Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives
15 février 2017
Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l'infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.
Les objectifs de ce protocole sont de décrire les étapes permettant de reconstruire la morphologie des neurones marqués par un virus et de réaliser des analyses de regroupement indépendantes et impartiales sur des populations de neurones marqués, afin de permettre une caractérisation complète des paramètres morphologiques au sein de sous-classes neuronales distinctes. Nous présentons une approche novatrice pour recueillir et analyser des données neuroanatomiques, facilitant un échantillonnage plus exhaustif et une classification impartiale de types neuronaux morphologiquement distincts au sein d'une population neuronale sélective. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre une analyse à grande échelle de la morphologie neuronale et à utiliser des méthodes non biaisées pour classifier des sous-classes neuronales distinctes.
Les aspects les plus difficiles des reconstructions morphologiques consistent à sélectionner des neurones bien isolés à reconstruire, à attribuer la bonne profondeur en z et à aligner les arborisations afin de poursuivre les reconstructions à travers des sections de tissu adjacentes. Commencez une reconstruction en choisissant une lame portant une section de tissu cérébral de 50 microns colorée, provenant d'un primate injecté stéréotaxiquement avec un virus de la rage modifié exprimant EGFP. Placez la lame dans le porte-lame du microscope et focalisez sur une section d'intérêt unique à l'aide d'un objectif de faible grossissement.
Veillez à ce que l'image de la caméra soit visible dans l'image en direct en positionnant correctement l'obturateur de la caméra. Choisissez un neurone marqué raisonnablement isolé au sein de la structure cérébrale d'intérêt afin de permettre une reconstruction sans ambiguïté de l'arborisation dendritique. Passez à un grossissement de 10x et mettez la zone au point.
Privilégiez les neurones dont le corps cellulaire se trouve entièrement dans une seule section afin d'estimer précisément sa surface et son arrondi. Une fois qu'un neurone bien coloré et bien isolé a été choisi, cliquez sur le bouton « nouvelle section » dans le logiciel pour ajouter la section d'origine contenant le corps cellulaire au gestionnaire de sections. Saisissez le nombre de sections à inclure dans la reconstruction.
Il est recommandé d'insérer deux à trois sections pour commencer. Attribuez une épaisseur de section de 50 microns. Sélectionnez l'objectif 2 x, puis cliquez sur le bouton de contour dans la barre d'outils supérieure et choisissez le type de contour dans le menu déroulant.
Tracer le contour de la structure cible en utilisant la souris pour cliquer sur des points le long du contour. Une fois le tracé du contour terminé, cliquer avec le bouton droit de la souris et sélectionner « fermer le contour » dans le menu pour refermer le contour. Ensuite, avec la vue toujours à deux x, cliquer sur le symbole de marqueur souhaité dans la barre d'outils située à gauche.
Ensuite, cliquez au centre de la structure cible pour placer le marqueur. Une fois les contours terminés, sélectionnez l'objectif 40x ou 60x pour tracer le contour du corps cellulaire. Puis, sélectionnez le bouton de traçage du neurone dans la barre d'outils supérieure et choisissez la structure du neurone à tracer, dans ce cas le corps cellulaire, dans le menu déroulant.
Tracer le corps cellulaire en cliquant sur des points autour de l'extension maximale du corps cellulaire, en ajustant la profondeur en z selon les besoins pour mettre le corps cellulaire au point. Puis faire un clic droit de la souris pour terminer le contour du corps cellulaire. Ensuite, placer un marqueur d'un style différent au centre du contour du corps cellulaire, en veillant à ce que le marqueur soit approximativement au centre en profondeur en z.
Il est essentiel de définir la profondeur z correcte dans la section initiale, ainsi que dans les sections adjacentes, avant de commencer chaque traçage, afin que les valeurs de l'axe z soient précises. Pour commencer le traçage des arbres dendritiques, sélectionnez « dendrite » dans le menu déroulant supérieur.
