Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des artères de résistance isolées pour tester la réactivité des vaisseaux aux stimuli vasoactifs. Il montrera également comment évaluer les changements dans les mécanismes de contrôle des muscles lisses et les propriétés mécaniques passives. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire concernant les mécanismes de contrôle des muscles lisses endothéliales et vasculaires dans les artères de petite résistance dans diverses conditions.

Le principal avantage de cette technique est que les artères de petite résistance peuvent être isolées de l’environnement des cellules parenchymateuses et maintenues à leur pression normale pendant que les réponses aux stimuli vasoactifs sont testées. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie et au diagnostic de la dysfonction vasculaire. Ce type de manipulation n’est pas possible in vivo.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des maladies vasculaires périphériques, elle peut également être appliquée aux maladies coronariennes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de microcanulation sont difficiles à apprendre en raison de la délicatesse de la procédure et de la nécessité d’éviter d’endommager l’artère. Le jour de l’expérience, préparez deux litres d’une solution saline physiologique dans un erlenmeyer de deux litres.

Lors de l’ajout de la masse tampon 20X, assurez-vous que la solution s’équilibre en permanence avec le mélange gazeux et agitez-la avec une barre d’agitation magnétique. Ensuite, surveillez le pH tout en ajoutant 0,28 gramme de phosphate monosodique au mélange. Si nécessaire, saupoudrez le pH en ajoutant des gouttes de six solutions normales d’acide chlorhydrique ou de 6,5 d’hydroxyde de sodium normal à partir d’une pipette Pasteur afin que le pH reste à 7,4.

Ajoutez ensuite 1,98 gramme de glucose à la solution saline physiologique. Ensuite, préparez 500 millilitres d’une solution saline physiologique sans calcium en diluant la solution mère 20X dans de l’eau désionisée. Ensuite, ajoutez 25 millilitres de la substance tampon 20X dans un erlenmeyer et ajoutez 0,07 gramme de phosphate monosodique à la solution tout en surveillant et en ajustant le pH de la solution.

Utilisez un tube en tétrafluoroéthylène pour connecter un réservoir de gaz contenant le mélange de gaz approprié au bain d’organe. Faites bouillonner continuellement la solution à un rythme suffisant pour assurer un bouillonnement continu, mais non turbulent, de la solution s’écoulant dans la chambre du récipient. Placez également une petite pierre à air reliée au mélange de gaz d’équilibre dans la chambre du récipient pour aider à maintenir la composition gazeuse de la solution saline physiologique.

Placez la solution saline physiologique dans une bouteille Mariotte de deux litres. Ajoutez un tube de verre central à un bouchon pour servir de réservoir qui délivrera en continu la solution saline physiologique dans le bain de l’organe pharmacologique qui fournit la solution à la chambre du vaisseau. Placez l’ouverture du tube de verre central dans le flacon Mariotte au même niveau que le haut de la solution saline physiologique dans le bain d’organe.

Cela garantira une pression hydrostatique constante pour l’administration de la solution saline physiologique dans le bain d’organe. À l’aide d’un tube en polyéthylène relié à un tube de verre en forme de J, la solution saline physiologique de la bouteille Mariotte et la verse dans le bain d’organe. Pour la profusion lumineuse, utilisez un tube en polyéthylène pour connecter la pipette d’entrée à un réservoir de solution saline physiologique composé d’une seringue en plastique de 66 CC élevée à une position qui maintient la pression d’entrée souhaitée.

Surveillez la pression en connectant un transducteur de pression au système via un robinet d’arrêt. Ensuite, connectez la pipette de sortie à un tube en polyéthylène à un réservoir similaire au réservoir d’entrée afin de permettre à la solution saline physiologique de s’écouler à travers le récipient en réponse à un gradient de pression. Utilisez également un robinet d’arrêt et une connexion de transducteur de pression similaires pour surveiller la pression de sortie.

Retirez le cerveau d’un rat Sprague Dawley et placez-le en position couchée dans une boîte de Pétri en verre remplie d’une solution saline physiologique glacée. Ensuite, placez le plat sous un stéréoscope. Utilisez une paire de ciseaux Vannas et une pince à pointe fine numéro cinq Dumont pour exciser les artères cérébrales moyennes du cerveau.

