Name: Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Découvrez la reconstruction morphologique de neurones marqués par virus rabique modifié pour la neuroanatomie. Cette méthode utilise des analyses de regroupement impartiales pour classifier précisément les sous-classes neuronales distinctes.

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Nous tenons à remercier les Drs. Ed Callaway et Marty Usrey pour nous permettre d&#39;utiliser le tissu préparé comme une partie d&#39;une étude préalable et Libby Fairless et Shiyuan Liu pour l&#39;aide avec reconstructions neuronales. Ce travail a été financé par le NIH (NEI: EY018683) et la Fondation Whitehall.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
<li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
<li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li>
<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les études neuroanatomiques sont restés un pilier des neurosciences et de l&#39;intérêt récent pour connectomique et relations structure-fonction a renouvelé l&#39;enthousiasme pour la caractérisation morphologique des populations neuronales sélectives. Traditionnellement, les études neuroanatomiques se sont appuyés sur les classifications qualitatives des neurones dans des classes morphologiquement distinctes de neurones définis par neuroanatomistes experts. Avec les progrès dans les techniques de reconstruction des ne...

Neuroanatomy est l&#39; un des fondements de la neuroscience 1 et de l&#39; intérêt récent &quot;connectomique&quot; a renouvelé l&#39; enthousiasme pour la compréhension de la diversité morphologique des populations neuronales et les connexions entre les neurones spécifiques 2. Des procédés de marquage et les neurones reconstruisant ont grandement amélioré avec des innovations récentes, y compris circuit traçage génétique et virus médiée par des approches 3, 4, ce qui permet des enquêtes morphologiques plus complètes des populations neuronales 5. En plus des améliorations dans l&#39; étiquetage des neurones individuels, les techniques d&#39;analyse de données quantitatives sont également apparues qui permettent la classification indépendante et impartiale des neurones en sous - populations distinctes fondées sur des données morphologiques 5, 6. Ces techniques impartiales sont une amélioration sur plus traditional méthodes de classification qualitatives qui ont été la norme dans le domaine depuis plus d&#39;un siècle. Le but de cette étude est de décrire, étape par étape, la combinaison de l&#39;étiquetage des virus médiée par des neurones au sein d&#39;une population sélective, reconstructions à grande échelle d&#39;un échantillon global de ces neurones, et l&#39;analyse quantitative de données basée sur le regroupement indépendant avec évaluation statistique. En combinant ces méthodes, nous présentons une nouvelle approche vers la collecte et l&#39;analyse des données neuroanatomiques pour faciliter l&#39;échantillonnage complet et classification objective des types de neurones morphologiquement uniques au sein d&#39;une population neuronale sélective. A titre d&#39;exemple de ces méthodes, nous décrivons l&#39;analyse d&#39;une large population de neurones dans un seul secteur du noyau thalamique réticulaire (TRN) du macaque. Ces données proviennent d&#39;une étude préalable 7. Méthodes d&#39;étiquetage sélectivement les neurones TRN en saillie à l&#39;latera dorsalel genouillée noyau du thalamus (dLGN) par injection chirurgicale du virus de la rage modifié codant EGFP 4, 8 (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 2) sont décrites. Ce virus de la rage modifié est dépourvu du gène codant pour une protéine d&#39;enveloppe essentielle, ce qui élimine le mouvement trans-synaptique du virus. Une fois que le virus pénètre dans les terminaisons axonales au site d&#39;injection, il agit comme un traceur rétrograde traditionnel avec l&#39;avantage important de conduire l&#39; expression EGFP dans toute la arborisation dendritique complète des neurones infectés 5, 9, 10. En conséquence, ce virus de la rage G deletion peut être utilisée pour infecter et marquer une population neuronale après l&#39;injection et le transport rétrograde de manière sélective. Afin d&#39;effectuer une analyse complète d&#39;une population neuronale spécifique, il est important d&#39;échantillonnerune large distribution des neurones au sein de la population. Étant donné que la technique de marquage à médiation virale produit intracellulaire complet, remplit de nombreux neurones avec des axones au niveau du site d&#39;injection de virus &quot;Golgi-like», il est possible de reconstruire un grand échantillon de neurones au sein de l&#39;étendue de la structure du cerveau. En outre, parce que le virus de la rage est modifiée de manière efficace à infecter et à étiqueter un grand nombre de neurones, il est possible de reconstruire des centaines de neurones par animal. Les procédures d&#39;échantillonnage de 160 neurones dans tout le secteur visuel de la TRN 11 afin de générer un échantillon complet de neurones se projetant dLGN-TRN sont décrits. Le processus de reconstruction des neurones individuels à l&#39;aide d&#39;un système de reconstruction de neurones comprenant un microscope, une caméra, et un logiciel de reconstruction est décrit. On décrit également des méthodes pour déterminer les positions des neurones individuels au sein d&#39;une structure du cerveau (dans ce cas au sein de la TRN) et de vérifier le virus sit d&#39;injectionle volume de courrier et un emplacement à l&#39;intérieur d&#39;une structure (dans ce cas dans le dLGN) en utilisant des reconstructions de contour volumétrique. Étapes à suivre pour exporter des données morphologiques et effectuer grappe indépendante analyses fondées sur des paramètres morphologiques mesurés pour chaque neurone sont décrites. Il y a des limites aux méthodes de classification et il y a aussi une variété de différents algorithmes de clustering disponibles. En conséquence, ces options et les avantages de certains des algorithmes les plus couramment utilisés sont décrits. L&#39;analyse de cluster ne fournit pas la vérification statistique de l&#39;unicité de clusters. Par conséquent, des étapes supplémentaires sont décrites afin de vérifier le regroupement optimal, ainsi que les relations entre les données morphologiques au sein et entre les clusters. Méthodes statistiques pour évaluer les clusters pour l&#39;ensemble de données TRN pour confirmer que les neurones TRN sont regroupés en trois groupes uniques basé sur 10 paramètres morphologiques indépendants sont décrits. Ainsi, en décrivant les étapes pour l&#39;étiquetage sélective, La reconstruction et l&#39;analyse des données morphologiques d&#39;une population neuronale spécifique, nous décrivons des procédés permettant de quantifier des différences morphologiques entre les neurones au sein d&#39;une population. les résultats antérieurs des types neuronaux distincts au sein du secteur visuel du singe macaque TRN sont confirmées avec des méthodes d&#39;évaluation statistiques distinctes. Ensemble, nous espérons que ces techniques seront largement applicables aux ensembles de données neuroanatomiques et aider à établir la classification quantitative de la diversité des populations neuronales dans le cerveau.

