Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

L’objectif de cette procédure est de concevoir une élévation de tissus tridimensionnels identiques qui sont intégrés dans un gel de collagène pour une utilisation dans de nombreux contextes expérimentaux, tels que la détermination de l’influence du stress mécanique sur la morphogenèse ramifiée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la morphogenèse tissulaire, telles que la détermination des mécanismes sous-jacents du comportement cellulaire collectif. Le principal avantage de cette technique est que la géométrie des tissus modifiés est contrôlée et reproductible, ce qui permet une manipulation et une mesure précises des facteurs physiques et biochimiques.

Ainsi, la taille de l’échantillon est suffisamment grande pour que des conclusions puissent être tirées avec un niveau de confiance statistique élevé. Commencez par préparer un master en silicium photopatterné avec le réseau souhaité en utilisant des techniques de photolithographie standard. Le motif utilisé dans cette vidéo se compose de structures rectangulaires espacées de 200 microns.

Ensuite, mélangez 50 grammes de PDMS en combinant le prépolymère et un agent de durcissement dans un plat jetable dans un rapport de 10:1. Ensuite, placez le mélange sous vide pendant 15 à 30 minutes pour éliminer les bulles d’air introduites pendant le processus de mélange. Placez le master en silicone, côté texturé vers le haut, dans un bateau de pesée en plastique, et versez la solution PDMS dégazée sur le dessus du moule.

Ensuite, placez le plat dans un four et faites durcir le PDMS à 60 degrés Celsius pendant 12 heures. Une fois durci, retirez le PDMS et le master du récipient en plastique. Séparez soigneusement le PDMS de la plaquette de silicium.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour éliminer tout excès de PDMS autour des caractéristiques imprimées. Maintenant, utilisez une lame de rasoir pour couper le PDMS à motifs en tampons rectangulaires individuels. Rangez ces tampons, côté caractéristique vers le haut, dans une boîte de Pétri propre de 100 millimètres de diamètre.

Ensuite, préparez un nouveau lot de solution PDMS dégazée en utilisant le même rapport 10:1 de prépolymère à l’agent de durcissement. Enduisez deux à trois grammes de cette solution sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre, puis durcissez le PDMS pendant 12 heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une lame de rasoir, coupez la fine couche de PDMS en rectangles à utiliser comme supports pour les tampons.

Deux supports sont nécessaires pour chaque tampon. Une fois tous les supports coupés, stérilisez les tampons et supports PDMS en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % et en les séchant à l’aide d’un aspirateur dans une enceinte de biosécurité. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 50 microlitres de 1 % de BSA en PBS en haut de chaque timbre.

Placez les timbres recouverts de gouttelettes à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour vous assurer que le BSA absorbe à la surface du timbre. Ensuite, retournez les tampons dans l’enceinte de biosécurité et aspirez la solution BSA des tampons PDMS. Ensuite, lavez deux fois les surfaces des tampons avec 50 microlitres de milieu de culture cellulaire.

Aspirez le milieu après chaque lavage. Disposez une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres de diamètre pour chaque tampon PDMS. Dans chaque parabole, déposez deux supports PDMS séparés par une distance légèrement inférieure à la longueur des tampons PDMS.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, prélevez des lamelles en verre de 15 millimètres de diamètre et stérilisez-les avec de l’éthanol à 70 %. Aspirez l’excès de liquide des lamelles tout en les tenant avec la pince à épiler, puis rangez-les dans une boîte de Pétri séparée. Ensuite, distribuez 50 microlitres d’un mélange de collagène de quatre milligrammes par millilitre directement sur chaque tampon pour enduire uniformément la surface des tampons PDMS.

À l’aide de la pince à épiler, ramassez chacun des tampons PDMS enduits de collagène et retournez-les doucement. Abaissez les tampons inversés côté collagène vers le bas sur les supports PDMS dans les boîtes de culture tissulaire. Ensuite, incubez les plats à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, versez 50 microlitres du mélange de collagène restant sur chacune des lamelles circulaires et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À ce stade, récoltez le type de cellule qui vous intéresse. Ici, nous avons des cellules épithéliales de mammaire de souris EpH4 que nous avons suspendues à une concentration comprise entre un et 10 millions de cellules par millilitre.

Maintenant, retirez les échantillons de collagène gélifié de l’incubateur. À l’aide de la pince à épiler, soulevez doucement les tampons PDMS vers le haut pour les détacher du collagène moulé et jetez-les. Il est important de soulever le tampon vers le haut afin de ne pas déformer les caractéristiques du gel de collagène.

Distribuez 30 microlitres de suspension cellulaire concentrée à la surface de chaque gel de collagène contenant des cavités moulées de la géométrie souhaitée. Observez les cellules sous un microscope à fond clair tout en secouant doucement les boîtes d’un côté à l’autre pour favoriser l’installation des cellules dans les cavités. Les cavités doivent être remplies dans les cinq minutes.

Pour éliminer les cellules en excès autour des cavités, inclinez chaque boîte de culture tissulaire sur le côté et distribuez doucement 400 microlitres de milieu de culture cellulaire sur la surface du gel de collagène. Il est important de laver doucement en distribuant lentement le milieu de culture sur le gel tout en inclinant le plat afin que toutes les cellules en excès à la surface du gel soient éliminées et que les cellules dans les cavités du gel ne soient pas déplacées. Aspirez le liquide et répétez le lavage deux fois de plus.

Vérifiez les gels de collagène au microscope entre chaque lavage afin d’observer quand les cellules en excès ont été rincées. Une fois que les cellules en excès ont été éliminées autour des cavités remplies de cellules, placez les boîtes de culture tissulaire dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, à l’aide de la pince à épiler, retournez doucement les lamelles en verre recouvertes de collagène et placez-les sur les moules à collagène remplis de cellules afin que le collagène de la lamelle forme un capuchon sur les cavités remplies de cellules.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois que les capuchons de collagène ont adhéré aux moules de collagène remplis de cellules, versez lentement deux à 2 1/2 millilitres de milieu de culture cellulaire sur les glissades de couvercle en verre sur les gels et cultivez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant un à trois jours. Ces images proviennent de vues à faible et à fort grossissement des réseaux moulés dans un gel de collagène de type I avant l’ensemencement cellulaire.

La forme des puits est déterminée par la forme des caractéristiques du maître en silicium. Ici, les puits rectangulaires ont été remplis de cellules épithéliales mammaires. Dans cet exemple, chaque puits rectangulaire de 200 x 50 microns contient environ 80 à 100 cellules.

24 heures après l’ensemencement cellulaire, on a observé des cellules adhérer les unes aux autres dans les puits pour former un tissu. 24 heures après l’ajout d’un facteur de croissance HGF au milieu de culture, les tissus subissent une morphogenèse ramifiée. L’une des protéines impliquées dans la migration cellulaire est la kinase d’adhésion focale, qui, comme vous pouvez le voir sur cette image composite, augmente aux extrémités des puits où la ramification se produit généralement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux heures si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie à force de traction, la RT-PCR en temps réel et le Western Blot peuvent être effectuées afin de déterminer les forces exercées par les cellules lors de leur migration et les changements dans les niveaux de transcription et de protéines des gènes d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place ce modèle de culture cellulaire 3D dans lequel des tissus de géométrie initiale définie sont intégrés dans un gel de collagène.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.