Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.

El objetivo general de este procedimiento es reducir la expresión génica diana en la EDC mediante la transfección de ARN SI. Esto se logra programando primero el efector AM Maxin Nucleo. El segundo paso del procedimiento es mezclar DCS y siRNA y pipetear la solución celular resultante en módulos Nucleo QVE.

El tercer paso del procedimiento es colocar la placa en la bandeja de lanzadera amaxa para comenzar el proceso de transfección. El paso final del procedimiento es infectar las células con el virus para activar la respuesta al interferón. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la eliminación de genes a través de R-T-P-C-R cuantitativo y Western blot.

Esta técnica es valiosa para caracterizar las vías de señalización en las células dendréticas y puede contribuir al desarrollo de terapias inmunitarias basadas en células dendréticas. Para programar el factor de núcleo de la lanzadera de pocillos Maxon 96 para la transfección de CC, abra un nuevo archivo de parámetros. Seleccione el número de pocillos que utilizará para la transfección estándar arrastrando el cursor sobre el diagrama de placa de 96 pocillos.

Utilice un mínimo de tres pozos para agrupar cada muestra experimental. Ahora ingrese el código de programa en la primera parte, seleccione F, F e i parte dos, seleccione 1 68 en los menús desplegables. Luego, en el cuadro de solución, seleccione monocito humano siguiente en la opción de control seleccionar estándar y luego haga clic en aplicar.

Para incluir un control de no transfección, se requiere seleccionar pozos adicionales del diagrama. Luego, desde la opción de control, elija sin control de programa y haga clic en aplicar nuevamente. Después de mezclar la solución de afección del núcleo, deje que se caliente a temperatura ambiente.

Coloque el número de módulos nucleo vete necesarios en la placa nucleo VETE en la orientación correcta como se muestra aquí insertando el primero en rose one y two y luego así sucesivamente para todos los tubos siguientes. Transfiera suficiente EDC de un matraz de cultivo celular a un tubo de 50 mililitros para tener 500.000 células por pocillo para la transfección, centrifugar las células durante 10 minutos a 400 G a cuatro grados Celsius y luego retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, agregue una solución de afección nuclear al tubo y luego vuelva a suspender la EDC pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Ahora etiquete los tubos de DPH de acuerdo con el tratamiento específico que se va a realizar, y luego divida las células resuspendidas en los tubos marcados. Añada ARN SI a una concentración final de 0,25 microgramos por 500.000 células a los tubos epi endorf apropiados y, a continuación, mezcle las suspensiones celulares mediante pipeteo. Utilice ARN SI no objetivo para la muestra de control sin transfección.

A continuación, pipetee 20 microlitros de la suspensión celular SI RA DC en los módulos de nucleo vete según el diseño experimental previamente programado, asegurándose de que el líquido se entregue al fondo del pocillo, cubra la placa de nucleo vete con una tapa y golpee la placa sobre una superficie dura varias veces para facilitar la eliminación de las burbujas de aire para transfectar los dcs. Inserte la placa Yvette del núcleo preparado en la bandeja de lanzadera del efector del núcleo 96 pozos. A continuación, haga clic en el botón de carga e inicio.

Siga el progreso del proceso de transfección en la pantalla. Una cruz negra sobre un fondo verde significa una transfección exitosa en ese pozo, mientras que una barra negra sobre un fondo rojo significa que no se realizó correctamente mientras se transfectan las celdas. Precaliente el medio de crecimiento de CC al finalizar el proceso de transfección, retire la placa y agregue 80 microlitros del medio de crecimiento de CC precalentado a cada pocillo.

Con una pipeta multicanal, incube la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Durante el período de incubación, agregue 100 microlitros del medio de crecimiento de CC precalentado a los tubos de la matriz en la misma orientación que la placa de cubeta del núcleo. Después del período de incubación, transfiera los 100 microlitros de las suspensiones celulares de los núcleos CVE a los tubos de matriz preestablecidos.

A continuación, retire y deseche los tubos en los que no se haya producido la transfección. Finalmente, incube los tubos de la matriz durante 24 horas u otro intervalo de tiempo deseado. Etiquete los tubos de einor para cada uno de los tubos de la matriz de incubación.

A continuación, transfiera los tubos de la matriz de la incubadora a una campana de cultivo celular y agrupe los tubos de la matriz para cada muestra experimental en el eend dfs preetiquetado. A continuación, granule las células suavemente haciendo girar los tubos de DPH eend en una centrífuga de escritorio durante 10 minutos. A 400 G, retire el snat y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento libre de suero que contenga el virus de la enfermedad de Newcastle o el NDV a un MOI de uno sin apretar.

Cubrir las epiendorfinas de forma estéril y luego incubar los tubos durante 45 minutos. Después de este período de incubación, agregue 900 microlitros de medio de crecimiento DC y vuelva a incubar los tubos durante otras ocho a 10 horas. Para cosechar los dcs transfectados e infectados.

Granular las células haciendo girar los tubos de einor en una centrífuga de sobremesa como antes y eliminar los dcs de monocitos snat se transfectaron con IRNA dirigido a RIG I o irna glow inespecífico e infectados con NDV como se indica con un signo más o permanecieron no infectados como se indica con un signo menos como se detectó por la reducción cuantitativa de R-T-P-C-R-A de R RGA en un 75%A nivel de transcripción se observó una reducción similar en la expresión de interferón beta. También se observó un efector aguas abajo de RGA en la cascada de señalización del interferón. Además, no se detectó la expresión de interferón beta en células de control transfectadas no infectadas.

Mientras que la del gen de respuesta descendente de MXA e interferón beta fue mínima. Aquí. En este experimento se muestran los datos de una segunda transfección de EDC con rigi dirigido a irna realizada como en la figura anterior. Sin embargo, todas las células están infectadas con NDV y se incorporó un control adicional con DCS de monocitos no resecados.

Los resultados de silenciamiento génico fueron similares a los observados en la figura anterior. Un Western blot sondeado para RGA reveló que la expresión proteica de este gen había sido completamente bloqueada. Los carriles uno y dos muestran datos de lisados de células no resecadas.

Los carriles tres y cuatro muestran lisados de células transfectadas con irna brillante y los carriles cinco y seis muestran lisados de células transfectadas con RIG I dirigido a S Irna Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora, incluyendo la eliminación de muchos genes simultáneamente.