Name: En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de lVomeronasal Organ Souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Découvrez l'analyse physiologique des neurones sensoriels dans l'organe voméronasal de souris en utilisant des enregistrements patch-clamp sur tranches tissulaires aiguës. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de chémosensation in vivo.

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Nous remercions Ivan Rodriguez et Benoit von der Weid d’avoir généré la lignée de souris FPR-rs3-i-venus, leurs critiques constructives et leurs discussions fructueuses. Ce travail a été financé par des subventions de la Fondation Volkswagen (I/83533), de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) et de l’Initiative d’excellence des gouvernements fédéral et des Länder allemands. MS est professeur à Lichtenberg de la Fondation Volkswagen.

Toutes les procédures animales étaient en conformité avec la législation locale et l&#39;Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales (directive 86/609 / CEE) et des recommandations formulées par la Fédération des animaux de laboratoire Associations Européennes de Sciences (FELASA). Les deux souris C57BL / 6 et souris Fpr-RS3-i-Vénus ont été logés dans des groupes des deux sexes à la température ambiante sur un 12 h cycle lumière / obscurité avec de la nourriture et de l&#39; eau ad libitum. Pour les expériences de jeunes adultes (6-20 semaines) des deux sexes ont été utilisés. Aucune différence entre les sexes dépendant évidentes ont été observées. 1. Préparation de la solution <ol><li> Préparer une solution extracellulaire S 1: 4- (2-hydroxy-éthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) solution tampon contenant extracellulaire (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajusté avec NaOH); osmolarité = 300 mOsm (ajusté avec du glucose). </li><li> Préparer extracellulaire solution S2: carbogène désoxygéné (95% O 2, 5% CO 2) contenant une solution extracellulaire (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 BES; pH = 7,3; osmolarité = 300 mOsm (ajusté avec du glucose). </li><li> Préparer une solution d&#39;agarose à 4% de faible gélification (S 3) pour l&#39; incorporation de tissu: 4% à faible température de gélification d&#39; agarose. Dissoudre 2 g de faible gélification agarose dans 50 ml de S 1 dans un 100 ml laboratoire de bouteille en verre avec un agitateur magnétique. Pour faire fondre l&#39;agarose, mettre la bouteille dans un bain d&#39;eau (avec couvercle pas hermétiquement fermé) à 70 ° C pendant environ 20 min ou jusqu&#39;à ce que la solution devient transparente tout en remuant. Refroidir et conserver agarose fondu dans un second bain d&#39;eau à 42 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Préparer une solution intracellulaire S 4: Solution Pipette contenant (en mM) 143 KCl, KOH 2, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (Ca2 + libre = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajusté avec KOH); osmolarité = 290 mOsm. </li><li> Modifier / adapter la composition du S 1, S 2 et S 4 en fonction de la conception expérimentale individuel (par exemple, les inhibiteurs pharmacologiques pour isoler certains types de courants de tension activés). </li></ol> 2. Espace de travail Préparation <ol><li> Remplissez oxygénant chambre de tranche stockage avec S 2 au moins 30 min avant la dissection, le lieu sur la glace pour le réglage de la température et de pH et de la solution oxygéné en permanence. </li><li> Remplir le réservoir de tranche surfusion à la configuration d&#39; enregistrement avec S 2 et oxygéner en continu. </li><li> Avant la dissection, remplir vibratome chambre avec S 2 et arranger la glace pilée autour de la chambre. Vous pouvez également transférer la solution oxygénée de glace froide de secours de la chambre oxygénant dans vibratome chambre et garder oxygénant en continu. </li><li> Disposer des outils chirurgicaux et consommables. </li><li> Placer le sachet de gel de glace sous la dissectionmicroscope, couvrir avec une serviette en papier pour éviter que le tissu VNO du gel au fond du plat. </li><li> Nettoyer la lame de rasoir par un bref rinçage à l&#39;éthanol à 70% et de l&#39;eau distillée et monter à vibratome. Remplacer pour chaque session de tranchage. