Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l'infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.

Les objectifs de ce protocole sont de décrire les étapes de reconstruction de la morphologie des neurones marqués par le virus et d’effectuer des analyses de grappes indépendantes et impartiales sur des populations de neurones marqués afin de permettre une caractérisation complète des paramètres morphologiques le long de sous-classes neuronales distinctes. Nous décrivons une nouvelle approche pour la collecte et l’analyse des données neuroanatomiques afin de faciliter un échantillonnage plus complet et une classification impartiale des types neuronaux morphologiquement uniques au sein d’une population neuronale sélective. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse à grande échelle de la morphologie neuronale et utilise des méthodes impartiales pour classer des sous-classes neuronales distinctes.

Les aspects les plus difficiles des reconstructions morphologiques sont la sélection de neurones bien isolés à reconstruire, l’attribution de la profondeur z appropriée et l’alignement des arbres pour poursuivre les reconstructions sur des sections de tissus adjacents. Commencez une reconstruction en sélectionnant une lame portant une coupe de tissu cérébral coloré de 50 microns provenant d’un primate injecté stéréotaxiquement avec le virus de la rage modifié exprimant l’EGFP. Placez la lame dans le support de lame de microscope et faites la mise au point sur une seule section d’intérêt à l’aide d’un objectif à faible grossissement.

Assurez-vous que l’image de l’appareil photo est visible dans l’image en direct en positionnant correctement l’obturateur de l’appareil photo. Choisissez un neurone marqué raisonnablement isolé dans la structure cérébrale d’intérêt pour permettre une reconstruction sans ambiguïté de l’arborisation dendritique. Passez au grossissement 10x et faites la mise au point sur la zone.

Choisissez de préférence les neurones si le corps cellulaire est entièrement dans une seule section pour estimer avec précision sa surface et sa rondeur. Une fois qu’un neurone bien coloré et bien isolé est choisi, cliquez sur le bouton nouvelle section dans le logiciel pour ajouter la section d’accueil contenant le corps de la cellule au gestionnaire de sections. Entrez le nombre de sections à inclure dans la reconstruction.

Il est recommandé d’insérer deux à trois sections pour commencer. Attribuez une épaisseur de section de 50 microns. Choisissez l’objectif deux x, puis cliquez sur le bouton de contour dans la barre d’outils supérieure et choisissez le type de contour dans le menu déroulant.

Tracez le contour de la structure cible en utilisant la souris pour cliquer sur des points le long du contour. Lorsque vous avez terminé de tracer le contour, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Fermer le contour dans le menu pour fermer le contour. Ensuite, avec la vue toujours à deux x, cliquez sur le symbole de marqueur souhaité dans la barre d’outils de gauche.

Cliquez ensuite sur le centre de la structure cible pour placer le marqueur. Une fois les contours terminés, sélectionnez l’objectif 40x ou 60x pour tracer le contour du corps cellulaire. Sélectionnez ensuite le bouton de traçage des neurones dans la barre d’outils supérieure et sélectionnez la structure neuronale à tracer, dans ce cas, le corps de la cellule, dans le menu déroulant.

Tracez le corps de la cellule en cliquant sur les points autour de la plus grande étendue du corps de la cellule, en ajustant la profondeur z si nécessaire pour mettre l’accent sur le corps de la cellule. Et faites un clic droit sur la souris pour terminer le contour du corps de la cellule. Ensuite, placez un marqueur de style différent au centre du contour du corps de la cellule, en vous assurant que le marqueur est à peu près au centre en profondeur z.

Il est essentiel d’établir la profondeur z correcte dans la section d’origine, ainsi que dans les sections adjacentes, avant de commencer chaque traçage afin que les valeurs de l’axe z soient précises. Pour commencer à tracer les arbres dendritiques, sélectionnez dendrite dans le menu déroulant supérieur.

Tracez ensuite chaque dendrite en commençant par le corps cellulaire. Lorsqu’une dendrite se ramifie, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Nœud de bifurcation ou Nœud de trifurcation pour placer un nœud à ce point de branche. Assurez-vous d’ajuster la profondeur z tout au long du traçage pour capturer avec précision l’angle et la direction de la dendrite.

À la fin de la dendrite de cette section, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Fin dans le menu déroulant. Lorsque tous les arbres dendritiques sont tracés dans la section d’origine, identifiez les terminaisons dendritiques qui se poursuivront probablement dans la section adjacente. Et faites-les ressortir à la profondeur z appropriée dans l’image du microscope à 20x.

Incluez les principaux points de repère à proximité, tels que les vaisseaux sanguins ou les motifs ou faisceaux de dendrites facilement reconnaissables dans l’image du microscope. Ensuite, prenez une photo de l’image en direct à l’aide d’un appareil photo numérique tenu à main levée sur l’écran de l’ordinateur. Basculez ensuite l’objectif du microscope sur deux x et passez à la section adjacente sur la lame.