Ensuite, tracez chaque dendrite en partant du corps cellulaire. Lorsqu'une dendrite se divise, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez nœud bifurqué ou nœud trifurqué pour placer un nœud à ce point de branchement. Veillez à ajuster la profondeur en z tout au long du tracé afin de capturer précisément l'angle et la direction de la dendrite.
À l'extrémité du dendrite dans cette section, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez « ending » dans le menu déroulant. Lorsque tous les arbres dendritiques ont été tracés dans la section d'origine, identifiez les extrémités dendritiques qui devraient probablement se prolonger dans la section adjacente. Mettez ensuite ces structures au point à la profondeur z appropriée sur l'image microscopique en 20x.
Inclure des points de repère majeurs à proximité, tels que des vaisseaux sanguins ou des motifs ou faisceaux de dendrites facilement reconnaissables sur l'image au microscope. Ensuite, prendre une photo de l'image en direct à l'aide d'un appareil photo numérique tenu à la main devant l'écran de l'ordinateur. Puis changer l'objectif du microscope pour un grossissement de deux x et passer à la section adjacente sur la lame.
Ensuite, alignez les contours de la section précédemment tracée dans la vue logicielle avec les limites du GLN et du NRT dans la nouvelle section. Revenez à un grossissement de 20x et effectuez l'alignement à l'aide de repères anatomiques. Puis, à l'aide de la photo des terminaisons dendritiques provenant de la section précédemment tracée, déplacez le tracé afin d'aligner les dendrites, en commençant par utiliser l'outil fléché pour sélectionner la reconstruction.
Ensuite, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez déplacer dans le menu déroulant, puis déplacez le calque en conséquence. Pour faire pivoter le calque, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez faire pivoter dans le menu déroulant, puis faites pivoter le calque en conséquence. Sinon, sélectionnez l'outil d'ajustement dans le menu déroulant des outils situés en haut et choisissez le nombre de points à ajuster.
Ensuite, cliquez sur l'extrémité dans la reconstruction et sur le point de poursuite correspondant dans l'image en direct pour associer les extrémités dendritiques à leurs débuts. Une fois que le tracé de la section précédente est aligné avec les dendrites de la nouvelle section, ajoutez une nouvelle section au gestionnaire de sections comme précédemment. Sinon, sélectionnez simplement la section adjacente créée précédemment et ajustez la profondeur en z de la même manière.
Vérifiez que la nouvelle section correspondante est sélectionnée dans le gestionnaire de sections en cliquant sur la section actuelle. Ensuite, après avoir augmenté le grossissement à 40x ou 60x, sélectionnez la dendrite à l’aide de la flèche. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’extrémité de la dendrite de la section précédente et choisissez ajouter à la fin dans le menu déroulant.
Une invite demandera si la suite se trouve dans une nouvelle section. Cliquez sur oui. Ensuite, tracez la suite du dendrite à l’aide de la souris comme outil de dessin.
Prenez des images des extrémités en vue de leur alignement avec la section suivante. Ensuite, ajoutez des prolongements aux tracés dendritiques jusqu'à ce que trois sections au moins aient été tracées pour le neurone, ou jusqu'à ce que les dendrites ne puissent plus être suivies ou retrouvées. À l'aide d'un programme d'extraction associé au système de reconstruction neuronale, ouvrez un fichier de reconstruction terminé.
Dans le menu déroulant modifier, sélectionnez sélectionner tous les objets. Sélectionnez l'analyse de la structure des branches dans la barre d'outils d'analyse située en haut, puis cliquez sur chaque onglet et choisissez les options d'analyse souhaitées dans chacun d'eux. Extrayez toutes les données souhaitées en cliquant sur le bouton OK dans la fenêtre d'analyse et enregistrez-les dans un format de feuille de calcul en cliquant avec le bouton droit sur les fenêtres de sortie et en sélectionnant exporter vers Excel pour une analyse ultérieure.