Ensuite, nettoyez tout tissu cérébral résiduel de l’artère cérébrale moyenne à l’aide de la pince. Transférez l’artère dans la chambre du vaisseau en la tenant doucement par l’extrémité du segment excisé et placez-la soigneusement dans la chambre. Ensuite, enfilez l’artère cérébrale sur la micropipette d’entrée en la tirant vers la base de la pipette jusqu’à ce que la pointe avance dans la lumière de l’artère.

Fixez l’artère sur la pipette d’entrée en attachant une boucle préparée à partir d’une fibre monocaténaire préalablement préparée à partir de sutures 10-0 autour de l’artère. Ensuite, fixez l’extrémité opposée de l’artère cérébrale moyenne à la pipette de sortie en serrant une deuxième boucle de suture autour du vaisseau et utilisez le micromètre connecté au support de pipette d’entrée pour étirer l’artère à sa longueur in situ. Attachez toutes les branches latérales à l’aide de brins simples prélevés sur des sutures 10-0 afin de maintenir une pression constante dans l’artère.

Ensuite, installez un microscope vidéo composé d’une caméra vidéo attachée à un microscope de dissection connecté à un micromètre vidéo et à un moniteur de télévision. Utilisez cette configuration pour mesurer le diamètre interne de l’artère. Évaluez le tonus myogénique et les réponses des vaisseaux aux stimuli vasodilatateurs en vous assurant que l’artère présente un niveau approprié de tonus actif avant l’expérience.

Jetez toutes les artères manquant de tonus actif au repos, à l’exception des vaisseaux tels que les petites artères mésentériques qui ne présentent normalement pas de tonus de repos actif. Ensuite, ajoutez des concentrations croissantes d’acétylcholine dans la chambre du vaisseau et mesurez le diamètre des vaisseaux pour tester la réactivité dépendante de l’endothélium de l’artère de résistance canulée. Dans cet exemple, l’artère présente un dysfonctionnement endothélial, comme en témoigne son incapacité à se dilater en réponse à l’acétylcholine.

À la fin de l’expérience, déterminez le diamètre maximal de l’artère en ajoutant une solution saline physiologique sans calcium au perfusat et au superfusat. Utilisez cette mesure pour calculer le pourcentage de tonus au repos actif. La mise en évidence d’une dilatation maximale dans une solution saline physiologique sans calcium permet de confirmer que l’incapacité de l’artère à se dilater en réponse à l’acétylcholine était due à un dysfonctionnement endothélial et non à une incapacité de l’artère à se détendre en raison d’un remodelage structurel du vaisseau.

Cette figure illustre les réponses à l’acétylcholine, un vasodilatateur endothélium-dépendant, dans les artères cérébrales moyennes isolées de rats mâles sensibles au sel de Dahl dans les trois souches congéniques rétrécies. Cela montre que la dilatation dépendante de l’endothélium à l’acétylcholine était absente dans la souche parentale sensible au sel et dans les deux souches congéniques conservant l’allèle Renan sensible au sel. La dilatation normale a été rétablie chez la souche congénique porteuse de l’allèle brun Renan de Norvège dans le fond génétique sensible au sel, soutenant l’hypothèse selon laquelle le dysfonctionnement endothélial chez les rats SS est dû à une régulation altérée du gène Renan.

Dans cette expérience, l’échec du régime riche en sel à éliminer la dilatation dépendante de l’endothélium à l’acétylcholine chez une souche particulière de rat, les résultats concernant les contributeurs au stress oxydant vasculaire et au dysfonctionnement endothélial lors d’élévations de l’apport alimentaire en sel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à 3 heures et demie si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler l’artère isolée très soigneusement pour éviter d’endommager le muscle lisse et en particulier l’endothélium.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ajout d’agonistes vasoconstricteurs et vasodilatateurs ou d’antagonistes des récepteurs peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que les mécanismes affectant la réactivité vasculaire à différentes substances et les mécanismes d’action des médicaments sur les vaisseaux sanguins. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie vasculaire et de la physiologie microcirculatoire pour explorer les muscles lisses et la fonction endothéliale dans les artères de résistance de différents lits vasculaires d’animaux de laboratoire et d’humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser cette méthode pour évaluer les mécanismes de contrôle des muscles lisses endothéliales et vasculaires dans les artères à petite résistance de différents lits vasculaires.