À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

L’objectif de cette technologie est de fournir des outils histologiques qui intègrent des systèmes de modèles complexes d’une manière à haut débit, indépendante de l’observateur et entièrement numérique, à la fois rentable et significative pour les biologistes musculo-squelettiques. L’estologie, bien qu’elle soit essentielle pour la plupart des chercheurs en biologie, est souvent laborieuse et non quantitative. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de techniques histologiques qui fournissent une analyse efficace, à haut débit et automatisée.

Grâce à notre plateforme de cryohistologie, le chercheur peut associer plusieurs signaux moléculaires à des cellules spécifiques au sein d’un échantillon donné en imageant et en colorant la même lame plusieurs fois à haut débit. Le docteur Xi Jiang et Li Chen, assistants de recherche dans mon laboratoire, qui ont été les pionniers du développement et de l’exécution de ces techniques, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, retirez l’échantillon du formol, disséquez tout excès de tissu et transférez-le à 30 % de saccharose, fabriqué dans 1x PBS.

Incuber les spécimens dans du saccharose pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, remplissez un cryomoule avec un milieu de cryoenrobage et placez les échantillons dans le moule. Ensuite, alignez les échantillons dans le moule de sorte que la plaine de coupe de la région d’intérêt soit parallèle au fond du moule.

Après cela, placez le cryomoule sur un morceau de glace sèche jusqu’à ce qu’une fine couche de milieu de cryoenrobage gèle, verrouillant les épices en place. Ensuite, remplissez le volume restant du cryomoule avec un milieu de cryoenrobage, tout en maintenant le cryomoule sur le granulé de glace carbonique. Ensuite, placez le cryomoule dans un récipient contenant du 2-méthylbutane pré-refroidi par de la glace sèche.

Une fois les échantillons complètement congelés, retirez le cryomoule et secouez l’excès de 2-méthylbutane. Enveloppez le cryomoule dans du cellophane et stockez-le à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius. Dans cette procédure, transférez le bloc d’échantillons du congélateur dans un cryostat réglé à moins 20 à moins 25 degrés Celsius.

Ensuite, retirez le bloc du cryomoule et coupez l’excès de milieu de cryoenrobage avec une lame de rasoir. Ensuite, ajoutez un peu de milieu de cryoenrobage sur le disque de l’échantillon et alignez le bloc de sorte que la surface du disque de l’échantillon soit parallèle à la surface inférieure du bloc. Attendez que le milieu de cryoenrobage gèle.

Ensuite, placez le disque de l’échantillon sur la tête de l’échantillon et ajustez la tête de sorte que la lame coupe parallèlement à la surface du bloc d’échantillon. Ensuite, coupez des morceaux de cryobande pour couvrir la région d’intérêt et pré-refroidissez-les dans le cryostat. Ensuite, réduisez le bloc à un niveau dans la région d’intérêt, en continuant à faire des ajustements si nécessaire.

Une fois que la région d’intérêt a été atteinte et qu’une section peut être faite, brossez tous les copeaux de la surface du bloc. Ensuite, retirez le support non adhérent du cryoruban en saisissant le ruban par les languettes dorées argentées non collantes. Placez ensuite le ruban adhésif sur le bloc avec le côté collant vers le bas.

Appliquez une pression sur le cryoruban à l’aide du rouleau et faites une section à l’aide du moteur automatique ou de la roue de coupe manuelle du cryostat. Ensuite, placez la section côté tissu vers le haut sur une lame de microscope en plastique à l’intérieur du cryostat. Retirez la lame en plastique du cryostat et laissez le milieu de cryoenrobage fondre, de sorte que la section adhère à la surface de la lame.

Répétez le sectionnement pour les coupes en série ou d’autres régions d’intérêt. Une fois terminé, placez les sections dans une boîte à diapositives et stockez-les à quatre, moins 20 ou moins 80 degrés Celsius, selon la durée de stockage requise et les mesures d’intervention en aval. Pour effectuer la méthode adhésive durcissable aux UV, étiquetez d’abord la lame de microscope.

