Name: À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez la cryohistologie à haut débit pour l'analyse automatisée des tissus minéralisés en biologie musculosquelettique. Cette méthode numérique permet l'imagerie multi-signaux sur une même lame de façon efficace et reproductible.

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Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 et T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous avons présenté un protocole de cryohistology détaillé pour co-localiser et quantifier plusieurs mesures biologiques en alignant les images provenant de plusieurs cycles de coloration / imagerie sur une seule section. La méthode décrite à l&#39; aide de la cryotape est particulièrement utile car il conserve la morphologie des tissus difficiles à la section (par exemple, os minéralisé et le cartilage). En outre, le tissu sectionné adhère fermement à la lame de verre, ce qui permet plusieurs cycles de co...

La recherche biologique nécessite souvent phénotypage efficace, qui est souvent associée à une sorte d&#39;analyse histologique 1-3. Ce besoin est encore plus évident avec les projets ambitieux de perturber chaque gène dans le génome de la souris 4. Ces analyses histologiques peuvent varier d&#39;évaluer la morphologie des cellules et / ou des caractéristiques anatomiques de l&#39;expression de la cartographie de gènes ou de protéines spécifiques aux cellules individuelles. En fait, l&#39;un des apports fondamentaux de l&#39;histologie au domaine de la génomique est la possibilité d&#39;associer un signal moléculaire spécifique à une région ou d&#39;une cellule de type spécifique. Les méthodes traditionnelles de l&#39;histologie, en particulier pour les tissus musculo-squelettiques, sont souvent longue et laborieuse, nécessitant parfois des semaines pour fixer, détartrer, section, tache, et l&#39;image de l&#39;échantillon, puis d&#39;analyser les images via l&#39;interprétation humaine. L&#39; analyse des signaux moléculaires multiples, que ce soit par immunohistochimie, hybridizat in situion, ou des colorations spéciales, nécessite de multiples sections et même des échantillons multiples pour effectuer de manière appropriée. En outre, ces réponses multiples ne peuvent pas être co-localisés à la même cellule et parfois ne peuvent pas être co-localisée à une région spécifique dans un échantillon donné. Comme le domaine de la génomique et épigénomique se déplace dans l&#39;ère numérique, le champ histologique doit également suivre pour fournir efficace, à haut débit, et l&#39;analyse automatisée d&#39;une variété de signaux moléculaires dans une coupe histologique unique. En effet, il existe une demande pour une amélioration des techniques histologiques qui peuvent associer des signaux moléculaires multiples à des cellules spécifiques dans un échantillon donné. Récemment, nous avons publié un nouveau haut-débit méthode cryohistological pour évaluer plusieurs mesures d&#39;intervention au sein d&#39; une section donnée de tissu minéralisé 5-14. Le procédé consiste à stabiliser la cryosection avec cryotape congelé, faire adhérer l&#39;article collé de façon rigide sur une lame de microscope, etla réalisation de plusieurs cycles de coloration et de l&#39;imagerie sur chaque section. Ces séries d&#39;images sont ensuite alignées manuellement ou grâce à l&#39; automatisation de l&#39; ordinateur avant l&#39;analyse de l&#39; image (figure 1). Ici, nous présentons des protocoles détaillés de ce processus et de fournir des exemples où ces techniques ont amélioré notre compréhension des différents processus biologiques.