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> Sacrifiez animaux brève exposition au CO 2 et décapitent en utilisant des ciseaux chirurgicaux tranchants. Remarque: Comme le temps de sacrifier l&#39;animal à mettre la capsule VNO sur la glace est critique, minimiser le temps à moins de 2 min. Pour maintenir la viabilité des tissus, incorporer à la fois complètement disséqué VNO dans de l&#39;agarose en moins de 30 min. </li><li> Retirer la mâchoire inférieure avec de grands ciseaux chirurgicaux. Entrez par la cavité buccale et de couper les os mandibule et les muscles de chaque côté séparément. </li><li> Placez la partie restante de la tête à l&#39;envers dans la grande boîte de Pétri. </li><li> Tirez loin la peau de la mâchoire supérieure et autour de la pointe du nez avec une pince moyenne pour obtenir un meilleur accès à laincisives. </li><li> Utilisez des ciseaux d&#39;os pour couper la plus grande partie des incisives à un angle de 45 ° ~ dans le sens rostral (figure 1A). Cela facilitera le retrait de la capsule VNO de la cavité nasale. Note: Ne pas couper à la racine de la dent pour éviter d&#39;endommager la pointe de la capsule VNO. </li><li> Prenez le palais supérieur rigide à sa partie rostrale avec une pince à moyen et éplucher soigneusement en un seul morceau à un angle plat (figure 1B). Remarque: À plusieurs reprises rincer avec de la glace froide S 2. </li><li> Utilisez micro ciseaux à ressort pour couper la fusion osseuse entre la pointe de l&#39;os vomer et la mâchoire. Insérez les pointes de ciseaux avec la partie courbe de la pointe pointant vers l&#39;extérieur loin de la VNO et soigneusement couper l&#39;os en petites étapes à la fois sur la gauche et à droite de côté latéral de la capsule VNO. </li><li> Pour retirer la capsule VNO, utiliser des micro ciseaux à ressort pour couper à travers l&#39;os vomer à la partie caudale et soulevez délicatement l&#39;os vomer de la ncavité asal en utilisant une pince moyenne. transférer immédiatement le VNO à une petite boîte de Pétri sous un microscope stéréo sur un pack de gel de glace où les étapes restantes de la dissection seront effectuées. </li><li> Rincer le VNO dans une petite quantité de glace-froid S 2 pour empêcher le tissu de se dessécher. </li><li> Séparer les capsules cartilagineuses qui contiennent les tissus mous VNO en saisissant l&#39;arrière de l&#39;os vomer avec une pince moyenne. Positionner la capsule pour une vue dorsale de sorte qu&#39;une scission entre les deux VNO devient visible (figure 1D i). </li><li> Utilisez la pointe d&#39;une pince fine pour séparer les deux capsules de cartilage VNO de l&#39;os central tout en gardant l&#39;os vomer coincé dans la partie arrière. Remarque: Utilisez une pince seulement au bord de la capsule du cartilage et être très prudent de ne pas percer le cartilage comme l&#39;épithélium sensoriel délicat est facilement endommagé. </li><li> Une fois que les deux VNO sont séparés, commencer à enlever le cartilage encapsuler les sapinst VNO. </li><li> Prenez le rebord supérieur de la capsule avec une pince fine et de diviser l&#39;écart de la paroi du cartilage qui a été précédemment attaché à l&#39;os vomer (côté médial). </li><li> Pour enlever le cartilage restant tourner le VNO avec son côté latéral incurvé vers le bas du plat et solidement cerner le cartilage d&#39;un côté à l&#39;aide de pinces. Déplacez doucement la deuxième pince fine de la face arrière à un angle très plat entre le cartilage et VNO pour desserrer la connexion entre le tissu et le cartilage. </li><li> Lentement peler le VNO loin du cartilage en le tenant à son extrémité caudale, pour éviter d&#39;endommager l&#39;épithélium sensoriel. </li><li> Une fois que le VNO est levered de la capsule, assurez-vous d&#39;enlever toutes les petites pièces de cartilage restants comme tous les morceaux de cartilage va détacher le tissu à partir entourant agarose pendant le processus de tranchage. </li><li> Placer une petite goutte de glace-froid S 2 sur le premier VNO disséqué pour éviter des dommages aux tissus. Un gros vaisseau sanguin sur