Cette photographie montre une section coronaire unique à travers le GLNd d'un animal. La coloration à la cytochrome oxydase est utilisée pour visualiser les couches du GLN. Et la coloration GFP marque le site d'injection du virus.
La flèche indique les régions de neurones denses du noyau réticulé thalamique marqués de façon rétrograde. L'orientation de la coupe suit le compas dorso-ventro-médio-latéral illustré. La barre d'échelle est représentée dans le coin inférieur gauche.
Cette image montre les contours du GLN en rouge et du NRT en brun foncé pour toutes les sections contenant une injection de virus, comme l'indiquent les contours noirs. Les étoiles jaunes indiquent les centres des sites d'injection. Cette image montre la reconstruction 3D des contours et du site d'injection.
Il s'agit d'une carte des emplacements des neurones du NRT reconstruits, colorés selon leur attribution en grappes, à l'intérieur d'un contour agrégé du NRT représenté en brun rougeâtre. L'échelle représente 500 microns. Cette image montre les contours agrégés du NRT en noir et du GLN en gris, avec cinq neurones du NRT reconstruits colorés du chaud au froid selon leur position médio-latérale au sein du NRT.
La barre d'échelle représente 500 microns. Ces photographies montrent le détail des cinq mêmes neurones du noyau réticulé thalamique (TRN) avec des barres d'échelle colorées correspondantes représentant 100 microns. Cet arbre dendrogramme hiérarchique illustre les distances de liaison entre 160 neurones TRN reconstruits, basées sur 10 métriques morphologiques indépendantes, et présente les résultats globaux de l'analyse de regroupement.
Trois groupes distincts de neurones TRN sont illustrés en bleu, vert et rouge. Une fois maîtrisées, ces techniques de reconstruction neuronale permettent de reconstruire complètement un seul neurone en une à deux heures. Il est important de surveiller et d'ajuster constamment la profondeur en z lors de la reconstruction des neurones.
Le protocole décrit ici constitue une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles d'analyse neuroanatomique, souvent plus biaisées, et permet aux chercheurs d'explorer de nouvelles sous-classes de neurones à partir de données morphologiques à grande échelle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reconstruire des neurones à partir de coupes tissulaires adjacentes et extraire des données morphologiques pour des analyses ultérieures.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode permettant de reconstruire la morphologie de neurones marqués par infection rétrograde à l’aide d’un virus de la rage modifié. Il met l’accent sur des analyses de regroupement impartiales afin de caractériser des sous-classes neuronales distinctes selon des paramètres morphologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neuroanatomie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La compréhension de la morphologie neuronale est essentielle pour classifier les types de neurones.
- Les méthodes traditionnelles peuvent introduire un biais dans l'analyse morphologique.
- Le virus de la rage modifié peut marquer efficacement des populations neuronales spécifiques.
- Les analyses de regroupement impartiales améliorent la caractérisation des sous-classes neuronales.
Objectif de l'étude
- Reconstruire la morphologie des neurones marqués par le virus.
- Effectuer des analyses de regroupement sans biais sur les populations de neurones marqués.
- Faciliter la caractérisation complète de sous-classes neuronales distinctes.
Méthodes utilisées
- Sélection de neurones bien isolés pour la reconstruction.
- Attribution d'une profondeur z appropriée pour une représentation morphologique précise.
- Alignement des arborisations entre les sections de tissu adjacentes.
- Utilisation d'un microscope pour focaliser sur des sections de tissu cérébral colorées.
Résultats principaux
- Analyse à grande échelle réussie de la morphologie neuronale.
- Identification de types neuronaux morphologiquement uniques.
- Classification impartiale de sous-classes neuronales distinctes.
- Compréhension améliorée de la collecte et de l'analyse des données neuroanatomiques.
Conclusions
- Le protocole fournit un cadre solide pour la reconstruction de la morphologie neuronale.
- Les méthodes impartiales améliorent la précision de la classification des sous-classes neuronales.