<table><tbody><tr><td>10 % de formol neutre tamponné</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles. Toxique. Peut être remplacé par 4 % de paraformaldéhyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Cryomoules Fisher</td><td>Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Différentes tailles peuvent être utilisées en fonction du tissu</td></tr><tr><td>Cryomatrice</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Peut être remplacé par d’autres cryomatrices. Cependant, les résines à base de PVA/PEG ont mieux fonctionné entre nos mains.</td></tr><tr><td>2-méthyl-butane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Peut être remplacé par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Disque d’échantillon</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Peut être remplacé par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Lames de cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Peut être remplacée par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62800-46</td><td>Peut être remplacé par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Lames de microscope en plastique</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71890-01</td><td>Peut être remplacée par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Peut être remplacée par d’autres marques/modèles.</td></tr><tr><td>Adhésif optique Norland, 61</td><td>Adhésif optique Norland Norland, 61</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumière noire UV</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Microscophes rouges InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Microsphères vertes InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp ;</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Alizarine complexone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp ;</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Déméclocycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp ;</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Substrat de phosphatase acide fluorescent jaune ELF 97</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles. Peut être remplacé par du Hoechst 33342 ou d’autres colorants nucléaires.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (contre-coloration nucléaire Cy5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Acétate de sodium anhydre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>tartrate de sodium dibasique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Nitrite de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td> Plusieurs <td>fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles. Peut également être remplacé par d’autres kits de substrat tels que Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphtol AS-MX&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>N,N diméthylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Bleu toluidine O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>D’autres scanners linéaires ou en mosaïque peuvent également être utilisés.</td></tr><tr><td>Jeu de filtres DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Jeu de filtres</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Jeu de filtres GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP Jeu de filtres</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de filtres jaunes personnalisés (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>coutume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de filtres TRITC</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Jeu de filtres</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Tape Transfer System</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62800-10</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62800-72</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Lames adhésives CryoJane</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>62800-4X</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr></tbody></table>

À haut débit, multi-images cryohistology de minéralisés tissues

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Il existe un besoin croissant de phénotypage et d’histopathologie efficaces d’une variété de tissus. Ce besoin de phénotypage est évident avec les projets ambitieux visant à perturber chaque gène du génome de la souris. La communauté des chercheurs a besoin de moyens rapides et peu coûteux pour phénotyper les tissus par histologie. Les analyses histologiques des tissus squelettiques prennent souvent du temps et, au mieux, sont au mieux semi-quantitatives, nécessitant régulièrement une interprétation subjective des lames par des personnes formées. Ici, nous présentons un paradigme cryohistologique pour un phénotypage efficace et peu coûteux des tissus minéralisés. Tout d’abord, nous présentons une nouvelle méthode de cryosectionnement par bande stabilisée qui préserve la morphologie des tissus minéralisés. Ces sections sont ensuite collées de manière rigide sur des lames de verre et imagées à plusieurs reprises sur plusieurs cycles de coloration. Les images résultantes sont ensuite alignées manuellement ou à l’aide d’un logiciel informatique pour produire des piles composites de plusieurs images superposées. Le protocole permet la co-localisation de nombreux signaux moléculaires vers des cellules spécifiques au sein d’une section donnée. De plus, ces signaux fluorescents peuvent être quantifiés objectivement à l’aide d’un logiciel informatique. Ce protocole permet de surmonter de nombreuses lacunes associées à l’histologie des tissus minéralisés et peut servir de plate-forme pour le phénotypage à haut débit et à haut contenu des tissus musculo-squelettiques à l’avenir.

Un flux de travail général pour le haut-débit, multi-images Cryohistology La figure 1 représente le processus général utilisé pour cette technique. Il comprend plusieurs étapes de fixation à travers plusieurs cycles de l&#39;imagerie et enfin l&#39;image d&#39;alignement / analyse. Le processus peut prendre aussi peu que d&#39;une semaine pour aller de l&#39;échantillon fixati...

Dans ce manuscrit, nous présentons une plateforme de cryohistologie semi-automatisée à haut débit pour produire des images composites alignées de plusieurs mesures de réponse à partir de plusieurs séries d’imagerie fluorescente sur des coupes congelées de tissus minéralisés.