le côté latéral will deviennent visibles indiquant que l&#39;organe est encore intact et n&#39;a pas été gravement endommagé lors de la dissection (figure 2A ii). Dans le cas où le vaisseau sanguin a été endommagé, il sera toujours utile de poursuivre le tranchage du VNO aussi longtemps que la morphologie globale n&#39;a pas été altérée clairement. </li><li> disséquer immédiatement la deuxième VNO. </li><li> Pour intégrer le VNO, remplissez les deux petites boîtes de Pétri à la jante avec S fondu 3 (stocké dans un bain d&#39;eau à 42 ° C; voir 1.3). </li><li> Tenez le VNO sur l&#39;extrémité caudale plus large avec une pince fine pour éviter d&#39;endommager l&#39;épithélium sensoriel. </li><li> Immerger le VNO dans l&#39;agarose et le déplacer horizontalement d&#39;avant en arrière plusieurs fois pour enlever le film de la solution extracellulaire, ainsi que les bulles d&#39;air de sa surface. </li><li> Positionner le VNO verticalement avec la pointe caudale tournée vers le fond du plat. Au lieu de pincer le VNO avec la pince directement, ajuster l&#39;orientation en déplaçant la pointe de pince en étroite proximité du VNO. Note: Orientation lors de l&#39;incorporation est cruciale car elle détermine plan de coupe et de l&#39;accessibilité aux neurones sensoriels pendant l&#39;expérience. </li><li> Placez les plats sur la banquise de gel et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifié. Note: Ne pas modifier l&#39;orientation VNO une fois que l&#39;agarose a commencé à solidifier car cela détacher le tissu de l&#39;agarose environnant. </li></ol> 4. Coronal VNO Tissue Slicing <ol><li> Utiliser une petite spatule pour retirer le bloc d&#39;agarose du petit plat dans le couvercle d&#39;une grande boîte de Pétri, retourner l&#39;agarose à l&#39;envers en laissant sur la pointe caudale du VNO vers le haut. </li><li> Couper le bloc en une forme pyramidale à l&#39;aide d&#39;un scalpel chirurgical (3-4 mm à la pointe, 8-10 mm en bas). Prenez soin de ne pas endommager le tissu enrobé. </li><li> Utilisez super glue pour fixer le bloc en forme de pyramide au centre de la plaque d&#39;échantillon vibratome et attendre ~ 1 min pour la colle sécher complètement. </li><li> Transférer la plaque d&#39;échantillon au tranchage chambre et de préparer la deuxième VNO, en conséquence. Maintenir la plaque avec le deuxième spécimen à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Utilisez un microtome à lame vibrante avec les paramètres suivants: épaisseur: 150-200 pm; Vitesse: 3,5 au = 0,15 mm / s; fréquence: 7,5 au = 75 Hz. Transférer les tranches à la chambre oxygénant jusqu&#39;à utilisation après avoir inspecté brièvement tranche la morphologie sous le microscope de dissection. Les tranches peuvent être conservés pendant plusieurs heures. </li></ol> 5. unicellulaires électrophysiologiques Recordings <ol><li> Pour les enregistrements, utiliser un microscope de stade montant fixe équipé d&#39;objectifs d&#39;immersion en eau, Dodt ou infrarouge interférant différentiel contraste (IR-DIC) et epi-fluorescence ainsi qu&#39;une caméra CCD refroidie. Pour l&#39;acquisition des données, utiliser un amplificateur de patch-clamp, le stade de la tête, AD / DA carte d&#39;interface et un PC (y compris les logiciels d&#39;enregistrement). </li><li> Préparer un stock de 10-20 pipettes de patch (4-7 mQ). pipettes Pull de capillaires en verre borosilicate (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) USINga micropipette extracteur et le feu-polir avec un microforge. Remarque: Fire polissage des embouts de pipette est crucial quand patcher les plutôt petites VSN. Cela aidera à éviter la rupture de la membrane cellulaire lors de l&#39;application de pression négative afin d&#39;obtenir un joint haute résistance. Après le polissage de l&#39;ouverture de la pipette doit être d&#39;environ 1 pm. </li><li> Maintenir les pipettes dans un récipient de stockage de la pipette pour éviter tout dommage et de l&#39;accumulation de poussière jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Préparer le système de perfusion en remplissant les réservoirs de solution et de tubes selon la conception expérimentale. Remarque: Retirer les bulles