<table><tbody><tr><td>SAD&Delta ; G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td><td></td><td>Préparé par le Dr F. Osakada. Virus de la rage G-deleted disponible via l’Institut Salk Noyau</td></tr><tr><td>viral Électrode d’enregistrement : platine/iridium ou tungstène</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visitez le site Web (www.fh-co.com) pour les spécifications de commande alternatives</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternatives : picospritzer, seringue Hamilton</td></tr><tr><td>Microtome de congélation</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-diaminobenzidine tétrachlorhydrate, comprimé, 10 mg de substrat par comprimé. Attention : cancérogène - doit être blanchi avant d’être jeté</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp ;</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Chèvre biotinylée anti-lapin</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Neurolucida System&nbsp ;</td><td>Logiciel MicroBrightField</td><td></td><td>pour le traçage et l’analyse des neurones. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer Logiciel d’exportation de</td><td>données</td><td>MicroBrightField</td><td></td></tr><tr><td>Microfire Camera&nbsp ;</td><td>Appareil photo de microscope couleur Optronics de 2 mégapixels</td><td></td><td></td>. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</tr><tr><td>Microscope Nikon E800</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Microscope de recherche biologique. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.</td><td></td><td>Logiciel de mathématiques computationnelles basé sur la matrice. http://www.mathworks.com</td></tr><tr>Microsoft<td>Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Tableur</td></tr></tbody></table>

reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale clustering basé sur metrics morphologiques à classifier neurones dans les populations sélectives

