Name: Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez les mécanismes de contrôle vasculaire par microscopie vidéo d'artères de résistance isolées de rats. Cette méthode permet d'évaluer la réactivité des vaisseaux et les interactions endothéliales pour la recherche en biologie vasculaire.

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Les auteurs expriment leurs sincères remerciements à Katie Fink et Lynn Dondlinger pour leur aide précieuse dans la préparation de ce manuscrit.
Subventions : NIH #R21-OD018309 ; #R56-HL065289 ; et #R01-HL128242.

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Tel que mentionné dans l’introduction, ce document décrit l’utilisation de la microscopie de télévision et artère résistance isolée s’approche pour évaluer la fonction vasculaire non seulement dans les modèles standard de rat (tel qu’employé dans la vidéo), mais aussi en hautement spécialisée génétiquement souches de rats machiné, qui montrent le roman et les aperçus puissants qui peuvent être obtenus en utilisant ces approches. L’utilisation de ces techniques puissantes pour évaluer ton actif et des propriétés mécanique...

Les premières études de la fonction vasculaire dans les artères de conduit artères utilisées et dans de nombreux cas, l’aorte. Mise sur pied dans les grosses artères a été généralement étudiée en attachant un segment de l’anneau de l’artère d’un capteur de force dans un bain de tissu ; dans le cas de l’aorte, par une coupe hélicoïdale bandes du navire afin que les fibres musculaires lisses étaient orientés dans la direction longitudinale entre le point d’attache et le capteur de force, de fournir la meilleure estimation de la force générée par la contraction de le muscle lisse le long de son axe longitudinal. La technique standard pour la découpe de bandes hélicoïdales d’aortes consistait à placer une baguette de verre dans la lumière du vaisseau, faire une incision dans la paroi des vaisseaux sur l’angle désiré et accrochez-vous à la fin du bord de la paroi des vaisseaux exposé comme la coupe a été étendue afin de produire l’intégralité d’une bande hélicoïdale du navire. À ce moment-là, la face endothéliale du navire était généralement effacée afin d’éliminer les débris avant de fixer la bande du navire pour le capteur de force et submergeant la préparation dans une oxygéné et préparation tissulaire à température contrôlée. Finalement, qu’approche conduit à une des découvertes plus célèbres et importants dans l’histoire de la physiologie par Robert Furchgott et Zawadski1, à savoir le rôle de l’endothélium dérivé facteur relaxant (EDRF), par la suite identifié comme l’oxyde nitrique, dans régulation de la fonction vasculaire. L’événement crucial ayant mené à cette découverte est une situation dans laquelle les enquêteurs maintient un endothélium intact en évitant le contact du côté de l’artère avec surfaces étrangères endothélial et remarqué que les bandes d’aortes ne montrent pas les attendus contraction à l’acétylcholine (ACh), mais plutôt détendu en réponse à l’ACh. Basé sur cette observation, les enquêteurs ont mis au point une préparation « sandwich » dans laquelle ils ont attachaient un segment aortique avec un endothélium intact (mais il est incapable de générer une force contractile) sur une bandelette hélicoïdale standard de l’aorte et converti induite par l’ACh contraction dans une détente.
Deux avancées majeures dans ce domaine qui sont largement utilisées aujourd'hui sont le développement de préparations pour mesurer la force contractile active dans la résistance petites artères2,3 (comme dans le mésentère intestinal3 ) et canulé résistance artère préparations4,5,6. Dans un des premiers rapports, Mulvany et Halpern3 décrit l’utilisation de la préparation de myographe fil pour étudier la force contractile active dans les artères de résistance isolée du mésentère intestinal des rats spontanément hypertendus (SHR) et contrôles WKY normotendus. À la suite de l’élaboration du système fil myographe, préparations d’artères de résistance canulés ont été développées afin de permettre des études des vaisseaux plus près en vivo conditions4,5,6.  Alors que les deux approches fournissent des résultats précieux, la préparation de l’artère canulées a l’avantage supplémentaire de plus effectivement préserver tonus actif intrinsèque dans les artères ; et en permettant aux chercheurs de l’étude actives myogènes réactions aux changements transmurale pression et navire réponses aux variations de débit et endothéliale contrainte de cisaillement (voir examen de Halpern et Kelley6).
Des principaux objectifs du présent document sont de décrire comment employer la technique séculaire des artères de résistance isolés, canulées microscopie vidéo afin d’obtenir des informations précises quant aux mécanismes qui régulent la tonalité active dans ces crucial navires, indépendantes des influences de cellules neurales, humorale ou parenchymateux. Cette information de base, utilisant un modèle de rat standard et des exemples de nos études de nouveau génétiquement machiné des souches de rats, fournira au lecteur une idée des types de la perspicacité au sujet de la fonction vasculaire qui peut être obtenu avec la télévision méthodes de microscopie, et qui peuvent être utilisés dans les études impliquant n’importe quel contrôle et expérimentales ou les groupes de choix de l’enquêteur, y compris les puissants nouveaux modèles expérimentaux rat produit par consanguinité sélective et nouvellement développé génétique techniques d’ingénierie.