d&#39;air à partir de tubes car ils vont fortement interférer avec les enregistrements électrophysiologiques. </li><li> Régler la pression pour atteindre ~ 3 ml / écoulement min. Remarque: Les hautes pressions vont provoquer un mouvement de la tranche de tissu, ainsi que la fin des enregistrements électrophysiologiques. </li><li> Transfert VNO tranche à la chambre d&#39;imagerie et fixer la position de tranche en utilisant l&#39;ancre en acier inoxydable câblé avec 0,1 mm d&#39;épaisseur syntfibres HETIC (Figure 2B - C). Remarque: Ne couvrez pas la tranche de tissu avec l&#39;un des fils de fibre synthétique, mais plutôt l&#39;agarose entourant la tranche. </li><li> Chambre d&#39;imagerie de transfert pour enregistrer la configuration et tranche en continu superfuse avec S oxygénée 2 à température ambiante par l&#39; intermédiaire d&#39; une application de bain. </li><li> Ajuster le capillaire d&#39;aspiration à la surface de la solution pour créer une aspiration constante lente pour un échange de solution de bain. Réglez le 8-en-1 multi-tonneau &quot;crayon de perfusion» ci - dessus et à proximité de la partie non-sensorielle de la tranche VNO qui contient le vaisseau sanguin (figure 2C, 3A) 50. Il sera bénéfique pour organiser un crayon de perfusion et l&#39;enregistrement pipette pour être en face de la tranche à partir des directions opposées. </li><li> Connecter l&#39;électrode de référence et la solution de bain à l&#39;aide d&#39;un pont d&#39;agar en forme de L (rempli de 150 mM de KCl). </li><li> Remplir la pipette en patch avec une solution de pipette S 4. </li><li> Monter la pipette sur l&#39;électrode de patch de chlorure revêtu d&#39;argent relié à l&#39;étage de la tête sans gratter le revêtement et fixer solidement. </li><li> Appliquer une légère pression positive (environ 1 ml sur une seringue en plastique de 10 ml) à la pipette de patch avant d&#39;entrer dans le bain. </li><li> Abaisser la pipette dans le bain à l&#39; aide assez loin manipulateurs micro pour pouvoir plonger l&#39;objectif sans frapper (figure 2D). </li><li> Surveiller la résistance de la pipette (R pip, entre 4-7 MQ) en utilisant le logiciel d&#39;électrophysiologie connecté à l&#39;étage de la tête. Remarque: Si R pip est &lt;4 MQ la pointe de verre est cassé. Si R pip est&gt; 10 MQ, la pointe est très probablement bouché et la pipette doit être remplacé. </li><li> Visualisez la tranche VNO avec une caméra CCD en utilisant le contraste d&#39;interférence différentiel infrarouge optimisé (DIC) et identifier FPR-RS3-i-Venus des cellules exprimant (ou similaire neurones marqués) en utilisant un éclairage à fluorescenceet un cube de filtre approprié. </li><li> Focalisation et fluorescent cible ou des cellules non fluorescentes en fonction de la conception expérimentale. </li><li> Pour approcher le corps cellulaire, utiliser des roues à main pour une sensibilité maximale. En raison de la pression positive, une petite brèche dans la membrane cellulaire soma devient visible une fois que la pointe de la pipette se trouve à proximité. </li><li> Relâchez la pression positive et appliquer une légère pression négative pour aspirer dans la membrane cellulaire afin d&#39;obtenir un joint de haute résistance (1-20 GQ). Appliquer courte et douce d&#39;aspiration pour perturber la membrane cellulaire et à établir la configuration de cellule entière. </li><li> Surveiller la résistance d&#39;accès en permanence pendant l&#39;expérience. Remarque: Inclure seulement les neurones présentant une résistance d&#39;accès petite et stable (≤3% de l&#39; entrée R; le changement &lt;20% par rapport au cours de l&#39;expérience) dans l&#39; analyse. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le VNO est une structure chemosensory qui détecte écomones. A ce jour, la plupart des récepteurs de voméronasal reste à deorphanized car seules quelques paires récepteur-ligand ont été identifiés. Parmi ceux -ci , V1rb2 a été décrit pour être spécifiquement activé par la phéromone urinaire 2-heptanone mâle 30, V2rp5 à être activé par le mâle phéromone spécifique ESP1 57 ainsi que V2r1b et V2rf2 à être activés par les peptides du CMH SYFPEITHI 48 et SEIDLILGY 58, respectivement...