- Cette approche peut faciliter les études neuroanatomiques futures.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une classification morphologique à grande échelle et sans biais des populations neuronales, facilitant la validation de cibles en découverte pharmaceutique en neurosciences en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans l'identification des sous-types neuronaux. L'approche renforce la confiance prédictive dans les modèles précliniques en fournissant des métriques quantitatives et reproductibles permettant de réduire les risques associés aux hypothèses sur les cibles liées à la fonction des circuits neuronaux. Elle établit le phénotypage morphologique comme un outil évolutif applicable en phase de découverte, permettant de hiérarchiser les cibles présentant une forte continuité translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une classification impartiale des sous-classes neuronales fondée sur des paramètres morphologiques.
- Valeur opérationnelle : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en établissant des critères quantitatifs permettant de distinguer des populations neuronales fonctionnellement distinctes.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en associant l'unicité morphologique à une réponse potentielle différentielle aux médicaments au sein de populations neuronales sélectives.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes neuronaux validés pour le développement d'essais en aval en définissant des sous-classes morphologiquement distinctes afin d'obtenir des modèles cellulaires cohérents.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la standardisation et à la reproductibilité des essais grâce à l'extraction de données morphologiques quantitatives adaptées aux plates-formes de criblage à haut contenu.
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plate-forme sur différentes populations neuronales en établissant un flux de travail transférable pour la reconstruction et le regroupement à grande échelle.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la modélisation de systèmes pertinents pour les maladies en permettant la classification des types de neurones dans les régions cérébrales de primates associées aux cibles des troubles neuropsychiatriques.
- Alignement préclinique : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des biomarqueurs morphologiques corrélés à l'activation de voies spécifiques aux sous-types neuronaux.
- Dérisquage mécanistique : Réduit le risque biologique en phase avancée en validant la sélectivité de la cible grâce à un profilage morphologique complet des populations neuronales hors cible.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre au continuum de découverte, depuis les premiers tests d'hypothèses sur des cibles jusqu'à l'identification de composés actifs, où la classification morphologique oriente le criblage de composés dans des systèmes neuronaux pertinents pour la maladie.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en permettant l'identification sans a priori de sous-classes neuronales pouvant moduler différemment les circuits pertinents pour la maladie.
- Écrans de sélection : Améliore la préparation des tests en fournissant des données morphologiques quantitatives qui garantissent la cohérence des modèles neuronaux utilisés pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Fournit une analyse statistique par regroupement et des métriques morphologiques permettant la comparaison des populations neuronales entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la validation préclinique par le biais d'un profil morphologique dans des systèmes neuronaux de primates ayant une pertinence pour les cibles cérébrales humaines.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité de profilage neuroanatomique réutilisable, applicable à plusieurs populations neuronales et régions cérébrales pour la validation de cibles à l'échelle du portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la classification des sous-types neuronaux.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la génération de données morphologiques entre laboratoires et études.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller ou de ne pas aller en permettant l'élimination précoce des risques associés aux cibles en fonction de leur spécificité aux sous-classes neuronales, réduisant ainsi le risque d'échec biologique en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation des décisions d'avancement ajustée au risque grâce à une classification morphologique objective des populations neuronales dans les modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en traçage neuroanatomique, en microscopie confocale et en logiciels de reconstruction 3D pour une acquisition précise de la morphologie neuronale.
- Dépend d'une infrastructure microscopique capable de réaliser des coupes en z et de l'imagerie fluorescente de sections tissulaires épaisses, ainsi que d'outils informatiques pour l'extraction morphologique et l'analyse de regroupement.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de traçage et des définitions des métriques morphologiques afin d'assurer la reproductibilité entre les différents sites et opérateurs.
- Suppose des adaptations lors de l'application de la méthode à différentes populations neuronales, régions cérébrales ou espèces, en raison des variations de la morphologie et de l'efficacité du marquage.
- Les limites pratiques incluent le caractère long du traçage manuel ainsi que la dépendance à un marquage viral de haute qualité et à une préservation tissulaire optimale pour des reconstructions fiables.