À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

L'objectif de cette technologie est de fournir des outils histologiques capables d'intégrer des systèmes modèles complexes de manière haut débit, indépendante de l'observateur et entièrement numérique, tout en étant rentable et pertinent pour les biologistes musculosquelettiques. L'histologie, bien qu'essentielle pour la plupart des chercheurs en biologie, est souvent laborieuse et non quantitative. Il existe donc un besoin de techniques histologiques offrant une analyse efficace, haut débit et automatisée.Avec notre plateforme de cryohistologie, le chercheur peut associer plusieurs signaux moléculaires à des cellules spécifiques au sein d'un échantillon donné en réalisant plusieurs cycles d'imagerie et de coloration sur la même lame, de manière haut débit. La démonstration de cette procédure sera effectuée par le docteur Xi Jiang et Li Chen, assistants de recherche dans mon laboratoire, qui ont été à l'origine du développement et de la mise en œuvre de ces techniques. Pour commencer cette procédure, retirez l'échantillon du formol, disséquez tout tissu excédentaire, puis transférez-le dans du saccharose à 30 % préparé dans du PBS 1x.Incuber les échantillons dans du saccharose pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, remplir un moule cryogénique avec un milieu d'encapsulation cryogénique et placer les échantillons dans le moule. Puis, aligner les échantillons dans le moule de sorte que le plan de coupe de la région d'intérêt soit parallèle au fond du moule.Ensuite, placez le moule cryogénique sur un morceau de glace sèche jusqu’à ce qu’une fine couche de milieu d’encapsulation cryogénique gèle, fixant ainsi les échantillons en place. Puis, remplissez le volume restant du moule cryogénique avec le milieu d’encapsulation cryogénique, tout en maintenant le moule sur la pastille de glace sèche. Par la suite, placez le moule cryogénique dans un récipient contenant du 2-méthylbutane prérefroidi à l’aide de glace sèche.Une fois les échantillons complètement congelés, retirez le moule cryogénique et secouez l'excès de 2-méthylbutane. Enveloppez le moule cryogénique dans du cellophane et stockez-le à moins 20 degrés Celsius ou à moins 80 degrés Celsius. Dans cette procédure, transférez le bloc d'échantillon du congélateur vers un cryostat réglé entre moins 20 et moins 25 degrés Celsius.Ensuite, retirez le bloc du cryomoule et découpez le milieu de cryo-inclusion excédentaire à l’aide d’une lame de rasoir. Puis, ajoutez un peu de milieu de cryo-inclusion sur le disque d’échantillon, et positionnez le bloc de manière à ce que la surface du disque d’échantillon soit parallèle à la surface inférieure du bloc. Attendez que le milieu de cryo-inclusion gèle.Ensuite, placer le disque d'échantillon sur la tête de l'échantillon et régler la tête de manière à ce que la lame coupe parallèlement à la surface du bloc d'échantillon. Puis, découper des morceaux de cryobande pour recouvrir la région d'intérêt et les prérefroidir dans le cryostat. Ensuite, aplanir le bloc jusqu'à un niveau situé dans la région d'intérêt, en continuant à effectuer des ajustements selon les besoins.Une fois la région d'intérêt atteinte et une section réalisée, retirez les copeaux présents à la surface du bloc. Ensuite, retirez le support non adhésif du cryotube en tenant le ruban par les languettes argentées ou dorées non collantes. Puis, placez le ruban sur le bloc, côté collant vers le bas.Appliquez une pression sur le cryotissu à l'aide du rouleau, puis réalisez une coupe à l'aide du moteur automatique ou de la roulette de coupe manuelle du cryostat. Ensuite, placez la section, côté tissu vers le haut, sur une lame de microscope en plastique à l'intérieur du cryostat. Retirez la lame en plastique du cryostat et laissez fondre le milieu d'inclusion cryogénique afin que la section adhère à la surface de la lame.Répétez la coupe pour les sections sériées ou d'autres régions d'intérêt. Une fois terminé, placez les sections dans une boîte à diapositives et conservez-les à quatre, moins 20 ou moins 80 degrés Celsius, selon la durée de conservation requise et les mesures d'analyse ultérieures. Pour appliquer la méthode de l'adhésif durcissable par UV, étiquetez d'abord