La plupart des animaux comptent beaucoup sur leurs sens chimiques pour interagir avec leur environnement. Le sens de l&#39;odorat joue un rôle essentiel pour la recherche et l&#39;évaluation des aliments, éviter les prédateurs et la recherche de partenaires d&#39;accouplement appropriés. Dans la plupart des mammifères, le système olfactif est constitué d&#39;au moins quatre sous - systèmes anatomiquement et fonctionnellement distincts périphériques: l&#39;épithélium olfactif principal 1,2, 3,4 ganglion Grueneberg, l&#39;organe septale Masera 5,6 et l&#39;organe voméronasal. Le VNO comprend la structure sensorielle périphérique du système olfactif accessoire (AOS), qui joue un rôle majeur dans la détection des signaux chimiques qui transmettent des informations sur l&#39; identité, le sexe, le rang social et de l&#39; état ​​sexuel 7-10. Le VNO est situé à la base de la cloison nasale juste au-dessus du palais. Chez la souris, il est un tube borgne se terminant bilatéral enfermées dans une capsule cartilagineuse 13/11. L&#39;organe se compose de deux un épithélium sensoriel médial en forme de croissantlium qui abrite les VSN et d&#39;une partie non-sensorielle sur le côté latéral. Entre les deux épithéliums se trouve une lumière de mucus rempli qui est relié à la cavité nasale par l&#39;intermédiaire du voméronasal canal étroit 14. Un grand vaisseau sanguin latéral dans le tissu non-sensorielle fournit un mécanisme de pompage vasculaire pour faciliter l&#39; entrée des molécules relativement grandes, essentiellement non volatiles , tels que des peptides ou de petites protéines dans la lumière à travers VNO pression négative 15,16. Les composants structurels du VNO sont présents à la naissance et l&#39;organe atteint la taille adulte , peu avant la puberté 17. Toutefois, si l&#39;AOS de rongeur est déjà fonctionnelle chez les juvéniles est encore sujette à débat 18-20. VSN se distinguent à la fois par leur localisation epitheliale et du type de récepteur qu&#39;elles expriment. VSN présentent une morphologie bipolaire avec un axone non myélinisées et un seul dendrite apicale qui fait saillie vers la lumière et se termine par un bouton microvillositaire dendritique. VSN axons fasciculate pour former le nerf voméronasal qui laisse la capsule cartilagineuse à la fin dorso-caudale, monte le long du septum, passe la lame criblée et les projets vers le bulbe olfactif accessoire (AOB) 21,22. L&#39;épithélium sensoriel voméronasal se compose de deux couches: la couche apicale est située plus près du côté luminal et les deux ports V1R- et tous sauf un type de FPR-rs-exprimant les neurones. Ces neurones coexpriment du G-protéine α-unité Gai2 et projet à la partie antérieure de l&#39;AOB 23-25. Les neurones sensoriels situés dans les V2Rs express de la couche basale plus ou TFP-RS1 aux côtés G et ao envoient leurs axones dans la région postérieure de l&#39;AOB 26-28. Les neurones sont susceptibles voméronasal activés par plutôt petits (29-33 sémiochimiques V1Rs) ou les composés protéiniques (34-38 V2Rs) qui sont sécrétées dans divers fluides corporels tels que l&#39; urine, la salive et le fluide se déchirent 37,39-41 </sup&gt;. Dans les expériences in situ ont montré que VSN sont également activés par des peptides formylés et divers / inflammation liée à des composés antimicrobiens 25,42. En outre, hétérologue exprimé les protéines du FPR-rs partagent des spectres agonistes avec FPRS exprimés dans le système immunitaire, ce qui indique un rôle potentiel en tant que détecteurs pour la maladie dans leurs congénères ou sources alimentaires gâtés 25 (voir référence 43). Fondamental pour la compréhension des relations de récepteur-ligand et des cascades de signalisation en aval des populations VSN spécifiques est une évaluation détaillée de leurs caractéristiques biophysiques de base dans un environnement natif. Dans le passé, l&#39;analyse de la signalisation cellulaire a grandement bénéficié d&#39;animaux génétiquement modifiés qui marquent une population définie de neurones par coexpression d&#39; une protéine marqueur fluorescent 30,44-49. Dans ce protocole, une lignée de souris transgénique qui exprime FPR-RS3 conjointement avec un marqueur fluorescent (Fpr-RS3-i-Venus) est utilisé.Cette approche illustre comment utiliser une telle souche de souris génétiquement modifiées pour effectuer une analyse électrophysiologique d&#39;une population de cellules optiquement identifiable à l&#39;aide unique neurone patch-clamp enregistrements dans des tranches de tissu VNO coronales aiguës. Une pression axée sur l&#39;air système de perfusion multi-corps pour des stimuli sensoriels et agents pharmacologiques permet la stimulation neuronale rapide, réversible et focale ou inhibition pendant les enregistrements. enregistrements de cellules entières dans des préparations de tranche permettent une analyse détaillée des propriétés intrinsèques, conductances de tension activé, ainsi que les modes de décharge potentiels d&#39;action dans l&#39;environnement natif de la cellule.