Grâce à la précision des méthodes de microscopie de télévision, mesure des changements de diamètre dans des préparations d’artères canulées peut fournir des informations très utiles concernant les mécanismes de l’endothélium-dépendante et indépendante de l’endothélium de vasculaire relaxation, ainsi que des modifications importantes (et parfois inattendues) dans les mécanismes de contrôle vasculaire survenant avec l’hypertension, régime hypersodé et autres interventions expérimentales. En outre, mesure des relations pression-diamètre en isolé et canulé artères de résistance qui sont détendus au maximum par un traitement avec Ca2 +-gratuit solution ou un médicament vasodilatateur pharmacologique, permet à l’enquêteur d’évaluer changements structurels dans les artères en raison de remodelage vasculaire et pour calculer la contrainte passive relations7 qui peut donner un aperçu important de changements des propriétés mécaniques passives des artères qui peuvent affecter la fonction artérielle autonome de (ou en plus) changements dans les mécanismes de contrôle actif. Il est également important de noter qu’information tirée des études des artères de résistance isolée peut être complétée par les informations obtenues utilisant LDF, une méthode pratique pour l’évaluation de la perfusion tissulaire à l’animal tout niveau8,9 ,10, et de l’information obtenue grâce à l’évaluation des microvaisseaux de densité à l’aide de fluorescent étiqueté lectine de GS1, qui se lie spécifiquement aux portions de glycoprotéine dans les membranes basales des petites artérioles et capillaires11 , 12. la dernière méthode fournit une estimation très précise des microvaisseaux densité qui ne relève pas des classiques difficultés rencontrées dans l’estimation de densité des microvaisseaux en comptant les navires en vivo, par exemple manquant non perfusés navires où le débit sanguin est arrêté en raison de la fermeture active des artérioles. Utilisés ensemble, ces approches peuvent fournir un aperçu important pour mettre en corrélation les altérations fonctionnelles dans les artères isolées de résistance aux changements de perfusion tissulaire au niveau microcirculatoire ; et quelques exemples de l’utilisation de ces approches précieux conjointement avec artère canulées techniques seront également fournis dans le présent manuscrit.
Le présent document met l’accent sur l’utilisation des techniques de microscopie vidéo pour évaluer des changements vasculaires dans les artères des rats Sprague-Dawley non consanguins. Cependant, il est important de noter que ces techniques se sont avérés pour être très utiles dans l’élucidation des altérations phénotypiques de souches hautement spécialisés rat génétiquement créés par reproduction sélective ou de gène en utilisant des techniques d’édition. Dans ce manuscrit, nous fournir des exemples des techniques de microscopie vidéo comment ont fourni des renseignements importants au sujet de la fonction vasculaire dans un certain nombre de rat précieux modèles, dont la souche de rat-an consanguins rat Dahl sensibles au sel (SS) qui est le plus largement modèle expérimental permettant d’étudier les mécanismes du sel hypertenson sensible18,19,20,21,22,23; et les rats de tendance créés par reproduction sélective des rats SS avec la souche de rat Brown Norway (BN) sel-insensible. Dans les panneaux de rat tendance, chaque chromosome chez le rat Brown Norway a été introduits individuellement dans le bagage génétique Dahl SS24,25,26 . Utilisation de panneaux de rat tendance a fourni des indices précieux sur les chromosomes spécifiques qui contribuent au sel sensibilité de la pression artérielle et d’autres phénotypes, y compris la vasoréactivité24,25,26 ,27,28.
Stratégies de reproduction sélective utilisant SS rats et rats de toutes porteuses de chromosomes individuels de BN ont également permis la génération de souches congéniques rétrécie avec petits segments d’individuels Brown Norvège chromosomes introduits dans la SS Dahl génétique fond22,29. Ceux-ci peuvent fournir des gènes spécifiques extrêmement précieux d’entrée sur ou réduire leur régions des chromosomes qui peuvent affecter les variables physiologiques essentiels, tels que l’hypertension, lésions rénales et réactivité vasculaire22,29. Un autre plus puissant à la boîte à outils génétique du rat est le développement de modèles de rats gène knockout utilisant avancée gène édition techniques y compris ZFNs, transcriptionnelles activator-like-effecteur nucléases (TAPS) et plus récemment CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. L’avènement de ces techniques puissantes qui permettent des gènes d’être assommé chez le rat est une évolution extrêmement importante parce que le gène knockout études à ce jour ont utilisé (et continuent à utiliser) souris presque exclusivement. Une autre composante expérimentale dans le présent document démontre la valeur des techniques de l’artère canulés et microscopie vidéo afin d’évaluer les mécanismes de contrôle physiologique chez les rats knockout manque la transcription de protection antioxydante et cellule maître facteur, facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 (NRF2)30,31, qui ont été développés à l’aide de la technologie TALEN dans le bagage génétique de Sprague-Dawley17. Dans ces expériences, techniques de microscopie vidéo in vitro ont été utilisés pour assurer la vérification fonctionnelle de la perte du gène NRF2 et tester une approche thérapeutique potentiellement précieuse basée sur directe upregulation de NRF2-mediated antioxidant défenses. NRF-2 est de grande importance thérapeutique dans la lutte contre le stress oxydant vasculaire chez les humains, à la lumière des résultats décevants des essais cliniques portant sur l’administration directe d’antioxydants comme les vitamines C et E,32.