la lame de microscope.Appliquez une goutte d'adhésif optique activé par UV sur deux lames de verre, puis utilisez le bord d'une lame pour étaler une fine couche d'adhésif sur la surface des lames. Ensuite, coupez la languette en argent or et placez la section collée, côté tissu vers le haut, sur la couche d'adhésif de la première lame. Appliquez la section en effectuant un mouvement de roulement d'un bord à l'autre afin de minimiser la formation de bulles piégées sous le ruban.Ensuite, retirez la section collée de la première lame, puis placez-la sur la couche adhésive de la deuxième lame, en prenant soin d'éviter l'incorporation de bulles. Une fois que le nombre approprié de sections pour l'expérience donnée est disposé sur chaque lame, essuyez l'excès d'adhésif sur les zones environnantes. Ensuite, examinez attentivement les sections à la recherche de bulles ou de fibres situées sous le ruban adhésif.Ensuite, placer les lames de microscope sous la lumière noire UV pendant cinq à dix minutes afin de réticuler la couche adhésive. Dans cette étape, préparer la solution de marqueur de référence en dissolvant 50 microlitres de microsphères vertes et 50 microlitres de microsphères rouges dans 100 microlitres d'eau. Conserver la solution à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius.Plongez ensuite la pointe d'une pipette dans la solution de microsphères et déposez délicatement la solution sur chaque section, à côté de la région d'intérêt. Ensuite, faites sécher les lames à température ambiante et protégez-les de la lumière en les recouvrant de papier d'aluminium pendant 30 minutes, si vous traitez les lames ce jour-là. Sinon, placez les lames dans une boîte à lames à quatre degrés Celsius.Après la coloration des coupes, montez les lamelles sur les lames à l’aide d’un milieu de montage aqueux. Pour effectuer l’imagerie, insérez les lames dans les plateaux du microscope et placez les plateaux dans le chargeur du microscope de numérisation de lames. Ensuite, cliquez sur la liste des profils dans le logiciel du microscope pour charger un profil pour chaque lame, avec le temps d’exposition approprié pour chaque fluorophore.Cliquez sur le bouton Démarrer la numérisation de prévisualisation pour prendre une image de prévisualisation de chaque lame. Le logiciel attribuera automatiquement un nom de fichier en lisant les codes-barres placés sur les étiquettes des lames. Alternativement, un nom de fichier peut être attribué manuellement à chaque lame.Définissez les régions d’intérêt en accédant à l’assistant de détection des tissus, en dessinant chaque région à l’aide de l’outil de dessin, en effectuant les ajustements nécessaires, puis en les enregistrant pour les prochains cycles d’imagerie. Une fois chaque lame préparée, démarrez le processus de numérisation en cliquant sur le bouton Démarrer la numérisation. Après chaque cycle d’imagerie, plongez les lames dans un bocal Coplin rempli de PBS 1x jusqu’à ce que les lamelles se détachent des lames, avant l’étape suivante de coloration.Une fois toutes les séries d'acquisition terminées, exporter les images de chaque canal individuel sous forme de fichiers TIF ou JPG pour le montage et l'analyse des images. Dans cette figure, une section d'un fémur de souris âgée de trois mois a été marquée avec du calcein blue et imagée afin de visualiser le minéral accumulé, apparaissant en blanc, ainsi que les marques de minéralisation, visibles en vert et en rouge lors du premier tour d'acquisition. Les lames ont ensuite été imagées pour l'activité TRAP, visible en jaune lors du deuxième tour, et pour l'activité de la phosphatase alcaline (AP), visible en rouge lors du troisième tour d'acquisition.Enfin, les lames ont été colorées au bleu de toluidine lors du quatrième cycle. Les marqueurs de référence ont été imagés au cours de chaque cycle d'imagerie, y compris le cycle chromogène, puis alignés à l'aide d'un logiciel personnalisé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de temps qu'il n'en faut pour décalcifier un échantillon typique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des images de haute qualité et à haut contenu de tissus minéralisés, que nous espérons voir utilisées plus largement par la communauté musculosquelettique.