<table><tbody><tr><td><fort>Produits chimiques</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (basse température de gélification)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanesulfonic (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Outils chirurgicaux et consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Boîte de Pétri</td>, décapitation <td>VWR</td><td></td><td>90 mm, dissection de capsule VNO</td></tr><tr><td>Petite boîte de Pétri,</td> couvercle <td>VWR</td><td></td> 35 mm <td>pour dissection VNO, boîte pour enrobage dans l’agarose</td></tr><tr><td>Grand ciseau chirurgical tranchant</td> Outils <td></td><td>de science fine</td><td>décapitation, ablation de la mâchoire inférieure</td></tr><tr><td>Ciseaux à os solides</td><td>Outils de science fine coupant</td><td></td><td>les incisives</td></tr><tr><td>Pince moyenne, pince Dumont #2</td><td>Outils</td><td></td> de science fine <td>pour enlever la peau et le palais</td></tr><tr><td>Ciseaux à micro-ressort, 8,5 cm, incurvés, lames de 7 mm&nbsp ;</td>Outils <td></td><td>de science fine</td><td>pour découper VNO&nbsp ;</td></tr><tr><td>Deux paires de pinces fines, pince Dumont #5 Outils de</td><td>science</td><td></td> fine <td>disséquant le VNO hors d’une capsule cartilagineuse</td></tr><tr><td>Petite spatule en acier inoxydable</td><td>Outils de</td><td></td><td>science fine manipulant un bloc d’agarose et des tranches de tissu</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td> chirurgical <td>coupant le bloc d’agarose en forme pyramidale</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products-Caméra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre, excitation : BP 450-490, suppression : LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Lampe à fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique à plaque chauffante</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp ;</td>Appareil micromanipulateur <td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes, vertical à deux étages</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Éliminateur de bruit 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Objectif&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre&nbsp ;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion 8-en-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-mètre cinq easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pot de conservation des pipettes</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement&nbsp ;</td><td>Luigs & </td><td>Neumann Slice mini chambre</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de stockage de tranches oxygénantes ; les chambres commerciales alternatives sont : par exemple , BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) ou la préchambre (BSC-PC ; Warner Instruments)</td>stéréomicroscope <td>sur</td><td></td><td></td>mesure</tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Interface de déclenchement&nbsp ;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp ;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie&nbsp ;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

en profondeur physiological analyse des populations de cellules définies dans le tissu tranches aiguë de l&#39;vomeronasal organ souris

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Chez la plupart des mammifères, l’organe voméronasal (VNO) est une structure chimiosensorielle qui détecte à la fois les signaux sociaux hétéro- et conspécifiques. Les neurones sensoriels voméronasaux (VSN) expriment un type spécifique de récepteur couplé aux protéines G (RCPG) à partir d’au moins trois familles de gènes chimiorécepteurs différentes, permettant une détection sensible et spécifique des signaux chimiosensoriels. Ces familles comprennent les familles de gènes V1r et V2r ainsi que la famille de gènes chimiorécepteurs présumés présumés de la séquence du récepteur du peptide formyle (FPR) (Fpr-rs). Afin de comprendre la physiologie des interactions récepteur-ligand voméronasal et la signalisation en aval, il est essentiel d’identifier les propriétés biophysiques inhérentes à chaque classe spécifique de VSN.
L’approche physiologique décrite ici permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels à l’aide d’une lignée de souris transgéniques (Fpr-rs3-i-Venus). L’utilisation de ce protocole, cependant, n’est pas limitée à cette lignée spécifique et peut donc facilement être étendue à d’autres lignées génétiquement modifiées ou à des animaux de type sauvage.

Pour mieux comprendre les propriétés biophysiques et physiologiques des populations cellulaires définies, nous effectuons des coupes de tissu coronales aiguës de la souris VNO (Figure 1 - 2). Après dissection, les tranches peuvent être conservés dans oxygénée solution extracellulaire glacée (S 2) pour plusieurs heures. A la configuration de l&#39; enregistrement, un échange constant avec une solution oxygénée frais (figure 2D)...