<table><tbody><tr><td>SS Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS/JHsd/Mcwi strain</td><td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.5BN Consomic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.13BN Consomic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS-Chr 13BN/souche Mcwi</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-BN Congenic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS. BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi souche</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSA Congenic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS. BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi souche</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSB Congenic Rat</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SS. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi souche</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td><td>Medical College of Wisconsin</td><td>SD-Nfe212em1Mcwi souche</td><td>Contacter Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Low Salt Rat Chow (0,4 % NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>Nourriture pour rats à haute teneur en sel (4 % NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113756</tr><tr><td>Colorado Video Caliper</td><td>Colorado Video, Inc.</td><td>Modèle 308</td><td></td></tr><tr><td>Caméra vidéo</td><td>Hitachi</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Life Science</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur de télévision</td><td>Panasonic</td><td>WVBM1410</td><td></td></tr><tr><td>Transducteurs de pression</td><td>Stoelting</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’affichage de la pression artérielle</td><td>Stoelting</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>Chambre artérielle canulée</td><td>Instrumentation des systèmes vivants</td><td>CH-1</td><td>Chambre à cuve unique à usage général</td></tr><tr><td>Régulateur de température pour</td><td>instrumentation des systèmes vivants</td> à chambre unique <td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dispersion de gaz, miniature, droit</td><td>Instrumentation des systèmes vivants</td><td>GD-MS</td><td>Assure l’aération dans le bain de la cuve</td></tr><tr><td>Oxygénateur d’échange gazeux, Instrumentation miniature</td><td>des systèmes vivants</td><td>OX</td><td>Permet l’échange de gaz avec perfusat</td></tr><tr><td>Débitmètre laser-Doppler</td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 Lectin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires en verre pour micropipettes</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td><td>2 mm ODX1 mm ID</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette verticale</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 700C</td><td></td></tr><tr><td>Matériau de suture en nylon (10/0)-3 PLY</td><td>Ashaway Line et Twine Manufacturing Co.</td><td>114-ANM-10</td><td>Brins simples de suture en nylon à 3 plis retirés pour une utilisation sur les vaisseaux</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Protandim</td><td>Protandim</td><td></td><td>NRF2 Inducteur : Contactez Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (d-glucose) anhydre</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4-7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880-500 G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2-2 H2O)</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique (NaH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de rats

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie television in vitro pour évaluer la fonction vasculaire dans les artères isolées de résistance cérébrale (et d’autres bateaux) et décrit les techniques permettant d’évaluer la perfusion tissulaire en utilisant le Laser Doppler débitmétrie (LDF ) et densité microvaisseaux utilisant fluorescent étiqueté lectine de Griffonia simplicifolia (GS1). Les méthodes actuelles pour l’étude isolement des artères de résistance au transmurale pressions rencontrées en vivo et en l’absence de cellules parenchymateuses influences fournissent un lien essentiel entre les études in vivo et les renseignements obtenus à partir de moléculaire approches réductionnistes qui donnent un aperçu limité de réponses intégratives au niveau animaux. LDF et techniques pour identifier sélectivement les artérioles et capillaires avec fluorescent marqué GS1 lectine fournissent des solutions pratiques pour permettre aux enquêteurs d’étendre les connaissances tirées de l’étude des artères de résistance isolée. Cet article décrit l’application de ces techniques d’acquérir des connaissances fondamentales de la physiologie vasculaire et de la pathologie chez le rat comme modèle expérimental général et dans une variété de spécialisées génie les souches de rats « designer » qui peuvent fournir important aperçu de l’influence des gènes spécifiques sur les phénotypes vasculaires importants. Utilisant ces approches expérimentales précieux dans les souches de rats mis au point par des stratégies de reproduction sélective et nouvelles technologies de production de modèles de knock-out du gène chez le rat, élargira la rigueur des scientifiques locaux mis au point dans les modèles de souris knock-out et étendre cette connaissance à un modèle animal plus pertinent, avec un contexte physiologique bien compris et les qualités d’études physiologiques en raison de sa plus grande taille.