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Une stratégie d’analyse quantitative des données histologiques dans la moelle osseuse est présentée. La microscopie confocale de cellules marquées par fluorescence dans des coupes de tissus permet d’obtenir des images en 2 dimensions, qui sont automatiquement analysées. Les analyses de co-localisation de différents types de cellules sont comparées aux données d’images simulées, ce qui donne des informations quantitatives sur les interactions cellulaires.

Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

Ce travail présente un nouveau protocole de traitement et d'imagerie pour une analyse transversale en tissu tridimensionnelle épaisse qui permet l'exploitation complète des modalités d'imagerie confocal. Ce protocole préserve l'antigénicité et représente un système robuste pour analyser l'histologie de la peau et potentiellement d'autres types de tissus.

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Ce protocole cible les cellules dans le tissu pour l’imagerie à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide d’un microscope électronique à balayage (SEM). Un grand nombre de coupes sériées de matériel biologique enrobées dans la résine est imagé tout d’abord dans un microscope photonique à identifier la cible, puis de façon hiérarchique dans le SEM.

Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Cette méthode décrit l'utilisation du modèle de souris R26R-Confetti (Confetti) pour étudier les tissus minéralisés, couvrant toutes les étapes de la stratégie de reproduction aux acquisitions d'images. Inclus est un protocole général qui peut être appliqué à tous les tissus mous et un protocole modifié qui peut être appliqué aux tissus minéralisés.

Tracing génétique clonale à l'aide de la souris confettis pour étudier les tissus minéralisés

Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.

Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

Ce protocole présente un pipeline complet pour analyser des échantillons obtenus à partir de cœurs humains qui couvrent les échelles microscopique et macroscopique.

Pipeline pour l’étude anatomique tridimensionnelle multi-échelle du cœur humain

La combinaison de l’IBEX (Iterative-Bleaching-Extends-Multiplexity) et d’un test commercial de marquage nucléotidique (Click-iT EdU) permet la détection et la catégorisation de types de cellules en division dans des processus hautement dynamiques dans des coupes de tissus murins congelés fixes. De plus, un nouveau pipeline de traitement d’images open source permet l’acquisition et l’analyse d’images à haut débit.

Flux de travail d’imagerie et d’analyse à haut débit pour l’évaluation des phénotypes et des états de prolifération des cellules cutanées dans des échantillons de tissus

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Ce protocole inclut un flux de travail étape par étape pour les échantillons vasculaires calcifiés : manipulation tissulaire, décalcification, validation de l’ARN, détection des niveaux de calcification et stratégies de sélection des régions d’intérêt sur le Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L’objectif est de présenter une méthode complète pour préserver la morphologie des tissus vasculaires et l’ARN afin d’une analyse transcriptomique spatiale fiable.

Préparation et traitement des artères calcifiées avec morphologie et ARN préservés pour le profilage spatial numérique

Ce protocole standardise la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) pour les tissus épais en intégrant la gelation à haute pression (HPF) avec la méthode gaufreuse, le levage par faisceau d’ions de focalisation cryogénique (cryo-FIB), et l’acquisition parallèle symétrique en dose, produisant des lamelles uniformément fines et des échantillons vitrifiés pour une analyse in situ reproductible dans l’hippocampe de souris.

Flux de travail de la tomographie cryo-électronique pour tissus épais démontré dans l’hippocampe de souris

Découvrez la cryohistologie à haut débit pour l'analyse automatisée des tissus minéralisés en biologie musculosquelettique. Cette méthode numérique permet l'imagerie multi-signaux sur une même lame de façon efficace et reproductible.

À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

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