Ici, nous décrivons une approche physiologique qui permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes aiguës de tissu coronal de l’organe voméronasal de souris à l’aide d’enregistrements patch-clamp de cellules entières.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer une analyse électrophysiologique au niveau de la cellule unique d'une population définie de neurones sensoriels dans des tranches de tissu aiguës provenant de l'organe voméro-nasal de la souris. Cette méthode peut aider à élucider des questions clés dans le domaine de la chimiosensation, telles que les mécanismes de détection des molécules chimiques. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, en enregistrant l'activité des neurones sensoriels dans des tranches de tissu aiguës, ces cellules peuvent être étudiées dans leur environnement naturel.Pour commencer cette procédure, après avoir sacrifié l'animal, retirez sa mâchoire inférieure en insérant une paire de ciseaux chirurgicaux de grande taille dans la cavité buccale, puis coupez séparément les os et les muscles de la mandibule de chaque côté. Ensuite, retirez la peau de la mâchoire supérieure et autour de l'extrémité du nez à l’aide de pinces moyennes afin d’obtenir un meilleur accès aux incisives. Puis, utilisez les ciseaux à os pour sectionner la plus grande partie des incisives selon un angle de 45 degrés en direction rostrale, afin de faciliter le retrait de la capsule du VNO de la cavité nasale.Ne coupez pas la racine de la dent afin d'éviter d'endommager l'extrémité de la capsule de l'organe voméro-nasal. Ensuite, saisissez le palais rigide par sa partie rostrale à l'aide d'une pince moyenne et retirez-le soigneusement d'un seul tenant, selon un angle plat. Rincez à plusieurs reprises la cavité nasale avec la solution S2 glacée. Utilisez ensuite des ciseaux micro-chirurgicaux à ressort pour sectionner l'effusion osseuse située entre l'extrémité de l'os vomer et la mâchoire.Insérez les extrémités des ciseaux avec la partie incurvée orientée vers l'extérieur par rapport au VNO. Coupez soigneusement l'os en petites étapes, des deux côtés gauche et droit, en position latérale par rapport à la capsule du VNO. Pour retirer la capsule du VNO, sectionnez l'os vomer à sa partie caudale, puis soulevez délicatement l'os vomer de la cavité nasale à l’aide de pinces moyennes.Transférez immédiatement le VNO dans une petite boîte de Pétri sous un microscope stéréo placé sur une poche de gel réfrigérée, où les étapes restantes de la dissection doivent être effectuées. Ensuite, rincez le VNO avec une petite quantité de S2 glacé, afin d'empêcher le tissu de se dessécher. Puis, séparez les capsules cartilagineuses contenant les tissus mous du VNO en saisissant l'arrière de l'os vomérien avec une pince moyenne.Pour cela, positionner la capsule en vue dorsale afin qu'une séparation entre les deux VNO devienne visible. Utiliser la pointe de pinces fines pour séparer les deux capsules cartilagineuses des VNO de l'os central, tout en maintenant l'os vomer fixé à la partie postérieure. S'assurer que la paroi cartilagineuse médiale, précédemment attachée à l'os vomer, soit retirée.Lors de la suppression du cartilage autour de l'organe voméronasal, utiliser la pince uniquement au niveau du bord de la capsule cartilagineuse. Veiller soigneusement à ne pas endommager l'épithélium sensoriel délicat. Pour éliminer le cartilage restant, tourner l'organe voméronasal de sorte que son côté latéral incurvé soit orienté vers le fond de la boîte, puis fixer fermement le cartilage d'un côté à l'aide d'une pince.Ensuite, déplacer soigneusement la deuxième pince fine depuis l'arrière selon un angle très faible, entre le cartilage et l'organe voméro-nasal, afin de desserrer la connexion entre le tissu et le cartilage. Pour éviter d'endommager l'épithélium sensoriel, détacher lentement l'organe voméro-nasal du cartilage en le tenant par son extrémité caudale. Une fois l'organe voméro-nasal désolidarisé de la capsule, retirer toutes les petites parties restantes de cartilage, car tout fragment résiduel de cartilage détacherait le tissu de l'agarose environnante durant le processus de découpe.Ensuite, déposez une petite goutte de S2 glacée sur le premier VNO disséqué afin de prévenir tout dommage tissulaire. Pour inclure les VNO, remplissez les deux petites boîtes de Pétri jusqu'au bord avec du S3 fondu. Plongez ensuite chaque VNO dans l'agarose et déplacez-le horizontalement plusieurs fois en avant et en arrière pour éliminer la pellicule de solution extracellulaire ainsi que toute bulle d'air présente à sa surface. Positionnez le VNO verticalement, avec son extrémité rostrale orientée vers le fond de la boîte.Ensuite, placez les deux boîtes sur une poche de glace en gel et attendez que l'agarose ait complètement solidifié. Ne modifiez pas l'orientation du VNO une fois que l'agarose a commencé à durcir, car cela détacherait le tissu de l'agarose