Appliquez une goutte d’adhésif optique activé par les UV sur deux lames de verre et utilisez le bord d’une lame pour étaler une fine couche d’adhésif sur la surface des lames de verre. Ensuite, coupez la languette en or argenté et posez la section collée côté tissu vers le haut, sur la couche adhésive de la première lame. Appliquez la section dans un mouvement de roulement d’un bord à l’autre afin de minimiser la formation de bulles coincées sous le ruban.

Ensuite, retirez la section collée de la première diapositive, puis placez-la sur la couche adhésive de la deuxième diapositive et veillez à éviter de piéger les bulles. Une fois que le nombre approprié de sections pour l’expérience donnée est placé sur chaque lame, essuyez l’excès d’adhésif des zones environnantes. Ensuite, inspectez attentivement les sections pour détecter la présence de bulles ou de fibres sous le ruban.

Placez ensuite les lames de microscope sous la lumière noire UV pendant cinq à dix minutes pour réticuler la couche adhésive. Dans cette étape, préparez la solution de marqueur de référence en dissolvant 50 microlitres de vert et 50 microlitres de microsphères rouges dans 100 microlitres d’eau. Conservez la solution dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.

Trempez ensuite une pointe de pipette dans la solution de microsphères et tamponnez la solution de microsphères sur chaque section, adjacente à la région d’intérêt. Ensuite, séchez les lames à température ambiante et protégez-les de la lumière en les recouvrant de papier d’aluminium pendant 30 minutes, si vous traitez les lames ce jour-là. Sinon, placez les diapositives dans une boîte à diapositives à quatre degrés Celsius.

Après avoir teinté les sections, montez les lamelles de recouvrement sur les lames à l’aide d’un support de montage d’acquiesce. Pour effectuer l’imagerie, chargez les lames dans les plateaux du microscope et insérez-les dans la pile de plateaux du microscope à balayage de lames. Ensuite, cliquez sur la liste des profils dans le logiciel du microscope pour charger un profil pour chaque lame avec le temps d’exposition approprié pour chaque flurophore.

Cliquez ensuite sur le bouton Démarrer l’analyse d’aperçu pour prendre une image d’aperçu de chaque diapositive. Le logiciel appliquera automatiquement un nom de fichier en lisant les codes-barres placés sur les étiquettes des diapositives. Il est également possible d’attribuer manuellement un nom de fichier à chaque diapositive.

Définissez les régions d’intérêt en accédant à l’assistant de détection des tissus, en dessinant chaque région à l’aide de l’outil de dessin, en effectuant les ajustements nécessaires et en les enregistrant pour les séries d’imagerie suivantes. Une fois chaque diapositive configurée, lancez le processus de numérisation en cliquant sur le bouton Démarrer la numérisation. Après chaque série d’imagerie, immergez les lames dans un bocal rempli d’un 1x PBS jusqu’à ce que le couvercle se détache des lames, avant l’étape de coloration suivante.

Une fois toutes les séries d’imagerie terminées, exportez les images de chaque canal individuel sous forme de fichiers TIF ou JPG pour l’assemblage et l’analyse des images. Dans cette figure, une coupe d’un fémur de souris âgée de trois mois a été colorée au bleu de calcéine et imagée pour le minéral accumulé, visible en blanc, et les étiquettes de minéralisation, vues en vert et rouge lors de la première série d’imagerie. Les lames ont ensuite été imagées pour l’activité des pièges, visible en jaune lors de la deuxième série, et l’activité AP, vue en rouge lors de la troisième série d’imagerie.

Enfin, les lames ont été colorées au bleu de toluidine au quatrième tour. Les marqueurs de référence ont été imagés lors de chaque cycle d’imagerie, y compris le cycle chromogène, et ont été alignés à l’aide du logiciel personnalisé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de temps qu’il n’en faut pour détartrer un échantillon typique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des images de haute qualité à haut contenu de tissus minéralisés, qui, nous l’espérons, pourront être utilisées plus largement par la communauté musculo-squelettique.