En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l'Vomeronasal Organ Souris

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une analyse électrophysiologique d’une cellule unique d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes de tissu aiguës de l’organe voméronasal de la souris. Cette méthode peut aider à élucider des questions clés dans le domaine de la chimiosensation, telles que les mécanismes de détection chimique sans voir. Le principal avantage de cette technique est qu’en enregistrant à partir de neurones sensoriels dans des coupes de tissus aigus, ces cellules peuvent être étudiées dans leur environnement d’origine.

Pour commencer cette procédure, après avoir sacrifié l’animal, retirez sa mâchoire inférieure, en insérant une paire de gros ciseaux chirurgicaux à travers la cavité buccale, et coupez les os de la mandibule et les muscles de chaque côté séparément. Ensuite, retirez la peau de la mâchoire supérieure et autour de la pointe du nez avec une pince moyenne, pour mieux accéder aux incisives. Ensuite, utilisez les ciseaux à os pour couper la plus grande partie des incisives à un angle de 45 degrés dans la direction rostrale afin de faciliter le retrait de la capsule VNO de la cavité nasale.

Ne coupez pas la racine de la dent pour éviter d’endommager l’extrémité de la capsule VNO. Après cela, saisissez le palais supérieur rigide par sa partie rostrale avec une pince moyenne et décollez-le soigneusement en un seul morceau à un angle plat. Rincez à plusieurs reprises la cavité navale avec la solution glacée S2. Ensuite, utilisez des micro-ciseaux à ressort pour couper l’épanchement osseux entre la pointe de l’os vomer et la mâchoire.

Insérez les pointes des ciseaux avec la partie incurvée pointant à l’opposé du VNO. Et coupez soigneusement l’os en petites étapes sur les côtés gauche et droit, latéralement à la capsule VNO. Pour retirer la capsule VNO, coupez l’os vomer au niveau de la partie caudale et soulevez délicatement l’os vomer hors de la cavité nasale à l’aide d’une pince moyenne.

Transférez immédiatement le VNO dans une petite boîte de Pétri sous un stéréomicroscope sur un pack de gel réfrigérant, où les étapes restantes de la dissection doivent être effectuées. Ensuite, rincez le VNO dans une petite quantité de S2 glacé, pour éviter que le tissu ne se dessèche. Ensuite, séparez les capsules cartilagineuses qui contiennent les tissus mous VNO en saisissant l’arrière de l’os vomer avec une pince moyenne.

Pour cela, positionnez la capsule pour une vue dorsale de sorte qu’une scission entre les deux VNO devienne visible. À l’aide de la pointe d’une pince fine, séparez les deux capsules de cartilage VNO de l’os central, tout en maintenant l’os vomer fixé à l’arrière. Assurez-vous que la paroi cartilagineuse médiale qui était précédemment attachée à l’os vomer est retirée.

Lors de l’ablation du cartilage autour du VNO, utilisez des pinces uniquement sur le bord de la capsule cartilagineuse. Et faites très attention à ne pas endommager l’épithélium sensoriel délicat. Pour enlever le cartilage restant, tournez le VNO avec son côté latéral incurvé vers le fond de la boîte et fixez solidement le cartilage d’un côté à l’aide d’une pince.

Ensuite, déplacez soigneusement la deuxième pince fine de l’arrière à un angle très plat entre le cartilage et le VNO pour desserrer la connexion entre le tissu et le cartilage. Pour éviter d’endommager l’épithélium sensoriel, retirez lentement le VNO du cartilage en le tenant à son extrémité caudale. Une fois que le VNO est retiré de la capsule, retirez toutes les petites parties de cartilage restantes car les morceaux de cartilage restants détacheront le tissu de l’agarose environnante pendant le processus de tranchage.

Ensuite, placez une petite goutte de S2 glacé sur le premier VNO disséqué pour éviter d’endommager les tissus. Pour intégrer les VNO, remplissez les deux petites boîtes de Pétri jusqu’au bord avec du S3 fondu. Après cela, plongez chaque VNO dans de l’agarose et déplacez-le horizontalement d’avant en arrière plusieurs fois pour retirer le film de solution extracellulaire ainsi que toutes les bulles d’air de sa surface. Positionnez le VNO verticalement, avec la pointe rostrale tournée vers le fond du plat.

Ensuite, placez les deux plats sur un bloc réfrigérant en gel et attendez que l’agarose se soit solidifié. Ne changez pas l’orientation du VNO une fois que l’agarose a commencé à se solidifier, car cela détacherait le tissu de l’agarose environnante. Dans cette procédure, utilisez une petite spatule pour retirer le bloc d’agarose du petit plat dans le couvercle d’une grande boîte de Pétri, et retournez l’agarose à l’envers, en laissant l’extrémité rostrale du VNO vers le haut.