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle de neurones associés à l&#39;utilisation de regroupement indépendant et impartial des analyses pour créer une enquête exhaustive sur les caractéristiques morphologiques observées chez une population neuronale sélective. La combinaison de ces techniques constitue une nouvelle approche pour la collecte et l&#39;analyse des données neuroanatomiques. Ensemble, ces techniques permettent à grande échelle, et donc plus complète, l&#39;échantillonnage des populations neuronales sélectives et d&#39;établir des méthodes quantitatives impartiales pour décrire les classes de neurones morphologiquement uniques au sein d&#39;une population. Le protocole décrit l&#39;utilisation du virus de la rage modifié pour marquer sélectivement les neurones. G supprimé les actes du virus de la rage, comme un traceur rétrograde après l&#39;injection stéréotaxique dans une structure cible du cerveau d&#39;intérêt et sert de véhicule pour la délivrance et l&#39;expression de l&#39;EGFP dans les neurones. Un grand nombre de neurones sont infectés en utilisant cestechnique et d&#39;exprimer la GFP à travers leurs dendrites, produisant &quot;Golgi-like&quot; remplissages complets de neurones individuels. En conséquence, le procédé de traçage rétrograde à médiation virale améliore les techniques de traçage rétrograde à base de colorants traditionnels par la production intracellulaire remplissages complets. Individuels neurones bien isolées couvrant toutes les régions de la zone du cerveau à l&#39;étude sont sélectionnés pour la reconstruction afin d&#39;obtenir un échantillon représentatif des neurones. Le protocole décrit les procédures de reconstruction des corps cellulaires et de compléter les modèles arborisation dendritique des neurones marqués couvrant des sections de tissus multiples. Les données morphologiques, y compris les positions de chaque neurone dans la structure du cerveau, sont extraites pour analyse ultérieure. fonctions de programmation standard ont été utilisées pour effectuer des analyses et des grappes indépendantes évaluations groupées basées sur des mesures morphologiques. Pour vérifier l&#39;utilité de ces analyses, l&#39;évaluation statistique d&#39;un perfo d&#39;analyse de clusterrmée sur 160 neurones reconstruits dans le noyau réticulaire thalamique du thalamus (TRN) du singe macaque a été faite. Tant l&#39;analyse de cluster d&#39;origine et les évaluations statistiques réalisées ici indiquent que les neurones TRN sont séparés en trois sous-populations, chacune avec ses caractéristiques morphologiques uniques.

Nous avons montré précédemment que les reconstructions à grande échelle des neurones au sein d&#39; une population sélective est réalisable par injection subséquente de virus de la rage modifié dans le dLGN 5. Récemment, le même tissu a été utilisé pour reconstruire 160 neurones dans le secteur visuel de la TRN (Bragg et al dans la revue;. La Figure 2A-B) suivant les étapes méthodologiques détaillées décrites ci - dessus. Dans l&#39;étude de ...

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l&#39;infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.

Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Les objectifs de ce protocole sont de décrire les étapes permettant de reconstruire la morphologie des neurones marqués par un virus et de réaliser des analyses de regroupement indépendantes et impartiales sur des populations de neurones marqués, afin de permettre une caractérisation complète des paramètres morphologiques au sein de sous-classes neuronales distinctes. Nous présentons une approche novatrice pour recueillir et analyser des données neuroanatomiques, facilitant un échantillonnage plus exhaustif et une classification impartiale de types neuronaux morphologiquement distincts au sein d'une population neuronale sélective. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre une analyse à grande échelle de la morphologie neuronale et à utiliser des méthodes non biaisées pour classifier des sous-classes neuronales distinctes.Les aspects les plus difficiles des reconstructions morphologiques consistent à sélectionner des neurones bien isolés à reconstruire, à attribuer la bonne profondeur en z et à aligner les arborisations afin de poursuivre les reconstructions à travers des sections de tissu adjacentes. Commencez une reconstruction en choisissant une lame portant une section de tissu cérébral de 50 microns colorée, provenant d'un primate injecté stéréotaxiquement avec un virus de la rage modifié exprimant EGFP. Placez la lame dans le porte-lame du microscope et focalisez sur une section d'intérêt unique à l'aide d'un objectif de faible grossissement.Veillez à ce que l'image de la caméra soit visible dans l'image en direct en positionnant correctement l'obturateur de la caméra. Choisissez un neurone marqué raisonnablement isolé au sein de la structure cérébrale d'intérêt afin de permettre une reconstruction sans ambiguïté de l'arborisation dendritique. Passez à un grossissement de 10x et mettez la zone au point.Privilégiez les neurones dont le corps cellulaire se trouve entièrement dans une seule section afin d'estimer précisément sa surface et son arrondi. Une fois qu'un neurone bien coloré et bien isolé a été choisi, cliquez sur le bouton « nouvelle section » dans le logiciel pour ajouter la section d'origine contenant le corps cellulaire au gestionnaire de sections. Saisissez le nombre de sections à inclure dans la reconstruction.Il est recommandé d'insérer deux à trois sections pour commencer. Attribuez une épaisseur de section de 50 microns. Sélectionnez l'objectif 2 x, puis cliquez sur le bouton de contour dans la barre d'outils supérieure et choisissez le type de contour dans le menu déroulant.Tracer le contour de la structure cible en utilisant la souris pour cliquer sur des points le long du contour. Une fois le tracé du contour terminé, cliquer avec le bouton droit de la souris et sélectionner « fermer le contour » dans le menu pour refermer le contour. Ensuite, avec la vue toujours à deux x, cliquer sur le symbole de marqueur souhaité dans la barre d'outils située à gauche.Ensuite, cliquez au centre de la structure cible pour placer le marqueur. Une fois les contours terminés, sélectionnez l'objectif 40x ou 60x pour tracer le contour du corps cellulaire. Puis, sélectionnez le bouton de traçage du neurone dans la barre d'outils supérieure et choisissez la structure du neurone à tracer, dans ce cas le corps cellulaire, dans le menu déroulant.Tracer le corps cellulaire en cliquant sur des points autour de l'extension maximale du corps cellulaire, en ajustant la profondeur en z selon les besoins pour mettre le corps cellulaire au point. Puis faire un clic droit de la souris pour terminer le contour du corps cellulaire. Ensuite, placer un marqueur d'un style différent au centre du contour du corps cellulaire, en veillant à ce que le marqueur soit approximativement au centre en profondeur en z.Il est essentiel de définir la profondeur z correcte dans la section initiale, ainsi que dans les sections adjacentes, avant de commencer chaque traçage, afin que les valeurs de l'axe z soient précises. Pour commencer le traçage des arbres dendritiques, sélectionnez « dendrite » dans le menu déroulant supérieur.Ensuite, tracez chaque dendrite en partant du corps cellulaire. Lorsqu'une dendrite se divise, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez nœud bifurqué ou nœud trifurqué pour placer un nœud à ce point de branchement. Veillez à ajuster la profondeur en z tout au long du tracé afin de capturer précisément l'angle et la direction de la dendrite.À l'extrémité du dendrite dans cette section, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez « ending » dans le menu déroulant. Lorsque tous les arbres dendritiques ont été tracés dans la section d'origine, identifiez les extrémités dendritiques qui devraient probablement se prolonger dans la section adjacente. Mettez ensuite ces structures au point à la profondeur z appropriée sur l'image microscopique en 20x.Inclure des points de repère majeurs à proximité, tels que des vaisseaux sanguins ou des motifs ou faisceaux de dendrites facilement reconnaissables sur l'image au microscope. Ensuite, prendre une photo de l'image en direct à l'aide d'un appareil photo numérique tenu à la main devant l'écran de l'ordinateur. Puis changer l'objectif du microscope pour un grossissement de deux x et passer à la section adjacente sur la lame.Ensuite, alignez