Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

El objetivo general de este protocolo es formular tecnologías que permitan la transducción exitosa de genes en células asesinas naturales primarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunoterapia, como el efecto de la modificación genética en los linfocitos efectores, como las células asesinas naturales o NK. La principal ventaja de esta técnica es la expresión eficiente de un gen de interés en células NK primarias de ratón o humanas.

Después de preparar y valorar los vectores lentivirales de acuerdo con el protocolo de texto, purificando las células NK primarias murinas pasando suspensiones de bazo unicelular a través de columnas de lana de nailon para agotar las poblaciones adherentes que consisten en células B y macrófagos. Utilice 1.000 unidades por mililitro de interleucina-2 en RPMI1640 medio completo para cultivar la población no adherente que contiene células NK. En el cuarto día de cultivo, reemplace el medio con 20 mililitros de RPMI1640 medio completo y 1.000 unidades por mililitro de IL-2 para eliminar las células T y NKT no adherentes.

En el séptimo día, utilice marcadores específicos de células MK para comprobar la pureza de las células NK murinas mediante citometría de flujo utilizando preparaciones con una población negativa para CD3 superior al 95% y NK1.1 positiva. Para aislar las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, coloque cuidadosamente 35 mililitros de células medio diluidas en un gradiente de densidad de 15 mililitros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el gradiente en un rotor de cubo oscilante a 400 veces G y 20 grados Celsius durante 30 minutos sin interrupción.

Después de purificar las células NK primarias humanas de acuerdo con el protocolo de texto, determine la pureza de las células agregando dos microgramos por mililitro de anticuerpos anti-CD3 y dos microgramos por mililitro de anticuerpos anti-CD56. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Use PBS para lavar las celdas dos veces.

A continuación, analice las células mediante citometría de flujo. La población de células NK será positiva para CD56 en la superficie de la célula y negativa para CD3. Suspender células NK primarias de ratón o humanos en los pocillos de una placa de 24 pocillos a 0,5 veces al 5 por mililitro de medio con sobrenadante GFP Lentivirus, a un NLY de cinco, 10 y 20.

Luego, en presencia de polibreno, sulfato de protamina o dextrano, centrifugar las placas a 1.000 veces G durante 60 minutos. Luego, sin decantar el sobrenadante, cultive las células en una incubadora a 37 grados centígrados infundida con 5,2% de dióxido de carbono durante la noche.

Después de lavar las células con 10 mililitros de PBS, use dos mililitros de medio RPMI1640 con IL-2 para volver a suspender las células. El día antes de recolectar las células, cubra placas de poliestireno altamente absorbentes de proteínas de 96 pocillos con 2,5 microgramos por mililitro de anticuerpos monoclonales anti-MKG2D. e incubar las placas a temperatura ambiente o en la nevera durante la noche.

Al día siguiente, use 100 microlitros de PBS para lavar cada pocillo tres veces. Recoja las células NK transducidas golpeando primero suavemente las placas, luego agregue 100 microlitros de las células a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. De 16 a 18 horas después de la activación, utilice una pipeta multicanal para recoger los sobrenadantes.

A continuación, utilizando la citocina recombinante de un kit ELISA, genere una curva estándar y cuantifique las citocinas, como el interferón gamma en el sobrenadante. Para probar la viabilidad de la célula NK, cuatro días después de la transducción, lavar las células con 10 mililitros de PBS frío dos veces. A continuación, recolecta las células y utiliza una XM5 7-aminoactinomicina D para teñirlas.

Utilice la citometría de flujo para determinar el porcentaje de células necróticas entre las células NK transformadas y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Esta figura muestra que las células NK humanas incubadas con IL-2 recombinante y luego transducidas con lentivirus GFP lograron una mayor eficiencia de transducción y aumentaron el título viral cuando se agregó dextrano al cultivo, en comparación con la adición de polibreno o sulfato de protamina. Como se ha visto aquí, se demostraron resultados similares en células NK murinas, donde el dextrano aumentó la eficiencia de los vectores lentivirales, en comparación con el polibreno o el sulfato de protamina.

En este experimento, se examinó la capacidad citotóxica de las células NK primarias transducidas mediante un ensayo de liberación de CR frente a K562 y YAC-1 como células diana. La transducción de células NK por dextrano no altera negativamente el potencial de muerte de las células NK transformadas en comparación con las células NK no transducidas. Aquí, las células NK primarias humanas transducidas se cocultivaron con K562 durante 24 horas, y los sobrenadantes se recolectaron para medir el interferón gamma.

Los resultados indican que el dextrano no tiene ningún impacto en la capacidad de las células NK transducidas para producir citocinas. Además, una validación independiente mostró que las células NK tratadas con dextrano activadas con anticuerpos monoclonales anti-NKG2DA10 unidos a placas aún podían producir la citocina interferón gamma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar hacer girar las células transducidas.

Siguiendo este procedimiento, otros métodos, como la transfección, pueden ser profundos para responder preguntas adicionales, como cómo mejorar la entrega de genes. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en el campo de la Inmunología, para explorar la manipulación génica en células NK. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transducir células NK.