du mélange de collagène restant sur chacun des lamelles circulaires et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À ce stade, récoltez le type cellulaire d'intérêt. Ici, nous utilisons des cellules épithéliales mammaires murines EpH4 que nous avons suspendues à une concentration comprise entre un et dix millions de cellules par millilitre.

Maintenant, retirez les échantillons de collagène gélifié de l’incubateur. À l’aide de la pince, soulevez délicatement les tampons en PDMS verticalement pour les détacher du collagène moulé, puis jetez-les. Il est important de soulever le tampon verticalement afin de ne pas déformer les structures présentes dans le gel de collagène.

Dispensez 30 microlitres de la suspension cellulaire concentrée à la surface de chaque gel de collagène contenant des cavités moulées ayant la géométrie souhaitée. Observez les cellules au microscope en champ clair tout en agitant doucement les boîtes de chaque côté afin de favoriser l'implantation des cellules dans les cavités. Les cavités doivent être remplies dans les cinq minutes.

Pour éliminer les cellules excédentaires situées autour des cavités, incliner délicatement chaque boîte de culture sur le côté et appliquer doucement 400 microlitres de milieu de culture cellulaire sur la surface du gel de collagène. Il est important de laver délicatement en dispensant lentement le milieu de culture sur le gel tout en inclinant la boîte, afin d'éliminer les cellules excédentaires présentes à la surface du gel sans déplacer les cellules situées dans les cavités du gel. Aspirer le liquide et répéter le lavage deux fois supplémentaires.

Examiner les gélules de collagène au microscope entre chaque lavage afin d'observer le moment où les cellules excédentaires ont été éliminées par rinçage. Une fois que les cellules excédentaires ont été retirées autour des cavités remplies de cellules, placer les boîtes de culture tissulaire dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, à l’aide de la pince, retourner délicatement les lamelles de verre recouvertes de collagène et les placer au-dessus des moules en collagène remplis de cellules, de sorte que le collagène de la lamelle forme un capuchon au-dessus des cavités remplies de cellules.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois que les bouchons de collagène se sont fixés aux moules de collagène remplis de cellules, ajouter lentement de deux à 2,5 millilitres de milieu de culture cellulaire sur les lamelles de verre situées au-dessus des gels, puis cultiver les échantillons à 37 degrés Celsius pendant un à trois jours. Ces images proviennent de vues à faible et forte amplification des réseaux moulés dans un gel de collagène de type I, prises avant la mise en culture des cellules.

La forme des puits est déterminée par celle des motifs présents sur le moule en silicium. Ici, les puits rectangulaires ont été remplis de cellules épithéliales mammaires. Dans cet exemple, chaque puits rectangulaire de 200 par 50 microns contient environ 80 à 100 cellules.

24 heures après l'ensemencement des cellules, on observe celles-ci adhérant les unes aux autres au sein des puits pour former un tissu. 24 heures après l'ajout du facteur de croissance HGF dans le milieu de culture, on constate que les tissus subissent une morphogenèse ramifiée. L'une des protéines impliquées dans la migration cellulaire est la kinase des adhérences focales, dont l'augmentation, comme le montre cette image composite, est visible aux extrémités des puits où la ramification se produit généralement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la microscopie des forces de traction, la RT-PCR en temps réel et le transfert western peuvent être effectuées afin de déterminer les forces exercées par les cellules lors de leur migration ainsi que les variations des niveaux d'expression transcriptionnelle et protéique des gènes d'intérêt. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place ce modèle de culture cellulaire en 3D, dans lequel des tissus de géométrie initiale définie sont inclus dans un gel de collagène.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.