les contours de la section précédemment tracée dans la vue logicielle avec les limites du GLN et du NRT dans la nouvelle section. Revenez à un grossissement de 20x et effectuez l'alignement à l'aide de repères anatomiques. Puis, à l'aide de la photo des terminaisons dendritiques provenant de la section précédemment tracée, déplacez le tracé afin d'aligner les dendrites, en commençant par utiliser l'outil fléché pour sélectionner la reconstruction.Ensuite, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez déplacer dans le menu déroulant, puis déplacez le calque en conséquence. Pour faire pivoter le calque, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez faire pivoter dans le menu déroulant, puis faites pivoter le calque en conséquence. Sinon, sélectionnez l'outil d'ajustement dans le menu déroulant des outils situés en haut et choisissez le nombre de points à ajuster.Ensuite, cliquez sur l'extrémité dans la reconstruction et sur le point de poursuite correspondant dans l'image en direct pour associer les extrémités dendritiques à leurs débuts. Une fois que le tracé de la section précédente est aligné avec les dendrites de la nouvelle section, ajoutez une nouvelle section au gestionnaire de sections comme précédemment. Sinon, sélectionnez simplement la section adjacente créée précédemment et ajustez la profondeur en z de la même manière.Vérifiez que la nouvelle section correspondante est sélectionnée dans le gestionnaire de sections en cliquant sur la section actuelle. Ensuite, après avoir augmenté le grossissement à 40x ou 60x, sélectionnez la dendrite à l’aide de la flèche. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’extrémité de la dendrite de la section précédente et choisissez ajouter à la fin dans le menu déroulant.Une invite demandera si la suite se trouve dans une nouvelle section. Cliquez sur oui. Ensuite, tracez la suite du dendrite à l’aide de la souris comme outil de dessin.Prenez des images des extrémités en vue de leur alignement avec la section suivante. Ensuite, ajoutez des prolongements aux tracés dendritiques jusqu'à ce que trois sections au moins aient été tracées pour le neurone, ou jusqu'à ce que les dendrites ne puissent plus être suivies ou retrouvées. À l'aide d'un programme d'extraction associé au système de reconstruction neuronale, ouvrez un fichier de reconstruction terminé.Dans le menu déroulant modifier, sélectionnez sélectionner tous les objets. Sélectionnez l'analyse de la structure des branches dans la barre d'outils d'analyse située en haut, puis cliquez sur chaque onglet et choisissez les options d'analyse souhaitées dans chacun d'eux. Extrayez toutes les données souhaitées en cliquant sur le bouton OK dans la fenêtre d'analyse et enregistrez-les dans un format de feuille de calcul en cliquant avec le bouton droit sur les fenêtres de sortie et en sélectionnant exporter vers Excel pour une analyse ultérieure.Cette photographie montre une section coronaire unique à travers le GLNd d'un animal. La coloration à la cytochrome oxydase est utilisée pour visualiser les couches du GLN. Et la coloration GFP marque le site d'injection du virus.La flèche indique les régions de neurones denses du noyau réticulé thalamique marqués de façon rétrograde. L'orientation de la coupe suit le compas dorso-ventro-médio-latéral illustré. La barre d'échelle est représentée dans le coin inférieur gauche.Cette image montre les contours du GLN en rouge et du NRT en brun foncé pour toutes les sections contenant une injection de virus, comme l'indiquent les contours noirs. Les étoiles jaunes indiquent les centres des sites d'injection. Cette image montre la reconstruction 3D des contours et du site d'injection.Il s'agit d'une carte des emplacements des neurones du NRT reconstruits, colorés selon leur attribution en grappes, à l'intérieur d'un contour agrégé du NRT représenté en brun rougeâtre. L'échelle représente 500 microns. Cette image montre les contours agrégés du NRT en noir et du GLN en gris, avec cinq neurones du NRT reconstruits colorés du chaud au froid selon leur position médio-latérale au sein du NRT.La barre d'échelle représente 500 microns. Ces photographies montrent le détail des cinq mêmes neurones du noyau réticulé thalamique (TRN) avec des barres d'échelle colorées correspondantes représentant 100 microns. Cet arbre dendrogramme hiérarchique illustre les distances de liaison entre 160 neurones TRN reconstruits, basées sur 10 métriques morphologiques indépendantes, et présente les résultats globaux de l'analyse de regroupement. Trois groupes distincts de neurones TRN sont illustrés en bleu, vert et rouge. Une fois maîtrisées, ces techniques de reconstruction neuronale permettent de reconstruire complètement un seul neurone en une à deux heures. Il est important de surveiller et d'ajuster constamment la profondeur en z lors de la reconstruction des neurones.Le protocole décrit ici constitue une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles d'analyse neuroanatomique, souvent plus biaisées, et permet aux chercheurs d'explorer de nouvelles sous-classes de neurones à partir de données morphologiques à grande échelle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reconstruire des neurones à partir de coupes tissulaires adjacentes et extraire des données morphologiques pour des analyses ultérieures.

