Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

L’objectif général de cette procédure est de visualiser et de déterminer la fréquence des stromules à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence de cellules vivantes dans les feuilles, et de visualiser les stromules in vitro à l’aide du chloroplaste extrait des feuilles. Ces méthodes expérimentales peuvent aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire végétale et en recherche sur les chloroplastes en découvrant le fonctionnement des stromules. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles produisent des données reproductibles et robustes, même de ces structures chloroplastiques très dynamiques.

Nous avons eu l’idée de l’étude d’isolement des chloroplastes parce que certaines recherches suggéraient que la formation de stromules nécessitait la formation de structures cytosoliques, comme le cytosquelette. Nous avons donc décidé de mélanger la cellule et de voir si des stromules pouvaient encore se former. Pour préparer des échantillons de feuilles, commencez par utiliser une lame de rasoir très tranchante pour couper une petite section d’une feuille de Nicotiana benthamiana.

Immédiatement après avoir coupé la section de la feuille, plongez-la dans une seringue de cinq millilitres remplie d’eau. Ensuite, retirez l’air de la seringue et appliquez un vide à l’aide d’un doigt pour couvrir l’orifice de la seringue, avant de tirer sur le piston. Relâchez doucement le piston pour éviter d’endommager la section des feuilles.

Ensuite, répétez l’élimination de l’air deux ou trois fois, ou jusqu’à ce que l’air ait été éliminé et que la feuille semble être vert foncé. Ajoutez une goutte d’eau à une lame et placez la section de la feuille sur la goutte. Ajoutez ensuite une autre goutte d’eau sur le dessus de la feuille et ajoutez une lamelle.

S’il y a des bulles d’air, tapotez doucement la lamelle jusqu’à ce qu’elles soient retirées. Avec la lumière transmise et un objectif 20x, concentrez-vous sur un champ de vision près du centre de la section de la feuille, en visualisant plusieurs chloroplastes simultanément. Enregistrez une image avec de la lumière transmise, afin de pouvoir distinguer les types de cellules plus tard si nécessaire.

Passez ensuite à l’éclairage laser avec les filtres d’excitation et d’émission appropriés pour le fluorophore utilisé, et enregistrez une autre image. À l’aide du logiciel du microscope, sélectionnez le canal GFP et cliquez pour régler l’ouverture du sténopé sur une unité aérée. Sélectionnez le balayage laser pour commencer à visualiser l’échantillon, puis cliquez sur le canal GFP et le gain du détecteur pour minimiser la puissance laser tout en visualisant clairement les stromules.

Ensuite, préparez une expérience d’empilement Z qui collectera la série d’images à travers l’épiderme de la feuille dans le champ de vision. Ajustez la vitesse de balayage et la résolution de l’image si nécessaire pour vous assurer que la pile Z est collectée rapidement. Enregistrez ensuite la pile Z pour une analyse ultérieure.

À l’aide de l’image J, fusionnez la pile Z en une seule image en utilisant l’intensité maximale dans le logiciel. Ensuite, identifiez et comptez manuellement tous les chloroplastes de l’image. Pour chaque chloroplaste, déterminez visuellement si un ou plusieurs stromules s’étendent à partir du chloroplaste dans l’image de la pile Z fusionnée.

Pour extraire les chloroplastes intacts, préparez le tampon d’extraction à froid en utilisant les réactifs suivants. Ensuite, avec du NaOH et du HCl, ajustez le pH à 6,9 et réfrigérez avant utilisation. Préparez un tampon d’isolement et ajustez le pH à 7,6.

Si les feuilles n’expriment pas un stromofluorophore génétiquement codé, préparez une solution de diacétate de carboxyfluorescéine ou de CFDA. Pour isoler les chloroplastes, retirez environ 5 à 10 grammes de feuilles de plusieurs plantes et rincez brièvement à l’eau froide. Transférez ensuite immédiatement les feuilles dans 50 millilitres de tampon d’extraction à froid.

À l’aide d’un mélangeur avec plusieurs impulsions courtes, broyez les feuilles, puis filtrez le mélange à travers deux à trois couches d’étamine pour éliminer les débris de feuilles. Divisez le chloroplaste extrait dans deux tubes à centrifuger de 50 millilitres et centrifugez pendant une minute à 750 x g. Jetez le surnageant et utilisez 10 millimètres de tampon d’isolement pour remettre en suspension les chloroplastes verts.

Ensuite, centrifugez à nouveau pendant une minute à 750 x g, jetez le surnageant et utilisez un tampon d’isolement pour remettre les chloroplastes en suspension jusqu’à un volume final de cinq millilitres. Si les chloroplastes proviennent de plantes transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ciblées sur les plastes, transférez 20 microlitres de chloroplastes sur une lame et ajoutez une lamelle. Effectuez ensuite une microscopie.

Pour colorer les chloroplastes des plantes qui n’expriment pas de protéines fluorescentes ciblées sur les plastes, ajoutez cinq microlitres de 50 millilitres de CFDA aux cinq millilitres de chloroplastes dans le tampon d’isolement. Après avoir laissé les chloroplastes incuber pendant cinq minutes, transférez une petite aliquote sur une lame, ajoutez une lamelle et effectuez une microscopie. Enfin, utilisez un ensemble de filtres FITC ou GFP et un objectif 20x pour visualiser plusieurs chloroplastes simultanément.

Ou un objectif plus élevé pour visualiser un seul chloroplaste isolé. Une pile fusionnée montrant la fréquence des stomules GFP dans la codolédence de jeunes plantules de N. Benthamiana est présentée ici. Dans ce panneau, l’image a été désaturée et inversée de sorte que le stroma apparaît noir.

Les chloroplastes ont été étiquetés soit comme n’ayant pas de stromules, soit comme ayant au moins un stromule. Sur les 87 chloroplastes épidermiques visualisés, 33 ont des stromules, pour une fréquence de 37,9 pour cent dans cette feuille. Ce graphique représente l’analyse de plus de 23 000 chloroplastes et de plusieurs centaines de cellules d’une seule feuille de 21 plantes différentes.

La fréquence moyenne des stromules pendant la journée était de 20,8 plus ou moins 1,8 %, et la fréquence moyenne des stromules la nuit était de 12,8 plus ou moins 0,9 %, indiquant une fréquence diurne nettement plus élevée, telle que déterminée par le test T de Welch. Dans cette figure, des stromules chloroplastiques ont été observés in vitro après isolement de N. benthamiana exprimant une GFP ciblée sur les plastes, ou après utilisation de CFDA pour colorer les chloroplastes de N. benthamiana, ou Spinachia oleracea. Lors de l’imagerie de cellules vivantes de stromules, il est important de travailler rapidement et de manipuler le moins possible les tissus végétaux.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le silençage génique ou les traitements chimiques peuvent être utilisées pour découvrir d’autres acteurs moléculaires ou voies impliquées dans la formation et la fonction des stromules. Cette technique a été utilisée par des chercheurs en biologie cellulaire végétale et en immunité végétale pour étudier le rôle des stromules dans les voies de signalisation cellulaire et les réponses des plantes aux agents pathogènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de calculer la fréquence des stromules dans une feuille et de la façon d’observer les stromules dans les chloroplastes extraits.

Et n’oubliez pas que les lasers et la tension électrique alimentant un microscope confocal électronique à balayage peuvent être extrêmement dangereux, et qu’il est important de comprendre les exigences du système pour l’utilisation de cet équipement.