Alignez ensuite les contours de la section précédemment tracée dans la vue logicielle avec les limites du LGN et du TRN dans la nouvelle section. Revenez à 20x et alignez-vous à l’aide de points de repère. Ensuite, à l’aide de la photo des terminaisons des dendrites de la section précédemment tracée, déplacez le tracé pour aligner les dendrites en utilisant d’abord l’outil flèche pour sélectionner la reconstruction.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Déplacer dans le menu déroulant et déplacez le tracé en conséquence. Pour faire pivoter le traçage, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Rotation dans le menu déroulant et faites pivoter le traçage en conséquence. Vous pouvez également sélectionner l’outil de correspondance dans la liste déroulante des outils supérieurs et sélectionner le nombre de points à associer.

Cliquez ensuite sur la fin de la reconstruction et le point de continuation correspondant dans l’image en direct pour faire correspondre les terminaisons dendritiques aux débuts. Une fois que le tracé de la section précédente est aligné avec les dendrites de la nouvelle section, ajoutez une nouvelle section au gestionnaire de sections comme précédemment. Vous pouvez également sélectionner la section adjacente créée précédemment et ajuster la profondeur z de la même manière.

Assurez-vous que la nouvelle section correspondante est sélectionnée dans le gestionnaire de sections en cliquant sur la section actuelle. Ensuite, après avoir augmenté le grossissement à 40x ou 60x, sélectionnez la dendrite à l’aide de la flèche. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’extrémité de la dendrite de la section précédente et sélectionnez Ajouter à la fin dans le menu déroulant.

Une invite vous demandera si la suite se trouve dans une nouvelle section. Cliquez sur oui. Tracez ensuite la continuation de la dendrite à l’aide de la souris comme outil de dessin.

Prenez des images des fins en vue de l’alignement sur la section suivante. Ajoutez ensuite des continuations aux tracés dendritiques jusqu’à ce qu’au moins trois sections soient tracées pour le neurone ou jusqu’à ce que les dendrites ne puissent plus être suivies ou trouvées. À l’aide d’un programme d’extraction associé au système de reconstruction neuronale, ouvrez un fichier de reconstruction terminé.

Dans le menu déroulant Modifier, sélectionnez Sélectionner tous les objets. Sélectionnez Analyse de la structure des branches dans la barre d’outils d’analyse supérieure, puis cliquez sur chaque onglet et sélectionnez les options d’analyse souhaitées dans chaque onglet. Extrayez toutes les données souhaitées en cliquant sur le bouton OK dans la fenêtre d’analyse et enregistrez-les dans un format de feuille de calcul en cliquant avec le bouton droit de la souris sur les fenêtres de sortie et en sélectionnant Exporter vers Excel pour une analyse plus approfondie.

Cette photographie montre une seule coupe coronale à travers le LGN dorsal d’un animal. La coloration à la cytochrome oxydase est utilisée pour visualiser les couches de LGN. Et la coloration GFP marque le site d’injection du virus.

La flèche indique les régions de neurones réticulaires thalamiques denses, étiquetés rétrogradement. L’orientation de la section est basée sur la boussole dorsale, ventrale, médiale latérale illustrée. La barre d’échelle est illustrée dans le coin inférieur gauche.

Cette image montre les contours du LGN en rouge et du TRN en marron pour toutes les sections contenant l’injection du virus, comme l’indiquent les contours noirs. Les étoiles jaunes indiquent les centres des sites d’injection. Cette image montre le rendu 3D des contours et du site d’injection.

Il s’agit d’une carte des emplacements des neurones TRN reconstruits, codés en couleur selon l’affectation des clusters, au sein d’un seul contour TRN agrégé montré en marron. La barre d’échelle représente 500 microns. Cette image montre les contours agrégés du TRN en noir et du LGN en gris avec cinq neurones TRN reconstruits de couleur chaude à froide en fonction de leur position latérale médiale au sein du TRN.

La barre d’échelle représente 500 microns. Ces photographies montrent le détail des cinq mêmes neurones TRN avec des barres d’échelle de couleur assortie représentant 100 microns. Cet arbre de dendrogramme hiérarchique illustre les distances de liaison entre 160 neurones TRN reconstruits sur la base de 10 métriques morphologiques indépendantes et montre les résultats globaux de l’analyse de cluster.

Trois groupes distincts de neurones TRN sont illustrés en bleu, vert et rouge. Une fois ces techniques de reconstruction neuronale maîtrisées, un seul neurone peut être complètement reconstruit en une à deux heures. Il est important de surveiller et d’ajuster constamment la profondeur z tout en reconstruisant les neurones.

Le protocole décrit ici est une amélioration par rapport aux méthodes d’analyse neuroanatomique traditionnelles, plus biaisées, et permet aux chercheurs d’explorer de nouvelles sous-classes de neurones basées sur des données morphologiques à grande échelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reconstruire les neurones à travers des sections de tissus adjacents et d’extraire des données morphologiques pour une analyse plus approfondie.