environnante. Dans cette procédure, utilisez une petite spatule pour transférer le bloc d'agarose de la petite boîte vers le couvercle d'une grande boîte de Pétri, puis retournez le bloc d'agarose à l'envers, de sorte que l'extrémité rostrale du VNO soit orientée vers le haut.Ensuite, découpez le bloc en forme de pyramide à l'aide d'un scalpel chirurgical, en prenant soin de ne pas endommager le tissu inclus. Puis, utilisez de la colle forte pour fixer le bloc en forme de pyramide au centre de la plaque d'échantillon du vibratome. Attendez environ une minute pour que la colle sèche complètement.Tranchez l'échantillon en sections de 150 à 200 micromètres d'épaisseur. Examinez brièvement la morphologie des tranches au microscope stéréoscopique. Transférez ensuite toutes les tranches dans la chambre d'oxygénation jusqu'à leur utilisation.Dans cette étape, transférez une coupe du VNO dans la chambre d'imagerie et fixez la position de la coupe à l'aide d'un ancrage en acier inoxydable relié par des fibres synthétiques d'un diamètre de 0,1 millimètre. N'entourez pas la coupe de tissu avec les fils en fibres synthétiques. Ensuite, transférez la chambre d'imagerie vers le dispositif d'enregistrement et perfusez continuellement la coupe avec du S2 oxygéné à température ambiante.Régler la pipette d'aspiration au niveau de la surface de la solution afin de créer un échange constant de la solution de bain. Ensuite, positionner le crayon de perfusion multipuits 8 en 1 juste au-dessus et à proximité de la partie non sensorielle de la coupe du VNO contenant le vaisseau sanguin. Puis, relier l'électrode de référence à la solution de bain à l'aide du pont d'agar en forme de L rempli de chlorure de potassium à 150 millimolaire.Ensuite, remplissez la pipette de patch avec la solution pipette S4. Placez la pipette au-dessus de l'électrode revêtue de chlorure d'argent reliée à l'étage d'entrée sans enlever le revêtement et fixez-la fermement. Appliquez ensuite une légère pression positive sur la pipette de patch avant de pénétrer dans le bain. Surveillez la pipette et assurez-vous que sa résistance se situe entre quatre mégohms et dix mégohms.Visualisez la coupe du VNO à l’aide d’une caméra CCD utilisant un contraste interférentiel différentiel (DIC) optimisé pour l’infrarouge, et identifiez les cellules exprimant FPR-rs3 i-Venus ou des neurones marqués de façon similaire à l’aide d’un éclairage en fluorescence et d’un cube de filtres approprié. Approchez le corps cellulaire à l’aide des molettes manuelles afin d’obtenir une sensibilité maximale. En raison de la pression positive, une petite déformation de la membrane du soma cellulaire devient visible dès que la pointe de la pipette est en proximité immédiate.Ensuite, relâchez la pression positive et appliquez une légère pression négative pour aspirer la membrane cellulaire afin d'obtenir un scellement de haute résistance compris entre un et 20 gigaohms. Appliquez ensuite une aspiration brève et douce pour rompre la membrane cellulaire et établir la configuration en tout cellulaire. Sur cette figure, une image confocale d'une coupe coronale de tissu du VNO montre la distribution des neurones positifs pour FPR-rs3 Tau Venus dans l'épithélium sensoriel voméronasal.Les neurones positifs pour FPR-rs3 Tau Venus présentent un unique dendrite apical se terminant par une structure en forme de bouton au niveau de la bordure luminaire. On observe ici des enregistrements en configuration whole cell effectués sur le soma des VSN. Voici des tracés représentatifs d’enregistrements en configuration whole cell d’un courant sodique rapide et sensible à la TTX, obtenus dans des VSN positifs pour FPR-rs3.Les enregistrements par palier de tension dans des conditions de contrôle révèlent un courant entrant rapide et transitoire dépendant de la tension. Le traitement par la toxine tétradoxique (TTX) à une concentration d'un micromolaire diminue fortement ce courant. Et le tracé soustrait numériquement, montré ici, met en évidence le courant sodique sensible à la TTX et activé par la tension.Les tracés représentatifs en mode courant imposé montrent une dépolarisation et une hyperpolarisation, ainsi que des trains de potentiels d'action générés par injection de courant positive et négative par paliers. Une fois maîtrisées, la dissection et la coupe des tissus peuvent être réalisées en environ une heure pour les deux ONV. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les enregistrements extracellulaires en configuration patch lâche ou l'imagerie calcique peuvent être effectuées afin d'augmenter le débit d'analyse lors de l'étude de populations neuronales plus importantes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tranches tissulaires aiguës de l'organe voméro-nasal buccal, et comment réaliser des enregistrements électro-physiologiques unitaires à partir de neurones sensoriels voméro-nasaux.

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