Ensuite, coupez le bloc en forme pyramidale à l’aide d’un scalpel chirurgical et veillez à ne pas endommager le tissu incrusté. Ensuite, utilisez de la super colle pour fixer le bloc en forme de pyramide au centre de la plaque d’échantillon du vibratome. Et attendez environ une minute pour que la colle sèche complètement.

Coupez l’échantillon en sections de 150 à 200 micromètres d’épaisseur. Inspectez brièvement la morphologie de la tranche au microscope à dissection. Transférez ensuite toutes les tranches dans la chambre d’oxygénation jusqu’à utilisation.

Dans cette étape, transférez une tranche VNO dans la chambre d’imagerie et fixez la position de la tranche à l’aide d’un ancrage en acier inoxydable câblé avec des fibres synthétiques d’un point millimétrique d’épaisseur. Ne couvrez pas la tranche de tissu avec l’un des fils de fibres synthétiques. Ensuite, transférez la chambre d’imagerie dans la configuration d’enregistrement et superfusionnez continuellement la tranche avec du S2 oxygéné à température ambiante.

Ajustez le capillaire d’aspiration à la surface de la solution pour créer un échange constant de solution de bain. Ajustez ensuite le crayon de profusion à huit canons en un au-dessus et près de la partie non sensorielle de la tranche VNO qui contient le vaisseau sanguin. Ensuite, connectez l’électrode de référence et la solution de bain à l’aide du pont de gélose en forme de L rempli de chlorure de potassium de 150 millimolaires.

Remplissez ensuite la pipette patch avec la solution de pipette S4. Montez la pipette sur l’électrode enrobée de chlorure d’argent connectée à l’étage de tête sans gratter le revêtement et fixez-la fermement. Appliquez ensuite une légère pression positive sur la pipette patch avant d’entrer dans le bain. Surveillez la pipette et assurez-vous qu’elle se situe entre quatre mégaohms et 10 mégaohms.

Visualisez la coupe VNO avec une caméra CCD à l’aide d’une CID optimisée pour l’infrarouge, et identifiez les cellules exprimant FPR-rs3 i-Venus ou les neurones marqués de manière similaire à l’aide de l’éclairage fluorescent et d’un cube de filtre approprié. Approchez le corps cellulaire à l’aide de volants pour une sensibilité maximale. En raison de la pression positive, une petite bosse sur la membrane cellulaire du soma devient visible une fois que la pointe de la pipette est à proximité.

Relâchez ensuite la pression positive et appliquez une légère pression négative pour aspirer la membrane cellulaire afin d’obtenir une étanchéité à haute résistance de un à 20 gigaohms. Ensuite, appliquez une aspiration courte et douce pour perturber la membrane cellulaire et établir la configuration complète de la cellule. Dans cette figure, une image confocale d’une tranche de tissu coronal VNO montre la distribution des neurones fluorescents FPR-rs3 Tau Venus positifs dans l’épithélium sensoriel voméronasal.

Les neurones positifs FPR-rs3 Tau Venus présentent une seule dendrite apicale se terminant par une structure en forme de bouton au niveau de la bordure luminale. Et voici les enregistrements complets de patch-clamps de cellule effectués à partir du soma VSN. Voici les traces représentatives d’enregistrements de patch-clamps en gros d’un courant sodium à activation rapide sensible au TTX et de VSN positifs FPR-rs3.

Les enregistrements de pas de tension dans des conditions de contrôle révèlent un courant entrant rapide et transitoire dépendant de la tension. Le traitement TTX à une micromolaire diminue fortement le courant. Et la trace soustraite numériquement montrée ici révèle le courant de sodium sensible à la tension TTX.

Les traces représentatives de la pince de courant montrent la dépolarisation et l’hyperpolarisation et les trains de potentiels d’action générés lors de l’injection de courant positif et négatif par étapes. Une fois maîtrisé, l’ensemble du processus de dissection et de tranchage des tissus peut être effectué en environ une heure pour les deux VNO. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’enregistrement de patchs libres extracellulaires ou l’imagerie calcique peuvent être effectuées afin d’augmenter le débit lors de l’analyse de plus grandes populations de neurones.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire des coupes de tissu aiguës de l’organe voméronasal de la bouche et de la façon d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques de cellules uniques à partir de neurones sensoriels voméronasal.