In vitro la microscopie des artères de résistance canulées permet pour l’étude des facteurs influençant la tonalité active dans les artères de faible résistance (et plus grandes artérioles) à des pressions normales en vivo transmurale et en l’absence de cellules parenchymateuses influences. En plus d’évaluer la réactivité des navires à divers stimuli vasodilatateur et vasoconstricteur et myogènes réponses à l’élévation de la pression transmurale de PSS normal, le Ca...

Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des artères de résistance isolées afin d'évaluer la réactivité des vaisseaux aux stimuli vasoactifs. Elle montrera également comment évaluer les modifications des mécanismes de contrôle du muscle lisse ainsi que les propriétés mécaniques passives. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie vasculaire concernant les mécanismes de contrôle endothélial et du muscle lisse vasculaire dans les artères de petite résistance sous diverses conditions.Le principal avantage de cette technique est que les artères à faible résistance peuvent être isolées de l'environnement cellulaire du parenchyme et maintenues à leur pression normale pendant que l'on teste leurs réponses à des stimuli vasoactifs. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic du dysfonctionnement vasculaire. Ce type de manipulation n'est pas possible in vivo.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les maladies vasculaires périphériques, elle peut également être appliquée à la maladie coronarienne. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de microcanulation sont diffic

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Médecine

Nous démontrons un modèle de ligature artérielle roman dans le muscle spinotrapezius murin, y compris une procédure étape par étape et une description de l'instrumentation nécessaire. Nous décrivons la chirurgie et la mesure des résultats pertinents relatifs au remodelage du réseau vasculaire et une vasodilatation fonctionnelle en utilisant la microscopie confocale et intravitale.

Modèle murin Spinotrapezius pour évaluer l&#39;impact de la ligature artériolaire sur la fonction microvasculaire et Rénovation

Dans myographie de pression, un petit segment intact d'un navire est montée sur deux petites canules et mis sous pression à une pression intracavitaire approprié. Ici, nous décrivons la méthode pour mesurer la réponse de vasorelaxation de la souris...

Évaluer murin Fonction Artère résistance à l&#39;aide myographie de pression

myographie de pression est utilisée pour évaluer vasoactivité des petites artères qui se développent constriction soutenue lorsqu'il est sous pression. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer dans des segments isolés de petites artères mésentériques des rats, vasoactivité et l'effet de la pression intraluminale sur le diamètre vasculaire.

Évaluer la réponse Myogenic et vasoactivité dans les artères mésentériques Résistance Utilisation myographie de pression

Vidéomicroscopie systèmes sont utilisés pour étudier les propriétés fonctionnelles des artérioles isolée du tissu adipeux en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques. Cette technique permet d’examiner des phénotypes microvasculaires dans des domaines différents du tissu adipeux chez les humains obèses.

Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Le protocole décrit l’utilisation de la myographie de fil pour évaluer la tension isométrique transmurale des artères mésentériques isolées des souris, avec une prise en considération spéciale de la modulation par des facteurs libérés des cellules endothéliales et des tissus adipeux périivasculaires.

Évaluation de la réactivité de la tonalité vasculaire à l’aide d’artères mésentériques isolées avec focalisation sur la modulation par les tissus adipeux Perivasculaires

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Le présent protocole décrit les concepts et l’application technique de la technique du myographe tensométrique utilisant un système myographique à chambres multiples dans l’évaluation expérimentale ex vivo de la fonction endothéliale aortique de la souris.

Mesure de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium dans l’aorte thoracique de souris à l’aide de la myographie tensométrique à petit volume

Le présent protocole décrit la technique du myographe filaire pour mesurer la réactivité vasculaire de l’artère coronaire du rat.

Préparation standardisée de l’anneau coronaire de rat et enregistrement en temps réel des changements de tension dynamiques le long du diamètre du vaisseau

Syndrome de transfusion jumeau à jumeau et double séquence polycythémie anémie sont deux problèmes potentiellement dévastateurs de la médecine périnatale. Les deux troubles se produisent seulement dans les jumeaux monozygotes et résultent de la circulation sanguine par le biais du placenta déséquilibrée anastomoses vasculaires. Nous fournissons un protocole simple d'évaluer avec précision la présence d'anastomoses vasculaires en utilisant l'injection de colorant couleur des vaisseaux...

Évaluation précise et simple des anastomoses vasculaires dans le placenta monochoriales utilisant colorant

Découvrez les mécanismes de contrôle vasculaire par microscopie vidéo d'artères de résistance isolées de rats. Cette méthode permet d'évaluer la réactivité des vaisseaux et les interactions endothéliales pour la recherche en biologie vasculaire.

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

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