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Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Ici, nous fournissons un workflow qui permet l’identification des cellules saines et pathologiques, basé sur leur forme en 3-dimensions. Les auteurs décrivent le processus d’utilisation des lignes de projection 2D basés sur les surfaces 3D pour former une carte Self-Organizing qui fournira l’objective de regroupement des populations cellulaires étudiés.

Distinction fondée sur la morphologie entre sain et pathologique des cellules utilisant des transformations de Fourier et Self-Organizing Maps

Le protocole décrit ici décrit immunofluorescence analyse, récupération de la biocytine et reconstitutions de haute qualité d’hippocampe CA2 interneurones suivant le permettant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vitro, neuronale caractérisation et finalement fine anatomie neuronale à étudier.

Récupération de la biocytine et Reconstructions 3D des interneurones CA2 hippocampe rempli

Le pipeline décrit est conçu pour la segmentation des ensembles de données de microscopie électronique plus grands que les gigaoctets, afin d'extraire des morphologies de cellules entières. Une fois que les cellules sont reconstruites en 3D, un logiciel personnalisé conçu autour de besoins individuels peut être utilisé pour effectuer une analyse qualitative et quantitative directement en 3D, en utilisant également la réalité virtuelle pour surmonter l'occlusion de vue.

Une méthode pour la reconstruction 3D et l'analyse de la réalité virtuelle des cellules gliales et neuronales

Présenté est un outil de calcul qui permet une mesure automatique simple et directe des orientations des branches dendritiques neuronales à partir d’images de fluorescence 2D.

Identification automatique des branches dendritiques et de leur orientation

Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.

Une méthode de nettoyage des tissus pour l’imagerie neuronale des échelles mésoscopiques aux échelles microscopiques

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Les tests de croissance des neurites fournissent une valeur quantitative sur les processus neuronaux régénératifs. L’avantage de ce logiciel semi-automatique est qu’il segmente les corps cellulaires et les neurites séparément en créant un masque et mesure divers paramètres tels que la longueur des neurites, le nombre de points de branchement, la surface des grappes de corps cellulaires et le nombre de grappes de cellules.

Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites 

Découvrez la reconstruction morphologique de neurones marqués par virus rabique modifié pour la neuroanatomie. Cette méthode utilise des analyses de regroupement impartiales pour classifier précisément les sous-classes neuronales distinctes.

Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives (Vidéo) | JoVE Journal

Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

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